Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

L'obiettivo generale di questo esperimento è studiare l'influenza di potenziali farmaci vasocoattivi sulla formazione di trombi microvascolari in vivo. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla formazione dei trombi, come l'identificazione di nuove sostanze antitrombotiche in grado di prevenire la formazione di trombi microvascolari, una delle principali complicanze nella sepsi e durante il trapianto di tessuti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello dell'orecchio del topo senza pelo consente la microscopia a fluorescenza intravitale e l'induzione fototossica del trombo senza necessità di preparazione chirurgica preliminare nel letto microvascolare esaminato.

Iniziare pesando e registrando il peso del topo. Quindi caricare il volume appropriato della sostanza in esame in una siringa per insulina. Somministrare il farmaco 30 minuti prima dell'induzione del trombo.

Dopo aver anestetizzato il topo 15 minuti prima dell'induzione del trombo, riposizionare il topo nella gabbia fino all'inizio dell'anestesia. Per verificare un'anestesia sufficiente, pizzicare la coda con una pinza ed osservare l'assenza di reazione. Successivamente, aspirare 0,05 ml di Dextran 50 scongelato in una siringa per insulina.

Dopo aver riempito la siringa, assicurarsi che non rimangano bolle d'aria, poiché anche piccole bolle d'aria somministrate per via endovenosa possono essere letali per l'animale. Posizionare il topo anestetizzato su un supporto in acroglass con piastra riscaldante integrata, in posizione prona. Regolare la piastra riscaldante a 37 gradi Celsius.

Coprire le cornee degli occhi del mouse con un unguento oftalmico. Quindi inserire due punti di sutura in polipropilene 7.0 nel margine craniale e caudale dell'orecchio destro. Posizionare i punti il più vicino possibile al margine e il più prossimale possibile alla base.

Spostare il mouse in posizione dorsale. Fissare tutte le zampe alla piattaforma utilizzando una benda adesiva. Passare un filo di sutura sotto i denti anteriori e posizionare la testa in dorsiflessione fissando il filo di sutura alla piattaforma con una benda adesiva.

Posizionare l'animale sulla piattaforma sotto il microscopio stereoscopico. Utilizzare un ingrandimento di 10X. Per l'osservazione microscopica dell'orecchio destro, preparare la vena giugulare sinistra creando innanzitutto un'incisione di 5 mm nel tessuto cutaneo del collo in direzione cranio-caudale.

Quindi utilizzare pinzette microchirurgiche e forbici microchirurgiche per dissezionare il tessuto sottocutaneo. Successivamente, liberare la vena dalla sua avventizia senza toccare il vaso. Ora, utilizzare la siringa per insulina precedentemente preparata per l'iniezione del colorante fluorescente.

Afferrare con attenzione la parete del vaso con la pinzetta microchirurgica senza perforare la vena. Penetrare la parete del vaso dilatato con l'ago della siringa e iniettare 50 Dextran per via endovenosa. Rimuovere l'ago e arrestare l'emorragia utilizzando tamponi di cotone.

Evitare contaminazioni di sangue e colorante sull'orecchio. Trasferire l'animale sulla piastra riscaldante verso una struttura in vetro acro con una fessura per il piatto acustico e un piano alto 0,5 cm per posizionare l'orecchio. Fissare l'animale in posizione prona sulla piastra riscaldante utilizzando una benda adesiva.

Posizionare la cartilagine convessa alla base dell'orecchio accanto al piano dell'orecchio in modo che la parte apicale dell'orecchio possa essere disposta piatta sul piano. Aggiungere una goccia di acqua a temperatura ambiente sulla piastra di vetro acro. Utilizzando bastoncini di cotone, assorbire la goccia d'acqua e lasciare che le forze capillari fissino il piano dell'orecchio alla piastra di vetro acro.

L'orecchio deve essere posizionato nel modo più piatto possibile, anche se la cartilagine conferisce all'orecchio una forma convessa. Pertanto, solo la parte distale più flessibile dell'orecchio dovrebbe essere posizionata sulla piastra di vetro acrilico. Per evitare danni ai tessuti e fuoriuscita di liquidi e colorante, toccare l'orecchio il meno possibile con la pinzetta.

Successivamente, aggiungere una goccia di acqua sul lato dorsale convesso dell'orecchio. Posizionare con attenzione un vetrino coprioggetto sull'orecchio senza comprimere i vasi basali che entrano nell'orecchio. Utilizzare bastoncini di cotone per rimuovere quanta più acqua possibile da sotto il vetrino coprioggetto, al fine di minimizzare la distanza tra il vetrino coprioggetto e i vasi bersaglio dell'orecchio.

Iniziare regolando il microscopio a fluorescenza intravitale per la visualizzazione del Dextran 50. Trasferire l'animale preparato sul piano del microscopio a fluorescenza intravitale. Utilizzando un ingrandimento 5X, 10X e 20X e un'intensità luminosa del 20%, cercare un vaso venoso dal diametro compreso tra 50 e 60 micron con flusso ematico anterogrado.

Aggiungere una goccia di acqua a temperatura ambiente sul vetrino coprioggetto per l'immersione in acqua dell'obiettivo con ingrandimento 63X. Immediatamente dopo l'applicazione della goccia d'acqua, iniziare la registrazione del vaso per 20 secondi per la valutazione della linea di base del diametro e del flusso sanguigno. Iniziare l'induzione del trombo cinque minuti dopo l'iniezione di 50 Dextran.

A questo scopo, aumentare l'intensità della luce al 100%. Durante l'induzione fototossica del trombo, chiudere l'apertura del microscopio per due secondi all'interno di un periodo di 30 secondi per verificare l'occlusione del flusso sanguigno. Se il flusso sanguigno persiste, riaprire nuovamente l'apertura. Il vaso viene classificato come occluso se il flusso rimane fermo per 30 secondi o più, oppure se il flusso sanguigno è retrogrado.

Selezionare e occludere cinque vasi per orecchio entro un'ora dall'iniezione di 50 Dextran. In questo caso, gli animali sono stati trattati con veicolo o con cannabinoidi, anandamide, WIN 155,212-2 o cannabidiolo prima dell'iniezione di 50 Dextran e prima dell'induzione del trombo. L'anandamide, ma non il CBD, e il WIN 155,212-2 hanno accelerato significativamente la crescita del trombo dopo un singolo trattamento rispetto al controllo con veicolo.

In un altro contesto, l'anandamide è stata combinata con indometacina per valutare l'impatto dei prodotti dipendenti dalla cicloossigenasi sulla formazione del trombo indotta dall'anandamide. La somministrazione concomitante con indometacina ha neutralizzato l'effetto pro-trombotico dell'anandamide. Pertanto, l'esposizione acuta all'anandamide induce un effetto pro-trombotico dipendente dalla cicloossigenasi in vivo.

Una volta padroneggiata, l'induzione di trombo in vasi ristretti può essere eseguita in 90 minuti, inclusa la preparazione. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale manipolare l'auricolo con estrema cautela ogni volta che viene toccato, per evitare l'estroflessione di liquidi e colorante. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla formazione del trombo, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la cicatrizzazione delle ferite, il fallimento dei lembi cutanei e l'angiogenesi.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione dell'applicazione del colorante fluorescente endovenoso, della posizione del padiglione auricolare e dell'illuminazione di vasi specifici al fine di eseguire l'induzione fototossica di trombi in vivo.