Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per

Gli obiettivi generali di questo procedimento sono isolare e coltivare cellule primarie murine endometriali, stromali ed epiteliali per la loro co-coltura allo scopo di studiare la decidualizzazione in vitro. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della medicina riproduttiva, come ad esempio quale sia la segnalazione paracrina tra cellule epiteliali e stromali durante processi importanti come la decidualizzazione e l'invasione dei trofoblasti, e come tale via di segnalazione venga regolata. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare il processo di decidualizzazione in un sistema di co-coltura epiteliale e stromale.

Utilizzando questo sistema, è possibile valutare se le molecole di segnalazione secreti da una delle due cellule possano influenzare questo processo. Prima del prelievo dell'utero, eseguire un'esame dello striscio vaginale per verificare le fasi del ciclo degli animali. Selezionare solo i topi nella fase di estro.

Come caratterizzato dalla presenza di cellule epiteliali corneali nel lavaggio vaginale. Successivamente, utilizzare pinze e forbici per aprire l'addome dell'animale al primo estro e spostare lateralmente gli intestini per visualizzare entrambe le corna uterine. Afferrando una delle corna all'estremità più distale, sotto la tuba di Falloppio, dissezionare il tessuto uterino dalla tuba di Falloppio utilizzando pinze da dissezione e pinze di Dumont numero cinque per rimuovere i tessuti adiposi e connettivi.

Quindi, rimuovere il corno all'estremità distale, al di sopra del corpo uterino. Dopo aver rimosso i corni uterini, posizionarli in una piastra di Petri da 35 millimetri contenente tre millilitri di HBSS. Una volta raccolti tutti i corni uterini, trasferire la piastra sotto un microscopio stereoscopico e utilizzare pinze per rimuovere eventuali tessuti adiposi e connettivi residui.

Quindi, utilizzando pinzette Dumont numero cinque, pinzette da dissezione e piccole forbici a molla, aprire longitudinalmente le corna uterine per esporne i lumi e risciacquare i tessuti in una nuova piastra di Petri contenente HBSS fresco. Ora, trasferire tutte le corna in un tubo da 15 millilitri contenente pancreatina e tripsina. E incubare i tessuti in posizione orizzontale per 60 minuti a quattro gradi Celsius e 50 rpm su un agitatore orbitale.

Trascorso l'intervallo di un'ora, trasferire il tubo sul banco per un'incubazione orizzontale di 45 minuti senza agitazione, seguita da un'incubazione orizzontale di 15 minuti senza agitazione in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione nel bagno d'acqua, decantare con attenzione il sopranatante e trasferire gli uteri in una piastra di Petri contenente mezzo freddo per cellule epiteliali endometriali di topo per cinque minuti al fine di inattivare l'attività della tripsina. Successivamente, trasferire i tessuti in un tubo da 15 millilitri contenente tre millilitri di HBSS freddo e vortexare i tessuti per 10 secondi per rilasciare i foglietti epiteliali.

Quindi, risciacquare gli uteri in una nuova piastra di Petri contenente tre millilitri di HBSS fresco e raccogliere altre due sospensioni di foglietti epiteliali in due nuove provette da 15 millilitri come appena dimostrato. Dopo il terzo vorticoso del tessuto, trasferire gli uteri in una provetta conica da 15 millilitri contenente la miscela di digestione per cellule stromali endometriali di topo per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e 200 rpm. Recuperare i foglietti epiteliali pipettando delicatamente le tre sospensioni cellulari attraverso un filtro in nylon da 100 micron per rimuovere i detriti tessutali, seguito dalla centrifugazione della sospensione cellulare risultante.

Risospendere il pellet in 12 millilitri di mezzo per cellule epiteliali endometriali di topo, mescolando accuratamente, quindi lasciare sedimentare la soluzione per cinque minuti per separare le restanti cellule stromali endometriali di topo per gravità. Al termine della sedimentazione, rimuovere con una pipetta da cinque millilitri i due millilitri superiori del soprannatante, quindi centrifugare le cellule raccolte. Successivamente, risospendere delicatamente il pellet epiteliale di topo nel mezzo epiteliale mediante pipettaggio delicato.

E piastrare le cellule su coprioggetti rivestiti di collagene alla densità appropriata per l'analisi successiva prevista. Dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, procedere con le cellule stromali e rimuovere il tubo di digestione delle cellule stromali di topo con l'utero dall'incubatore. Dopo un'incubazione di 30 minuti, come appena dimostrato, agitare delicatamente il tubo a mano per 10 secondi e trasferire gli uteri in una piastra di Petri contenente tre millilitri di HBSS a quattro gradi Celsius.

Risciacquare bene i tessuti, quindi aggiungere tre millilitri di mezzo per cellule stromali al tubo di digestione per inattivare l'attività della tripsina e trasferire l'utero in un tubo conico da 15 millilitri contenente tre millilitri di mezzo fresco per cellule stromali endometriali di topo. Agitare delicatamente il tubo con il tessuto per 10 secondi. Successivamente, trasferire l'utero in una piastra contenente HBSS freddo, seguito dal trasferimento in un nuovo tubo da 15 millilitri contenente mezzo per cellule stromali.

Dopo un terzo risciacquo del tessuto e il trasferimento, incubare i tessuti uterini in una soluzione fresca di digestione per cellule stromali endometriali di topo per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione, far passare le sospensioni cellulari dal tubo uno al tre e dal tubo di tripsina attraverso un filtro in nylon da 40 micron e risciacquare il filtro con ulteriori cinque millilitri di mezzo per cellule stromali endometriali di topo. Successivamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

E risospendere il pellet in fresco mezzo per cellule stromali endometriali di topo per la semina su cover slip rivestiti con polilisina alla densità appropriata per l'analisi successiva prevista. La purezza delle colture cellulari primarie può essere valutata in base alle differenze nell'espressione di vimentina e citocheratina, poiché i livelli di vimentina sono elevati nelle cellule stromali endometriali di topo e bassi nelle cellule epiteliali endometriali di topo, mentre i livelli di citocheratina sono elevati nelle cellule epiteliali endometriali di topo e bassi nelle cellule stromali endometriali di topo.

La doppia colorazione per mentina/citocheratina illustra ulteriormente l'espressione della mentina da parte delle cellule stromali, nonché l'espressione esclusiva della citocheratina da parte delle cellule epiteliali. L'induzione della decidualizzazione nelle colture cellulari stromali mediante l'applicazione di adenosina monofosfato ciclico e MPA rivela che i livelli di mRNA di prolattina aumentano notevolmente dopo cinque giorni di trattamento rispetto alle colture di controllo di cellule stromali. Poiché le cellule epiteliali sono difficili da visualizzare negli inserti laterali per colture cellulari, è possibile eseguire un saggio di vitalità immediatamente dopo una simulazione di decidualizzazione di cinque giorni, con un cambio di colore da blu a rosa brillante che indica la presenza di cellule epiteliali vitali.

Utilizzando questa tecnica, è possibile eseguire altri metodi, come saggi di adesione della blastocisti, per valutare se i fattori secreti dalle cellule epiteliali in presenza di una blastocisti possano indurre la decidualizzazione delle cellule stromali.