Name: Sistemi di ingegneria tissutale 3D per approcci rigenerativi, scoperta di farmaci e screening di tossicità - PUBBLICITÀ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Scopri i limiti delle colture cellulari 2D tradizionali e l'importanza dei modelli in vitro più fisiologici per l'ingegneria tissutale e la biologia cellulare.

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Sistemi di cultura 3D
A. 3D Colture che utilizzano idrogel e scaffold
Gli idrogel sono costituiti da reti di catene polimeriche reticolate o molecole complesse di proteine o polisaccaridi di origine naturale o sintetica. Grazie al loro significativo contenuto d'acqua e alla gamma di proprietà meccaniche regolabili, gli idrogel possiedono caratteristiche biofisiche simili ai tessuti naturali e fungono da matrici altamente efficaci per la coltura cellulare 3D. Gli idrogel possono essere utilizzati come matrici 3D autonome, come rivestimento o come metodo di incapsulamento delle cellule da combinare con altre tecnologie, come scaffold solidi, supporti permeabili, microarray cellulari, stampa 3D o dispositivi microfluidici. La morfologia, la crescita e la funzionalità delle cellule all'interno dell'idrogel dipendono dalla presentazione di segnali biofisici e biochimici, nonché da proprietà fisiche come la permeabilità e la rigidità della matrice.
Idrogel naturali e matrici extracellulari (ECM)
Gli idrogel di derivazione naturale per la coltura cellulare sono tipicamente formati da proteine, polisaccaridi e componenti della ECM come collagene, laminina, fibrina, acido ialuronico, chitosano o Matrigelä (un estratto di membrana basale ricostituito da tumori di topo di Engelbreth-Holm-Swarm contenente una miscela di laminina, collagene IV, proteoglicano eparina solfato e nidogen/entattina19, Figura 1). I gel derivati da fonti naturali sono intrinsecamente biocompatibili e bioattivi20. Promuovono anche molte funzioni cellulari grazie alla presenza di vari fattori endogeni, che possono essere vantaggiosi per sostenere la vitalità, la proliferazione, la funzione e lo sviluppo di molti tipi di cellule21.
Tuttavia, gli idrogel naturali presentano alcuni svantaggi, tra cui il loro isolamento da fonti di origine animale e la variabilità intrinseca da lotto a lotto nella composizione. Inoltre, contengono componenti bioattivi endogeni come i fattori di crescita che possono essere vantaggiosi per la creazione di alcuni modelli 3D, ma in altri casi possono confondere il comportamento o la risposta cellulare specifica che è oggetto di indagine. Ad esempio, Matrigel attiva percorsi che controllano l'angiogenesi22,23, la motilità delle cellule tumorali24 e la sensibilità ai farmaci25, mentre il collagene di tipo 1 altera la produzione di metalloproteinasi della matrice (MMP), enzimi che degradano i componenti della ECM e consentono l'invasione delle cellule tumorali26, la sensibilità cellulare ai farmaci antitumorali27, la proliferazione cellulare e la migrazione28,29.
Per aggirare alcuni dei problemi associati ai biomateriali di origine animale, sono state sviluppate matrici in organismi privi di animali o derivati dalla tecnologia degli acidi nucleici ricombinanti. L'acido ialuronico (ialuronano, acido ialuronico) è una matrice di derivazione biologica a base di polisaccaridi sempre più popolare30-32. La maggior parte dell'HA di grado commerciale è di origine batterica e caratterizzato da elevata purezza e qualità omogenea. Questi gel possono essere modificati con l'aggiunta di componenti ECM per migliorare l'attaccamento cellulare e le proprietà di crescita.
Idrogel sintetici e matrici extracellulari
Gli idrogel sintetici sono un'opzione per applicazioni di coltura cellulare 3D quando le matrici biologiche di derivazione naturale non sono adatte. Gli idrogel sintetici sono formati da molecole puramente non naturali33 come il poli(glicole etilenico) (PEG)34, il poli(alcol vinilico)35 e il poli(2-idrossi etilmetacrilato)36. Sono biologicamente inerti, ma forniscono supporto strutturale per vari tipi di cellule. Sono anche altamente riproducibili, consentono una facile messa a punto delle proprietà meccaniche e sono semplici da lavorare e produrre.
Gli idrogel sintetici possono mantenere la vitalità delle cellule incapsulate consentendo la deposizione di ECM mentre l'idrogel si degrada37, dimostrando così che i gel sintetici possono funzionare come piattaforme di coltura cellulare 3D in assenza di ligandi leganti le integrine. Come approccio alternativo, gli idrogel sintetici inerti possono essere modificati con componenti biologici appropriati. Un esempio di idrogel sintetico sintonizzabile è l'idrogel peptidico Corning PuraMatrix™, un oligopeptide sintetico autoassemblante che presenta fibre su scala nanometrica (Figura 2). Gli idrogel sintetici possono essere personalizzati con sequenze peptidiche specifiche per migliorare l'attaccamento cellulare, l'homing cellulare e altri comportamenti38 oppure gli idrogel possono essere integrati con molecole bioattive (ad esempio, fattori di crescita o proteine ECM). Inoltre, dispositivi come i supporti permeabili (ad esempio, gli inserti Transwell®) possono essere incorporati in modelli di coltura 3D con substrati di idrogel per studiare l'interazione tra diversi tipi di cellule, fattori solubili e l'ambiente di coltura.
Scaffold Solidi
Gli scaffold solidi per colture cellulari 3D sono fabbricati con un'ampia gamma di materiali tra cui metallo, ceramica, vetro e polimeri. In particolare, i polimeri sono una scelta comune per la generazione di scaffold solidi di diverse dimensioni, struttura variabile, rigidità, porosità e permeabilità39. Una moltitudine di tecniche di fabbricazione vengono utilizzate per generare scaffold solidi per colture cellulari 3D, tra cui litografia morbida, elettrofilatura, microarray, biostampa e molte altre. I principali svantaggi dell'utilizzo di scaffold solidi sono la portata limitata per l'imaging cellulare e le difficoltà che si incontrano durante il recupero delle cellule dalla matrice.
Una considerazione importante per la progettazione di scaffold per colture cellulari 3D è la scala e la topografia delle strutture interne all'interno dello scaffold. Nel corpo, l'ECM fornisce un'intricata infrastruttura su scala nanometrica per supportare le cellule e presenta uno sfondo istruttivo che governa il loro comportamento40-44. Le cellule che si legano agli scaffold che presentano architetture su microscala di solito si appiattiscono e si allargano come farebbero se coltivate su superfici piane45. Anche minuscole alterazioni a livello di nanoscala nella topografia dell'ambiente cellulare possono suscitare diversi effetti sul comportamento cellulare46. Oltre alla scala e alla struttura, il materiale utilizzato per la costruzione dell'impalcatura, le proprietà chimiche della superficie, la rigidità della matrice, la permeabilità e le forze meccaniche possono influire in modo significativo sull'adesione, la crescita e il comportamento delle cellule47.
B. Sferoidi
Gli sferoidi cellulari sono semplici modelli 3D che possono essere generati da un'ampia gamma di tipi di cellule, che formano sferoidi naturalmente a causa della tendenza delle cellule aderenti ad aggregarsi. Esempi comuni di sferoidi includono corpi embrioidi, mammosfere, sferoidi tumorali, epatosfere e neurosfere. In particolare, le cellule aderenti tendono ad aggregarsi in circostanze che impediscono l'adesione ai substrati della coltura cellulare. I metodi comuni senza matrice impiegati per la generazione di sferoidi includono l'uso di superfici di attacco ultra-basse per la coltura cellulare o il mantenimento delle cellule come colture in sospensione in terreni (ad es. tecnologia a goccia sospesa, colture rotanti e bioreattori). Diversi tipi di cellule formano anche sferoidi negli idrogel 3D e, in misura limitata, in alcuni scaffold solidi a seconda delle proprietà strutturali e meccaniche del materiale. La dimensione complessiva degli sferoidi è limitata a poche centinaia di micrometri, oltre i quali si verifica una necrosi all'interno del nucleo degli sferoidi48.
Quando le cellule si aggregano spontaneamente in sferoidi, imitano naturalmente vari aspetti dei tessuti solidi e sono dotate di gradienti intrinseci per un'efficiente diffusione di ossigeno e sostanze nutritive, nonché per la rimozione dei rifiuti metabolici. Questi aggregati cellulari possono emulare il comportamento dei tumori solidi avascolari in modo più efficace rispetto agli ambienti 2D standard perché gli sferoidi, proprio come i tumori, di solito contengono una popolazione eterogenea di cellule esposte in superficie e sepolte in profondità, cellule proliferanti e non proliferanti e cellule ben ossigenate e ipossiche49. Inoltre, la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti comporta tipicamente la formazione di strutture sferiche chiamate corpi embrioidi, un passo importante per i successivi studi di differenziazione cellulare in vitro. Gli sferoidi rappresentano quindi un modello 3D fisiologico particolarmente buono per lo studio della tumorigenesi solida e della differenziazione delle cellule staminali. Inoltre, gli sferoidi possono essere facilmente analizzati mediante imaging utilizzando microscopie a luce, a fluorescenza e confocali, il che rappresenta un vantaggio rispetto ai modelli di colture cellulari 3D più complessi. Inoltre, è relativamente semplice produrre in serie sferoidi 3D di dimensioni uniformi, il che li rende altamente adatti a molte applicazioni di screening della tossicità e ad alto rendimento (HTP) in vitro.
C. Organoidi
Un altro importante progresso nella differenziazione delle cellule staminali è la formazione di mini "organi" 3D auto-organizzanti noti come organoidi. Gli organoidi possono ricapitolare i dettagli istologici e fornire una rappresentazione funzionale di più tipi di cellule presenti all'interno degli organi nativi. Organoidi rappresentativi dei tessuti50,51 intestinali,52 retinici,53 pancreatici,54 mammari,55 del colon e56 sono stati sviluppati recentemente utilizzando modelli 3D costituiti da Matrigel Matrix. La Figura 3 illustra uno schema delle condizioni di coltura 3D che hanno permesso un'espansione efficiente dei progenitori pancreatici embrionali dissociati di topo53. Un altro esempio è mostrato nella Figura 4, dove Lancaster et al. hanno generato organoidi cerebrali con somiglianza strutturale con il tessuto cerebrale57 . Mentre la coltura in vitro di organoidi è un passo importante verso la chiarezza dei principi dello sviluppo degli organi e dei meccanismi responsabili delle malattie genetiche, la coerenza e la prevedibilità dell'ottenimento delle stesse strutture varia da campione a campione57. Simili agli sferoidi, sono anche limitati nelle dimensioni dallo sviluppo di nuclei necrotici, limitando la loro utilità per gli approcci rigenerativi.
D. Bioreattori a perfusione
Una delle principali sfide della creazione di colture 3D in vitro sono le limitate distanze di trasferimento di massa necessarie per l'apporto e la rimozione dei nutrienti. I bioreattori affrontano questa sfida controllando l'ambiente fisiologico che circonda i costrutti 3D (ad esempio l'apporto di nutrienti, la tensione dell'ossigeno, la rimozione dei rifiuti, gli input meccanici, il pH e la temperatura). I bioreattori sono quindi essenziali quando sono necessari costrutti tissutali più grandi e anche per sostenere i tessuti in vitro per lunghi periodi di tempo, poiché l'aumento del trasporto attraverso la perfusione aiuta a evitare i centri necrotici. In particolare, i bioreattori possono essere utilizzati per sostenere colture a lungo termine in cui è possibile monitorare i cambiamenti dinamici58. Inoltre, i bioreattori controllano le dimensioni e la forma delle colture 3D e promuovono distribuzioni cellulari uniformi59-64. I bioreattori sono disponibili in molti formati diversi, tra cui: bioreattori a perfusione (diretta)65, bioreattori a perfusione a fibra cava (indiretta)66, bioreattori a perfusione con stimolazione meccanica67, bioreattori a recipiente a parete rotante68, palloni rotanti69 e agitatori orbitali70.
E. Altri modi per affrontare il trasferimento di massa limitato
Un'altra soluzione fisiologicamente rilevante per affrontare il trasferimento di massa limitato in costrutti di tessuti di grandi dimensioni è quella di ricreare la vascolarizzazione tissutale (che fornisce e rimuove i nutrienti in vivo) con canali interconnessi e vascolarizzabili 71. Come sostituto artificiale per supportare la crescita cellulare ad alta densità, anche la "pseudovascolarizzazione" attraverso bioreattori a membrana a fibra cava ha mostrato risultati promettenti 66,72-74. Le fibre cave fungono da vasi sanguigni trasferendo il terreno di coltura in tutti i costrutti di ingegneria tissutale, mentre la maggior parte può essere seminata con matrice extracellulare o altri materiali e cellule dell'impalcatura.
I recenti miglioramenti nelle tecniche di ingegneria su microscala, come la fabbricazione di dispositivi microfluidici e microarray, hanno il potenziale per affrontare i problemi di fornitura di nutrienti creando modelli in microscala. I dispositivi microfluidici manipolano piccoli volumi (da 10-9 a 10-6 L) per generare e controllare con precisione il flusso dinamico dei fluidi e i gradienti spazio-temporali, oltre a fornire nutrienti e altri segnali chimici alle cellule in modo controllato75. Le reti microfluidiche sono state incorporate direttamente all'interno di idrogel incorporati nelle cellule, così come in diverse altre matrici, per consentire un efficiente trasporto convettivo di nutrienti e altri segnali solubili attraverso gli scaffold 3D76. I microarray sono costituiti da un supporto solido in cui piccoli volumi di diverse biomolecole e cellule possono essere posizionati in posizioni definite, consentendo l'indagine multiplexata delle cellule viventi e delle loro risposte agli stimoli. L'uso di queste tecnologie può migliorare la vitalità e le funzioni cellulari. Inoltre, le tecnologie microfluidiche possono aumentare la produttività e ridurre significativamente il costo della coltura a causa dei bassi requisiti di volume di reagenti.
F. Considerazioni sulle celle
Diversi tipi di cellule possono essere incorporati nei modelli 3D con risultati alterati. Esistono tre classificazioni principali di cellule che possono essere utilizzate: cellule staminali, cellule primarie e linee cellulari immortalizzate. Le cellule staminali sono cellule indifferenziate che possono essere stimolate a differenziarsi lungo diversi lignaggi. Le cellule staminali sono un'opzione interessante poiché si autorinnovano in coltura e possono essere utilizzate per creare modelli specifici per il paziente. Esistono molti tipi di cellule staminali che sono definite dal loro stadio di sviluppo. I diversi tipi includono: cellule staminali adulte (spesso provenienti dal midollo osseo o dal tessuto adiposo), cellule staminali fetali, staminali del sangue del cordone ombelicale, cellule staminali embrionali o cellule staminali pluripotenti indotte. Le cellule primarie, d'altra parte, sono ottenute direttamente da un tessuto specifico e quindi sono già impegnate in un lignaggio specifico. Hanno una vita limitata nella cultura e quindi sono più limitati in numero, e alla fine vanno incontro alla senescenza e smettono di proliferare. Le cellule immortalizzate, al contrario, sono state alterate per proliferare ed eludere la senescenza cellulare. I sistemi di consegna genica sono anche un'opzione per modulare un fenotipo specifico in modelli di ingegneria tissutale.
Nel corpo, la comunicazione tra diversi tipi di cellule è fondamentale per mantenere l'omeostasi e la specificità dei tessuti. Il miglioramento della differenziazione e della sopravvivenza si ottiene co-coltivando i tipi cellulari appropriati77-81. Inoltre, le co-colture portano a un aumento della deposizione di ECM82,83, a un miglioramento delle misurazioni dei risultati funzionali84, a una corretta morfologia83,84 e a strutture vascolari81 non raggiunte nelle monocolture. Oltre a imitare meglio la normale fisiologia, i modelli di co-coltura 3D sono stati utili per studiare le complesse interazioni tra le cellule tumorali e altri tipi di cellule, chiarendo il loro contributo alla crescita tumorale, alla vascolarizzazione e alle metastasi.
Considerazioni cellulari uniche per gli organi che si interfacciano con l'aria hanno portato a colture di più tipi di cellule all'interfaccia aria-liquido, tra cui polmone85, epidermide86, cornea87 e modelli di guancia interna88.
La coltura di cellule in un'interfaccia aria-liquido utilizzando supporti permeabili ha permesso lo sviluppo di modelli 3Din vitroper la scoperta di farmaci, inclusa la modellazione dell'epitelio polmonare. Utilizzando cellule di donatori malati, questi modelli cellulari vengono utilizzati per studiare una varietà di disturbi polmonari.

Nessun conflitto di interessi dichiarato.

La costruzione di tessuti 3D fisiologicamente rilevanti è un'iniziativa di ricerca multiforme in cui i tessuti risultanti possono essere utilizzati per molte applicazioni. Poiché i sistemi di coltura cellulare 3D forniscono un ambiente più accurato per la crescita cellulare, la morfogenesi dei tessuti e la differenziazione delle cellule staminali, hanno il potenziale per essere utilizzati per modellare lo sviluppo dei tessuti, la progressione della malattia e per l'impianto in situ di grandi difetti tissutali. I modelli 3D di colture cellulari sono adatti anche per colmare il divario tra i modelli preclinici 2D convenzionali per lo screening di farmaci e tossicità e gli studi clinici in vivo sull'uomo. I modelli preclinici 3D migliorati ricapitoleranno meglio i processi patobiologici alla base delle malattie di tessuti e organi specifici nell'uomo e prediranno anche in modo più accurato le risposte fisiologiche ai composti terapeutici.
Negli ultimi decenni sono già stati compiuti grandi passi avanti in questo campo, ma rimangono molte limitazioni pratiche prima che i modelli di coltura cellulare 3D possano essere ampiamente implementati in molte applicazioni. Per cominciare, molti dei modelli 3D sono nuovi e i dati generati utilizzando questi metodi devono essere convalidati rispetto alle risposte in vivo stabilite per la calibrazione. Inoltre, l'esito dei saggi 3D può essere molto variabile a causa della mancanza di protocolli standardizzati e dell'uso di popolazioni cellulari eterogenee e talvolta multiple. Le tecniche di analisi non distruttiva dei dati (fattori secreti, cambiamenti morfologici e/o marcatori funzionali non invasivi) sono quindi essenziali per tracciare lo stesso costrutto 3D sulla coltura. Inoltre, alcune matrici 3D hanno una permeabilità limitata o una scarsa dinamica di diffusione e quindi devono incorporare sistemi di perfusione per mantenere la vitalità e la funzione. Inoltre, il recupero e la visualizzazione delle cellule possono essere limitati in alcuni scaffold 3D. Un'altra importante limitazione è che molti dei modelli di coltura 3D non possono essere facilmente automatizzati o scalati per lo screening ad alta produttività.
Questi limiti, tuttavia, vengono superati con le tecnologie emergenti e i nuovi saggi 3D in vitro . I modelli di coltura cellulare 3D in vitro sono progrediti nel supportare la crescita cellulare, la morfogenesi tissutale, la differenziazione delle cellule staminali, la modellazione delle malattie, la scoperta di farmaci e i test di tossicità. È anche evidente che sono necessari diversi modelli 3D con caratteristiche diverse per soddisfare le esigenze di specifici tipi di celle o applicazioni. La combinazione di tecnologie più recenti come i microarray su chip, la microfluidica o la biostampa con matrici biologicamente rilevanti potrebbe aiutare a scalare e guidare alcuni di questi complessi modelli di colture cellulari 3D verso saggi di screening dei farmaci e test di tossicità altamente predittivi e pertinenti, oltre a fornire nuovi sistemi per la ricerca rigenerativa.

La coltura di cellule di mammifero in vitro è stata uno strumento inestimabile nella biologia cellulare per diversi decenni. Classicamente, le colture monostrato di cellule aderenti sono state coltivate su substrati bidimensionali (2D) piatti e rigidi, come il polistirene o il vetro. Tuttavia, molte cellule, quando vengono isolate dai tessuti e posizionate su superfici rigide di colture cellulari 2D planari, come la plastica per colture tissutali, diventano progressivamente più piatte, si dividono in modo aberrante e perdono il loro fenotipo differenziato 1,2. Sebbene questi studi bidimensionali su colture cellulari abbiano svolto un ruolo fondamentale nel migliorare la nostra comprensione di molti processi biologici, non emulano le condizioni in vivo.
Nel corpo, le cellule risiedono in una complessa matrice extracellulare (ECM) costituita da un'architettura tridimensionale (3D) che consente interazioni dirette con le cellule vicine e le molecole della matrice attraverso segnali biochimici e meccanici. Le interazioni cellula-cellula e cellula-ECM stabiliscono una rete di comunicazione 3D che mantiene la specificità e l'omeostasi del tessuto3. Pertanto, non sorprende che le differenze fondamentali nel microambiente dei sistemi di coltura cellulare 2D e 3D influenzino vari comportamenti cellulari, tra cui il modo in cui le cellule si attaccano, si diffondono e crescono, la loro morfologia e polarità, l'espressione genica e proteica, la vitalità, la proliferazione, la motilità, la differenziazione, la risposta agli stimoli, il metabolismo cellulare e la funzione generale 1,2,4-16.
L'ECM 3D che circonda una cellula svolge diverse funzioni critiche. Per cominciare, fornisce una complessa architettura su scala nanometrica di proteine strutturali come collagene, laminina, fibronectina e glicosaminoglicani per stabilire le proprietà meccaniche inerenti al microambiente cellulare17,18. Le cellule percepiscono questi meccanismi attraverso le integrine della superficie cellulare e si legano a specifici motivi di adesione presenti sulle proteine della ECM e sui glicosaminoglicani. Inoltre, la MEC è vitale per sequestrare biomolecole solubili e fattori di crescita e rilasciare queste molecole di segnalazione con controllo spazio-temporale per guidare processi come la migrazione cellulare, la degradazione della matrice e la deposizione17,18. Pertanto, per imitare veramente la MEC nativa, è necessario sviluppare modelli di coltura 3D che mostrino le proprietà meccaniche e chimiche della MEC, non solo nella fase iniziale di semina delle cellule, ma piuttosto in modo dinamico e sintonizzabile man mano che le cellule crescono e si sviluppano. Per soddisfare le esigenze dei diversi tipi di cellule e delle applicazioni nel corpo, è stata impiegata una vasta gamma di materiali e tecniche di fabbricazione per sviluppare microambienti 3D con diverse caratteristiche fisiche, biologiche e meccaniche. Ogni modello presenta una serie di vantaggi e limitazioni e un modello distinto non è adatto a tutte le applicazioni.

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3D Tissue Engineered Systems for Regenerative Approaches, Drug Discovery, and Toxicity Screening - ADVERTISEMENT

La coltura cellulare di mammifero in vitro è stata uno strumento inestimabile nella biologia cellulare per diversi decenni. Classicamente, le colture monostrato di cellule aderenti sono state coltivate su substrati bidimensionali (2D) piatti e rigidi, come il polistirene o il vetro. Tuttavia, molte cellule, quando vengono isolate dai tessuti e posizionate su superfici rigide di colture cellulari 2D planari, come la plastica per colture tissutali, diventano progressivamente più piatte, si dividono in modo aberrante e perdono il loro fenotipo differenziato 1,2. Sebbene questi studi bidimensionali su colture cellulari abbiano svolto un ruolo fondamentale nel migliorare la nostra comprensione di molti processi biologici, non emulano le condizioni in vivo.

<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig1highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 1"> 
Figura 1. Le ghiandole endometriali sviluppate in vitro mostrano polarità apicobasale epiteliale. Doppia immunocolorazione di ghiandole sviluppate in vitro coltivate per 8 giorni in terreno BIE (A-E) o sezioni di criostato ottenute da endometrio di topo (F-I). A e F: Citocheratina (verde) e vimentina (rosso). B e G: Laminina (verde) e falloidina (rosso). C e I: GM130 (verde) e falloidina (rosso). D e H: ZO-1 (verde) ed E-caderina (rosso). E: ZO-1 (verde) e b-catenina (rosso). Barra della scala bianca = 20 mm. Terreno BIE = terreno basale integrato con 5ng/mL di EGF e diluizione 1:100 dell'integratore ITS e matrice Matrigel™ fresca al 3%; EGF = fattore di crescita epidermico; ITS = insulina transferrina selenio (Eritja et al., 2010)89.
Figura 1 descrizione - L'organizzazione, la segnalazione e la secrezione delle cellule epiteliali ghiandolari assomigliano più da vicino alle proprietà osservate in vivo quando coltivate in un ambiente 3D, in contrasto con il comportamento che si verifica sulle superfici 2D 10,11. Un modello 3D in vitro per le ghiandole endometriali è mostrato nella Figura 1. In questo modello, le cellule epiteliali endometriali sono state coltivate in terreno contenente matrice Matrigel™ per 7-8 giorni, seguite da colorazione in immunofluorescenza di vari marcatori di polarità. L'analisi dell'espressione dei marcatori ha confermato che le strutture ghiandolari erano composte esclusivamente da cellule di origine epiteliale (1A e 1F). Inoltre, gli sferoidi che rappresentano le ghiandole endometriali hanno mostrato una corretta polarità apicale-basolaterale (1B e 1G), il posizionamento dell'apparato di Golgi (1C e 1I), le giunzioni aderenti (ID e IH) e le giunzioni strette (IE). 
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig2highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 2"> 
Figura 2. Proliferazione e differenziazione in scaffold 3D. (A + B) Immagine della luce di trasmissione delle cellule proliferanti in PuraMatrix con 0,25% di laminina (PML) e delle cellule differenzianti in PML allo 0,25% (C + D). Immagine al microscopio elettronico a scansione di cellule proliferanti e cellule differenziate in PML 0,25%. (B + D) Dopo l'induzione della differenziazione si osserva lo sviluppo di una fitta rete tridimensionale di processi. (E) L'immunocitochimica per bIII-tubulina e TH di cellule non indotte in PML 0,25% e (F) Le cellule dopo 7 giorni di differenziazione hanno rivelato una fitta rete di cellule bIII-tubulina positive. Si è scoperto che le cellule TH+ possiedono processi, ma senza costruire una fitta rete (Ortinau et al. 2010)90.
Figura 2 descrizione – In questo studio, Ortinau e colleghi hanno utilizzato un idrogel sintetico, PuraMatrix™ integrato con laminina (PML 0,25%) per la differenziazione neuronale delle cellule progenitrici neurali umane90. Utilizzando la microscopia a luce a trasmissione (FIGURA 2A + B) e la microscopia elettronica a scansione (FIGURA 2C + D) i ricercatori hanno dimostrato che le cellule progenitrici neurali possono svilupparsi in una fitta rete di processi neuronali (FIGURA 2B + D). Inoltre, l'immunocitochimica ha rivelato che dopo 7 giorni di differenziazione, le cellule precursori neuronali hanno iniziato ad esprimere marcatori neuronali (bIII-tubulina e tirosina idrossilasi (TH)) (FIGURA 2E + F). Queste osservazioni dimostrano come la funzionalizzazione con opportuni fattori biologici possa convertire matrici sintetiche inerti in modelli in vitro utili per supportare il differenziamento di cellule staminali e progenitrici.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig3highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 3"> 
Figura 3. Gli organoidi ricapitolano l'espansione dei progenitori e la differenziazione organizzata.
(A-E) Immunoistochimica su sezioni di organoidi a 7 giorni che mostra che (A) tutte le cellule (DRAQ5, nuclei rossi) sono epiteliali (E-caderina) e molte proliferano [fosfo-istone H3 (pHH3)] e (B, C) conservano i marcatori pancreatici PDX1, SOX9 e HNF1B. (C) Le cellule si polarizzano e formano tubi rivestiti di mucina 1. (D) La differenziazione esocrina (amilasi) si osserva alla periferia. (E) La differenziazione endocrina (insulina) viene rilevata nel centro. La sezione in B è vicina a quella in A e la sezione in D è vicina a quella in C. (F) Schema sperimentale per testare la differenziazione endocrina dopo trapianto di cellule cresciute in organoidi in una nicchia pancreatica. WT, tipo selvatico. (G-J) Le cellule che sono state coltivate per la prima volta in vitro si integrano nell'epitelio ospite (bianco in G e verde in H-J). Alcuni rimangono progenitori (G; HNF1B), alcuni diventano acinari (H; amilasi) o duttali (I; DBA) e altri diventano endocrini (glucagone o insulina). I riquadri sono ingrandimenti delle caselle tratteggiate. Barre della scala: 50 μm (Greggio et al., 2013)53.
Descrizione della Figura 3 – La Figura 3 illustra uno schema delle condizioni di coltura 3D che hanno permesso un'espansione efficiente dei progenitori pancreatici embrionali dissociati di topo53. Manipolando la composizione del mezzo, i ricercatori hanno generato sfere cave, che sono composte principalmente da progenitori pancreatici, o organoidi complessi che subiscono spontaneamente la morfogenesi e la differenziazione pancreatica.
<img fo:content-width="5in" width="500" alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/5517/5517fig4highres.jpg" data-altupdatedat="1784610006000" data-alt="Figura 4"> 
Figura 4 | Descrizione del sistema di coltura di organoidi cerebrali. un Schema del sistema di coltura utilizzato per generare organoidi cerebrali. Vengono mostrate immagini di esempio di ogni fase. bFGF, fattore basico di crescita dei fibroblasti; hES, cellula staminale embrionale umana; hPSCs, cellule staminali pluripotenti umane; RA, acido retinoico. B, I tessuti neuroepiteliali generati utilizzando questo approccio (a sinistra) mostravano grandi cavità piene di liquido e una tipica localizzazione apicale della N-caderina neurale (freccia). Questi tessuti erano più grandi e più continui dei tessuti cresciuti in sospensione stazionaria senza Matrigel (a destra). C, Il sezionamento e l'immunoistochimica hanno rivelato una morfologia complessa con regioni eterogenee contenenti progenitori neurali (SOX2, rosso) e neuroni (TUJ1, verde) (freccia). D, Immagini in campo chiaro a basso ingrandimento che rivelano cavità piene di liquido che ricordano i ventricoli (freccia bianca) e il tessuto retinico, come indicato dall'epitelio pigmentato retinico (freccia nera). Barre della scala, 200 mm (Lancaster et al., 2013)57.
Figura 4 descrizione - Lancaster et al. hanno generato organoidi cerebrali con notevole somiglianza strutturale con il tessuto cerebrale57. Questi organoidi cerebrali sono cresciuti più grandi dei tipici sferoidi cellulari e sono sopravvissuti per settimane o mesi.

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