Isolamento di mouse endometriale epiteliali e stromali cellule per In Vitro decidualizzazione

Gli obiettivi generali di questa procedura sono l'isolamento e la coltura di cellule endometriali, stromali ed epiteliali primarie di topo per la loro co-coltura per lo studio della decidualizzazione in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina riproduttiva, come ad esempio qual è la segnalazione paracrina tra cellule epiteliali e stromali durante processi importanti come la decidualizzazione e l'invasione del trofoblasto, e come viene regolata questa via di segnalazione. Queste tecniche possono essere utilizzate per studiare il processo di decidualizzazione in un sistema di co-coltura epiteliale e stromale.

Utilizzando questo sistema, è possibile valutare se le molecole di segnalazione secrete da una delle due cellule possono influenzare questo processo. Prima di prelevare l'utero, eseguire un esame dello striscio vaginale per verificare le fasi del ciclo degli animali. Per selezionare solo i topi in fase di estro.

Come caratterizzato dalla presenza di cellule epiteliali corneali nella lavanda vaginale. Successivamente, usa pinze e forbici per aprire l'addome del primo animale in estro e riflettere l'intestino di lato per visualizzare entrambe le corna uterine. Afferrando un corno all'estremità più distale, sotto le tube di Falloppio, sezionare il tessuto uterino dalle tube di Falloppio usando una pinza da dissezione e una pinza di Dumont numero cinque per rimuovere i tessuti adiposi e connettivi.

Quindi, rimuovere il corno all'estremità distale, sopra il corpo uterino. Dopo aver rimosso le corna uterine, metterle in una capsula di Petri da 35 millimetri con tre millilitri di HBSS. Quando tutte le corna uterine sono state raccolte, trasferire la piastra sotto uno stereomicroscopio e utilizzare una pinza per rimuovere eventuali residui di tessuto adiposo e connettivo.

Quindi, utilizzando una pinza Dumont numero cinque, una pinza da dissezione e piccole forbici a molla, aprire le corna uterine longitudinalmente per esporre i loro lumi e sciacquare i tessuti in una nuova capsula di Petri contenente HBSS fresco. Ora, trasferisci tutte le corna in una provetta da 15 millilitri contenente pancreatina e tripsina. E incubare i tessuti orizzontalmente per 60 minuti a quattro gradi Celsius e 50 giri/min su uno shaker orbitale.

Alla fine dell'ora, trasferire la provetta sul banco per un'incubazione orizzontale di 45 minuti senza agitare, seguita da un'incubazione orizzontale di 15 minuti senza agitare in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Al termine dell'incubazione a bagnomaria, decantare accuratamente il surnatante e trasferire l'utero in una capsula di Petri contenente terreno freddo di cellule epiteliali endometriali di topo per cinque minuti per inattivare l'attività della tripsina. Successivamente, trasferire i tessuti in una provetta da 15 millilitri contenente tre millilitri di HBSS freddo e agitare i tessuti per 10 secondi per rilasciare i fogli epiteliali.

Quindi, sciacquare l'utero in una nuova capsula di Petri contenente tre millilitri di HBSS fresco e raccogliere altre due sospensioni di fogli epiteliali in due nuove provette da 15 millilitri, come appena dimostrato. Dopo il terzo vortice tissutale, trasferire l'utero in una provetta conica da 15 millilitri contenente una miscela per la digestione delle cellule stromali endometriali di topo per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius e 200 giri/min. Recuperare i fogli epiteliali pipettando delicatamente le tre sospensioni cellulari attraverso una rete di nylon da 100 micron per rimuovere i detriti tissutali, seguito dalla centrifugazione della sospensione delle cellule risultanti.

Risospendere il pellet in 12 millilitri di terreno di cellule epiteliali endometriali di topo con un'accurata miscelazione, quindi lasciare che la soluzione si depositi per cinque minuti per separare la cellula stromale endometriale di topo rimanente per gravità. Al termine della sedimentazione, utilizzare una pipetta da cinque millilitri per rimuovere con cura i due millilitri superiori del surnatante e centrifugare le cellule raccolte. Quindi, risospendere il pellet epiteliale di topo in mezzo epiteliale con pipettaggio delicato.

E placcare le cellule su vetrini coprioggetti rivestiti di collagene alla densità appropriata per l'analisi pianificata a valle. Dopo l'isolamento delle cellule epiteliali, continuare con le cellule stromali e rimuovere la provetta per la digestione delle cellule stromali di topo con l'utero dall'incubatrice. Dopo 30 minuti di incubazione, come appena dimostrato, agitare delicatamente la provetta a mano per 10 secondi e trasferire l'utero in una capsula di Petri contenente tre millilitri di HBSS a quattro gradi Celsisus.

Sciacquare bene i tessuti, quindi aggiungere tre millilitri di terreno di coltura stromale al tubo di digestione per inattivare l'attività della tripsina e trasferire l'utero in un tubo conico da 15 millilitri contenente tre millilitri di terreno di cellule stromali endometriali di topo fresco. Agitare delicatamente il tubo di tessuto per 10 secondi. Quindi, trasferire gli uteri in una piastra di HBSS freddo, seguito dal loro trasferimento in una nuova provetta da 15 millilitri di terreno di cellule stromali.

Dopo un terzo risciacquo e trasferimento dei tessuti, incubare i tessuti uterini in una miscela di digestione di cellule stromali endometriali di topo fresche per un'incubazione di 30 minuti a 37 gradi Celsius. Al termine della digestione, passare le sospensioni cellulari dal tubo uno al tubo tre e il tubo di tripsina attraverso una rete di nylon da 40 micron e sciacquare la rete con altri cinque millilitri di terreno di cellule stromali endometriali di topo. Quindi, raccogliere le cellule mediante centrifugazione.

E risospendere il pellet in un terreno di cellule stromali endometriali di topo fresco per la placcatura su vetrini coprioggetti rivestiti di polilisina alla densità appropriata per l'analisi pianificata a valle. La purezza delle colture cellulari primarie può essere valutata dalle differenze nell'espressione di vimentina e citocheratina, poiché i livelli di vimentina sono alti nelle cellule stromali endometriali di topo e bassi nelle cellule epiteliali endometriali di topo. Mentre i livelli di citocheratina sono alti nelle cellule epiteliali endometriali di topo e bassi nelle cellule stromali endometriali di topo.

La doppia colorazione mentina/citocheratina illustra ulteriormente l'espressione della mentina da parte delle cellule stromali, così come l'espressione esclusiva della citocaratina da parte delle cellule epiteliali. L'induzione della decidualizzazione nelle colture di cellule stromali mediante l'applicazione di adenosina monofosfato ciclico e MPA, rivela che i livelli di prolattina MRNA sono notevolmente aumentati dopo cinque giorni di trattamento rispetto alle colture di cellule stromali di controllo. Poiché le cellule epiteliali sono difficili da visualizzare negli inserti di coltura cellulare laterale, è stato possibile eseguire un test di vitalità immediatamente dopo una simulazione di decidualizzazione di cinque giorni, con un cambiamento di colore dal blu al rosa brillante che indica la presenza di cellule epiteliali vitali.

Seguendo questa tecnica, possono essere eseguiti altri metodi, come i saggi di adesione della blastocisti, al fine di valutare se i fattori secreti dalle cellule epiteliali in presenza di una blastocisti possono indurre la decidualizzazione delle cellule stromali.