Name: Analizzando Synaptic Modulazione di Drosophila melanogaster Fotorecettori dopo lesposizione alla luce prolungata (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Scopri come quantificare le zone attive sinaptiche nei fotorecettori di Drosophila melanogaster dopo esposizione prolungata alla luce. Questo metodo semi-automatizzato analizza numero e distribuzione delle sinapsi.

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Siamo grati a T. Stürner per correzioni utili, discussioni e commenti sul manoscritto; SL Zipursky per la fornitura di scorte Fly; M Scholling per eseguire l&#39;elaborazione delle immagini. Parte della analisi delle immagini è stata effettuata presso il laboratorio di A. Kakita. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione Alexander von Humboldt e JSP borse per la ricerca all&#39;estero (AS), JSPS Fellows (SH-S.), Gli aiuti Grant-In- per start-up (24.800.024), su aree innovative (25.110.713), Mochida, Takeda, Inamori, Daiichi Sankyo-, Fondazioni Toray (TS), finanziamento di base DZNE (GT) e DZNE luce Microscopia Facility (CM).

Le procedure sperimentali descritte in questo protocollo si riferiscono a lavori esclusivamente con Drosophila e non sono soggetti alle leggi sul benessere degli animali in Germania e Giappone. 1. Condizioni espozione <ol><li> Preparare le mosche che portano sensless-flippase (sens-FLP) e Bruchpilot-FRT-STOP-FRT-GFP (BRP-FSF-GFP) 15 per la visualizzazione di BRP-GFP in fotorecettori neuroni R8 (R8s). Il BRP codifica locus genomico all&#39;interno di un cromosoma artificiale batterico (BAC) è stato modificato per generare questo costrutto BRP-FSF-GFP. Nelle mosche che portano questo BAC modificato l&#39;espressione di BRP-GFP è sotto il controllo delle sequenze regolatorie endogene, ma limitato a fotorecettori R8 dopo sensless-flippase rimozione mediata della cassetta FRT-STOP-FRT 15. Si noti che sens-FLP raramente esprime flippase in R7s. </li><li> Mantenere le mosche in un 12 h LiSinistra / 12 h buio ciclo (LD) a 25 ° C dalla fase di larva fino eclosion (Figura 1A). </li><li> Raccogliere le mosche 0 - 6 ore dopo eclosion e metterli in un nuovo flacone contenente cibo mosca. </li><li> Impostare le fiale in un rack trasparente fatta di resina acrilica con tre gradini (una altezza di 41 cm, una base di 21 cm, uno spessore di 4 cm e un&#39;altezza di 13 cm per ogni passo) (Figura 1B). </li><li> Regolare la distanza tra la cremagliera e un pannello a LED per fornire l&#39;illuminazione con un&#39;intensità media di 1,000 lux utilizzando un misuratore digitale della luce (Figura 1C). </li><li> Conservare le mosche per 1 - 3 d sotto una delle seguenti condizioni: buio costante (DD), 12 h luce / 12 h buio ciclo (LD), o luce costante (LL) a 25 ° C in un piccolo incubatore (figure 1A e 1C). </li></ol> 2. Dissezione, immunoistochimica e Imaging <ol><li> Sezionare il cervello mosca con una pinza, fissarli con il 4% formaldehyde e immunostain con l&#39;anticorpo primario contro Chaoptin (1:50) ed un secondo anticorpo per la visualizzazione dei fotorecettori basato su precedenti procedure sperimentali 25. Brevemente: <ol><li> Preparare 0,1% Triton X-100 in PBS (0,1% PBT). Questa soluzione viene utilizzata per migliorare la penetrazione tissutale anticorpi. </li><li> Anestetizzare le mosche su un blocco di CO 2, risolvere il genotipo corretto e trasferirli in una capsula di Petri riempite con 0,1% PBT. </li><li> Stick la pinza sotto la proboscide e tirare fuori gli occhi a destra ea sinistra, rispettivamente, con le altre pinze. </li><li> Rimuovere la proboscide e la trachea attaccato al cervello. </li><li> Trasferire il cervello con le pinze in una provetta da 1,5 ml contenente 150 ml di 0,1% PBT a temperatura ambiente. </li><li> Entro 10 minuti ripetere da 2.1.3 - 2.1.5 per ottenere il maggior numero possibile di cervelli. </li><li> Aggiungere 50 ml di 16% di formaldeide nel tubo e mescolare pipettando. </li><li> Incubare il cervello in fissativo a cameratemperatura per 50 min. </li><li> Lavare tre volte con 200 ml di 0,1% PBT con una micropipetta, facendo attenzione a lasciare il cervello nel tubo. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il PBT 0,1% e aggiungere la soluzione di anticorpo primario, preparato come segue: aggiungere a 196 ml di 0,3% PBT (0,3% Triton X-100 in PBS) 4 ml di anticorpo anti-Chaoptin (diluizione finale 1 : 50) per la visualizzazione dei fotorecettori. </li><li> Incubare le cervelli in soluzione di anticorpo primario a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare 3x con 200 ml di 0,1% PBT con una micropipetta. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere il PBT 0,1% e aggiungere 200 microlitri del PBT 0,3% contenente un anticorpo secondario. </li><li> Incubare al buio a 4 ° CO / N. </li><li> Lavare tre volte con 200 ml di 0,1% PBT con una micropipetta. </li></ol></li><li> Per il montaggio, mettere due piccole gocce (2 ml ciascuna) di un mezzo di montaggio con una micropipetta al centro di un vetrino da microscopio a 2 cm circa distaSNO uno dall&#39;altro. </li><li> Mettere due lamelle, una su ogni goccia e lasciare uno spazio ristretto tra i vetrini di circa 0,2 mm. </li><li> Mettere 15 ml di un mezzo di montaggio sulla parte superiore del vetrino e aggiungere i cervelli con una micropipetta nel mezzo di montaggio. </li><li> Sotto un microscopio da dissezione, posizionare il cervello con il lato ventrale nello stretto spazio tra le due coprioggetto (Figura 2). </li><li> Posizionare un vetrino sulla parte superiore e sigillare i bordi del coprioggetto con smalto trasparente per fissare il campione (Figura 2). </li><li> Ottenere immagini del cervello con un microscopio confocale. Utilizzare un obiettivo 63X olio di immersione obiettivo (1,4 NA) e uno zoom digitale 2.6X. Generare più di 20 sezioni ottiche della seconda medulla ganglio ottica con un passo di 0,5 micron. </li></ol> 3. Generazione dei luoghi, oggetti superficie, avviamento punti e End-point <ol><li> Per quantificare il numero, la distribution e il livello di delocalizzazione di BRP-GFP puncta, aprire la pila ottenuta mediante microscopia confocale in immagine software di analisi e ricostituiscono immagini 3D (Figura 3a). Si noti che il passo in questo studio è stato effettuato con Imaris. </li><li> Identificare il puncta BRP-GFP dal modulo di rilevazione posto per ogni terminale assone R8. <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi spot&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; nelle impostazioni algoritmo. Selezionare un terminale assone R8 nel midollo manualmente. </li><li> Selezionare il canale sorgente del segnale BRP-GFP. NOTA: Gli assoni dei fotorecettori R7 e R8 sono stati immunolabeled con anti-Chaoptin (Figura 3A). Solo R8, però, contiene BRP-GFP puncta e potrebbe quindi essere facilmente distinto (figura 3A). Inoltre, il punto finale della R8 potrebbe essere identificato con l&#39;assottigliamento degli assoni anti-Chaoptin-positivi al punto di entrata nello strato midollare M3. </li><li> Impostare il diametro XY t stimatoo 0,35 micron e spuntare &quot;Sfondo sottrazione&quot; nella rilevazione posto. </li><li> Selezionare &quot;Qualità&quot; nel tipo di filtro e filtrare automaticamente. Quindi fare clic su Fine. </li><li> Ripetere dal 3.2.1 T 3.2.5 per altri assoni R (figura 3b). </li></ol></li><li> Per misurare il livello di delocalizzazione di BRP-GFP in assoni R8, generare oggetti di superficie con la funzione di &quot;Surface&quot; per ogni assone (Figura 3C). <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuove superfici&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; nelle impostazioni algoritmo. Quindi selezionare manualmente un R8 terminali degli assoni nel midollo. </li><li> Selezionare il canale fonte dei fotorecettori. </li><li> Controllare off &quot;liscio&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Intensity assoluto&quot; della soglia. </li><li> Selezionare &quot;Attiva&quot;. &quot;Punti di semi Diameter&quot; è di 0,5 micron. </li><li> Selezionare il filtro tipo &quot;Qualità&quot; e &quot;Numero di voxel&quot;, e poi filtrare automaticamente. </li><li> Vai su &quot;Modifica&quot; ed eliminare i pezzi di superfici generate da altri assoni non interessanti. </li><li> Ripetere da 3.3.1 - 3.3.8 per altri assoni R (Figura 3C). Nota Alcuni oggetti di superficie sono stati interrotti a causa della magrezza e il segnale debole in fotorecettori a livello M2, ma erano ancora considerati come un unico oggetto, dall&#39;inizio alla punti finali. </li></ol></li><li> Per identificare la distribuzione di BRP-GFP puncta lungo ogni neurone nel neuropil midollo, definire l&#39;inizio-point e punto finale con la funzione di punto di misura (Figura 3D). <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;. Quindi selezionare &quot;Modifica&quot; e selezionare &quot;Surface di oggetto&quot; per intersecarsi con la parte superiore degli oggetti di superficie. </li><li> Mettere punti di misurazione in cima oggetti superficie di assoni R a strato M1 in ordine. Questi sono ora definiti come start-punti (Figura 3D). </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;.Quindi selezionare &quot;Modifica&quot; e selezionare &quot;Surface di oggetto&quot; per intersecarsi con la parte inferiore degli oggetti di superficie. </li><li> Mettere punti di misura sul fondo degli oggetti superficie di assoni R a strato M3 in ordine. Questi sono ora definiti come end-point (Figura 3D). </li></ol></li><li> Per sottrarre il segnale di fondo dal canale GFP, generare oggetti superficie, macchie, start-punti e end-point per due assoni R a M6 strato (Figura 3E). <ol><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuove superfici&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Segmento solo una regione di interesse&quot; nelle impostazioni algoritmo. Quindi selezionare manualmente un terminale assone R7 tra M5 e M6 strato. </li><li> Selezionare il canale fonte del fotorecettore. </li><li> Controllare off &quot;liscio&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Intensity assoluto&quot; della soglia. </li><li> Selezionare il tipo di filtro &quot;Qualità&quot; e &quot;Numero di voxel&quot;, poi filtrare automaticamente. </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi spot&quot;;. </li><li> Selezionare &quot;Salta la creazione automatica, modificare manualmente&quot;. </li><li> Selezionare &quot;Centro di oggetto&quot; e aggiungere un posto nella zona interna dell&#39;oggetto superficie generata dalla 3.5.1 - 3.5.6. </li><li> Ripetere da 3.5.1 - 3.5.9 per un altro terminale assone R7. </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;. Quindi selezionare &quot;Edit&quot; e mettere i punti di misurazione sulla parte superiore dei due oggetti superficie della punta del terminale assone R7 nello strato M6. Questi sono ora definiti come start-punti. </li><li> Selezionare &quot;Aggiungere nuovi punti di misura&quot;. Quindi selezionare &quot;Edit&quot; e mettere punti di misura sul fondo dei due oggetti superficie della punta del terminale assone R7 nello strato M6. Questi sono ora definiti come end-point (Figura 3E). </li></ol></li></ol> 4. Il calcolo del numero di macchie, distribuzione della frequenza di spot e il livello di arricchimento di BRP-GFP con un&#39;immagine personalizzata Data Analysis Software <ol><li> Copiare il file&quot;XtquantifySynapseSNR.m&quot; e la cartella &quot;funzioni&quot; nella cartella MATLAB Imaris XT. Si noti che il calcolo in questo studio è stato eseguito con un plugin personalizzato implementato in Matlab. Scarica il plugin dal sito web ( <a href="https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo" target="_blank">https://github.com/cmohl2013/synapse_trafo</a> ). </li><li> Aprire un set di dati con n macchie, n superfici e 2 oggetti punto di misura, ognuno contenente punti n misura (preparati 3,1-3,4). Il primo oggetto punto di misurazione definisce le posizioni di partenza per tutti gli assoni. Il secondo oggetto punto di misura definisce la posizione finale di tutti assoni. Entrambi gli oggetti punto di misura devono avere lo stesso numero di punti di misura (cioè il numero di assoni). </li><li> Eseguire l&#39;elaborazione delle immagini &gt;&gt; CUSTOM&gt; atsushis rilevamento sinapsi Vs 6. </li><li> Controllare metadati e modificare le dimensioni dei pixel nel software di analisi delle immagini nel caso in cui non è corretto. </li><li> Selezionare il canale per la performance dell&#39;analisi intensità delle regioni macchie e delle regioni citoplasmatici (il canale con BRP-GFP). </li><li> Definire il nome del file per l&#39;esportazione dei risultati. </li><li> Definire il numero di contenitori e la lunghezza degli assoni in percentuale. Inserire il numero di bin come &quot;10&quot; e la gamma di contenitori come &quot;100%&quot; (le figure 4A e 4B). </li><li> Definire le regioni delle macchie e le altre regioni citoplasmatici per l&#39;analisi delocalizzazione BRP-GFP. Inserire i punti di raggio come &quot;0.35 micron&quot; e la larghezza della zona come &quot;50 micron&quot; circostante. Il raggio spot definisce la regione per il segnale puncta GFP (0,35 micron di diametro, centrato su un punctum). La larghezza della zona circostante definisce la regione per il segnale GFP nell&#39;area citoplasmatica (50 micron di diametro, centrata su lacrimale, ma includendo solo R8 ed escludendo tutte le aree piatte nel citoplasma) (figure 4A e 4C). </li><li> Attendere fino a quando tutte le maschere dei neuroni vengono elaboratied esportati come file PDF (figure 4B e 4C) e un tavolo CSV per ulteriori analisi in un foglio di calcolo. La tabella csv comprende il numero dei punti, l&#39;intensità media del segnale in &quot;zona citoplasmatica&quot; e l&#39;intensità massima del segnale in &quot;spot&quot; in ciascun bin per tutti gli assoni R8. </li><li> Aprire un set di dati preparato in 3.5 per sottrazione del segnale di fondo. </li><li> Eseguire l&#39;elaborazione delle immagini, come descritto 4,3-4,9. </li><li> Calcolare la media del numero totale e la distribuzione del puncta BRP-GFP in un foglio di calcolo (figure 4D e 4E). </li><li> Calcolare la media della delocalizzazione segnale Brp-GFP in un foglio per il rapporto tra l&#39;intensità media nella &quot;zona citoplasmatica&quot; divisa per l&#39;intensità massima nel &quot;spot&quot; sottratto dall&#39;intensità media del segnale di fondo (Figura 4F) . </li></ol>

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<li>Ke, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-Resolution+Mapping+of+Neuronal+Circuitry+With+an+Index-Optimized+Clearing+Agent%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Super-Resolution Mapping of Neuronal Circuitry With an Index-Optimized Clearing Agent.</a> Cell Rep. 14 (11), 2718-2732 (2016).</li>
<li>Ehmann, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+of+Bruchpilot+distinguishes+active+zone+states%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging of Bruchpilot distinguishes active zone states.</a> Nat Commun. 5, 4650(2014).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo mostrato come preparare le condizioni di luce per esporre le mosche a un&#39;intensità di luce uguali. Abbiamo quantificato non solo il numero di un puncta marcatore sinaptica, ma potrebbe anche spazialmente risolvere la densità delle sinapsi lungo gli assoni e misurare il livello di delocalizzazione della proteina marcatore nelle zone citoplasmatici. Questi tre valutazioni ci permettono di valutare i dettagli di dinamiche sinaptiche a livello dei neuroni singolo in diverse condizioni ambiental...

<html> La modulazione della funzione sinaptica contribuisce alla notevole capacità del sistema nervoso di rispondere o adattarsi alle mutevoli stimoli ambientali precisione. Regolazione della probabilità di rilascio delle vescicole presinaptico è un modo per controllare la forza sinaptica 1. Rilascio delle vescicole sinaptiche hanno luogo presso la zona attiva (AZ), una regione specializzata della membrana presinaptica 2. L&#39;AZ è caratterizzato da una cassetta di proteine specifiche 3, 4. La maggior parte delle proteine che contribuiscono alla AZ di montaggio sono altamente conservati nei nematodi, insetti e mammiferi 5. Studi recenti suggeriscono che il livello di attività neuronale regola la composizione molecolare del AZ, che a sua volta contribuisce alla regolazione della potenza funzionale sia in vitro che in vivo 6, 7,&gt; 8. Abbiamo già scoperto che AZS fotorecettori subiscono rimodellamento molecolare in Drosophila dopo una prolungata esposizione alla luce ambientale naturale, 9. In questa condizione, abbiamo osservato che il numero di Bruchpilot (BPA) -positivo AZS è stata ridotta negli assoni dei fotorecettori. Le proteine Brp / CAST / famiglia ELKS sono mattoni fondamentali di AZS in vertebrati e invertebrati sinapsi 10. In Drosophila mutanti BRP, evocato rilascio delle vescicole è soppressa 11, 12. Le 17 residui di aminoacidi C-terminale della Brp sono essenziali per il clustering sinaptica vescicole al Drosophila Giunzione neuromuscolare (NMJ) 13, 14. Questi studi hanno dimostrato il ruolo centrale di questa molecola in organizzazione e funzione AZ. Con uno strumento genetico sviluppato di recente, Synaptic Tagging con ricombinazione (STAR), Brppuò essere osservato in vivo in specifici tipi cellulari, a livelli di espressione endogeni e ad una sola risoluzione sinapsi 15. Questo strumento rende possibile valutare le dinamiche endogene di sinapsi quantitativamente nel complesso sistema nervoso centrale. Ci sono stati diversi studi tra cui quantificazioni sinapsi in base ai dati ottenuti da microscopia confocale. alterazioni sinaptiche sono state valutate misurando la lunghezza, la zona, il volume, la densità e contando il numero basato su applicazioni software sofisticate. Per esempio, il freeware ImageJ fornisce un metodo di quantificazione per l&#39;area sinaptica totale e le misure di densità sinaptica alla Drosophila NMJ 16. Il numero di siti colocalizzazione di marcatori pre e post-sinaptici sono stati quantificati utilizzando il plug-in &quot;Puncta Analyzer&quot; disponibili sulla piattaforma software ImageJ 17. In alternativa, un multi-parprogramma basato adigm ambiente di calcolo numerico, Synapse Detector (Synd), può tracciare automaticamente dendriti dei neuroni marcati con un marcatore fluorescente, e quindi quantifica i livelli di proteine sinaptiche in funzione della distanza dal corpo cellulare 18. Il software Synaptic Puncta Analysis (SynPAnal), è stato progettato per l&#39;analisi rapida di immagini 2D di neuroni acquisiti da microscopia confocale o fluorescenti. La funzione principale di questo software è la quantificazione automatica e rapida della densità e l&#39;intensità di proteine puncta 19. Recentemente, un algoritmo automatico apprendimento basato rilevamento sinapsi è stato generato per la quantificazione del numero sinaptica in 3D 20, approfittando del software 21 Visualizzazione 3D-Assisted Analysis (Vaa3D). immagine commerciale software di analisi sono anche potenti strumenti per la quantificazioni sinaptiche. Per esempio, la fluorescenzarecettori dei neurotrasmettitori etichettati o un componente presinaptica AZ sono stati quantificati in tre dimensioni con risoluzione di una singola sinapsi in C. elegans 22 o il sistema Drosophila olfattivo 23, 24, permettendo centinaia di sinapsi per essere rapidamente caratterizzato all&#39;interno di un singolo campione. Qui, presentiamo un metodo con un software di analisi di immagine personalizzata plug-in implementato in un ambiente di calcolo numerico multi-paradigma che permette di analizzare semi-automaticamente molteplici aspetti AZS, tra loro numero, la distribuzione e il livello di arricchimento di componenti molecolari l&#39;AZ. Così, questo complesso di analisi ci ha permesso di valutare la dinamica dei componenti sinaptiche in terminali degli assoni in diverse condizioni ambientali. Abbiamo studiato l&#39;effetto dell&#39;esposizione luce sulle sinapsi di uscita dei fotorecettori mosca adulta. La procedura viene eseguita in tre fasi: 1)preparazione per esposizione alla luce, 2) dissezione, immunoistochimica e confocale, e 3) analisi delle immagini.

<table><tbody><tr><td>Fiala</td><td>Hightech, Giappone</td><td>MKC-20</td><td></td></tr><tr><td>Plug</td><td>Thermo Fisher Sciehtific, USA</td><td>AS-275</td><td></td></tr><tr><td>Cremagliera trasparente personalizzata in resina acrilica&nbsp;</td><td>Shin-Shin Corporation, Giappone</td><td></td><td>un'altezza di 41 cm, una base di 21 cm, uno spessore di 4 cm e un'altezza di 13 cm per ogni gradino</td></tr><tr><td>Incubatrice fredda</td><td>MITSUBISHI ELECTRIC, Giappone</td><td>CN-40A</td><td></td></tr><tr><td>Pannello LED</td><td>MISUMI, Giappone</td><td>LEDXC170-W</td><td></td></tr><tr><td>Misuratore di luce digitale</td><td>CEM</td><td>DT-1301</td><td></td></tr><tr><td>Fly pad</td><td>Tokken, Giappone</td><td>TK-HA03-S</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri (35 x 10 mm)</td><td>Greiner Bio-One International, Germania</td><td>627102</td><td></td></tr><tr><td>Compressa PBS</td><td>Takara, Giappone</td><td>T900</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Wako, Giappone</td><td>160-24751</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 Pinze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Provetta da 1,5 mL</td><td>Sarstedt, Germania</td><td>A. 152X</td><td></td></tr><tr><td>Formaldeide 16%</td><td>NEM, Giappone</td><td>3152</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-200</td><td>Gilson</td><td>F123601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-20</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>Pipetman P-2</td><td>Gilson</td><td>F144801</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-chaoptin</td><td>DSHB</td><td>24B10</td><td></td></tr><tr><td>Alexa568-coniugato anticorpo di topo</td><td>Life Technologies</td><td>A-11031</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Montaggio medio Vector</td><td>Laboratories, Inc.</td>Vetrino per microscopio <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>(76 x 26 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific Gerhard Menzel B.V. & Co. KG, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti (18 x 18 mm, 0,17 mm)</td><td>Zeiss, Germania</td><td>474030-9000-000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopi industriali</td><td>Olympus, Giappone</td><td>SZ61-C-SET</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio Illuminazione</td><td>Olympus, Giappone</td><td>KL 1600 LED</td><td></td></tr><tr><td>microscopia confocale</td><td>Zeiss, Germania</td><td>LSM780</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane, Svizzera</td><td></td><td>Versione 7.6.4 o superiore</td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The MathWorks, Inc., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel per Mac</td><td>Valentina</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

analizzando synaptic modulazione di<em&gt; drosophila melanogaster</em&gt; fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

Analyzing Synaptic Modulation of Drosophila melanogaster Photoreceptors after Exposure to Prolonged Light

Il sistema nervoso ha la notevole capacità di adattarsi e rispondere a vari stimoli. Questa regolazione neurale è ottenuto tramite la plasticità a livello sinaptico. La zona attiva (AZ) è la regione a livello della membrana presinaptica che media il rilascio dei neurotrasmettitori ed è composto da un insieme denso di proteine ​​ponteggi. AZS di Drosophila melanogaster (Drosophila) fotorecettori subisce rimodellamento molecolare dopo una prolungata esposizione alla luce ambientale naturale. Così il livello di attività neuronale in grado di riorganizzare la composizione molecolare del AZ e contribuire alla regolazione della potenza funzionale. A partire dalla esposizione alla luce di set-up preparazione alla immunoistochimica, questo protocollo dettagli come quantificare il numero, la distribuzione spaziale, e il livello di delocalizzazione delle molecole sinaptiche a AZS in fotorecettori Drosophila. Utilizzando l&#39;analisi delle immagini software, grappoli della componente GFP-fuso AZ Bruchpilot sono stati identificati per ogni fotorecettore R8 (R8) terminale degli assoni. macchie Bruchpilot rilevati sono stati assegnati automaticamente ai singoli assoni R8. Per calcolare la distribuzione di frequenza posto lungo l&#39;assone, abbiamo implementato un personalizzato software plugin. start-point di ogni assone e end-point sono stati definiti manualmente e la posizione di ciascun punto Bruchpilot stati proiettati sulla linea di collegamento tra inizio e fine-point. Oltre al numero di cluster Bruchpilot, abbiamo anche quantificato il livello di delocalizzazione Bruchpilot-GFP all&#39;interno dei cluster. Queste misure riflettono in dettaglio le dinamiche sinaptiche spazialmente risolti in un singolo neurone in diverse condizioni ambientali agli stimoli.

L&#39;occhio composto di Drosophila comprende ~ 780 ommatidi, ciascuna contenente otto tipi di fotorecettori (R1-8). R7 e R8 progetto loro assoni alla seconda ganglio ottico, midollo, dove formano sinapsi strati M6 e M3, rispettivamente, 26. Per studiare l&#39;effetto dell&#39;esposizione prolungata alla luce sulla composizione molecolare dei fotorecettori zone attive R8, abbiamo approfittato del metodo STaR 15. Livelli di espressi...

Qui mostriamo come quantificare il numero e la distribuzione spaziale delle zone attive sinaptiche In Drosophila melanogaster fotorecettori, evidenziata con un marcatore molecolare geneticamente codificato, e la loro modulazione dopo una prolungata esposizione alla luce.

Analizzando Synaptic Modulazione di<em&gt; Drosophila melanogaster</em&gt; Fotorecettori dopo l&#39;esposizione alla luce prolungata

The nervous system has the remarkable ability to adapt and respond to various stimuli. This neural adjustment is largely achieved through plasticity at ...

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è comprendere la dinamica sinaptica in un singolo neurone in diverse condizioni di attivazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della plasticità sinaptica, ad esempio rivelando i cambiamenti nella composizione molecolare delle sinapsi durante la maturazione dell'attività neuronale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi semi-automatica di diversi aspetti delle sinapsi, inclusi il loro numero, distribuzione e livello di arricchimento di componenti molecolari dopo la formazione delle sinapsi.Per questo esperimento, raccogliere le mosche in provette normali entro sei ore dall'eclosione. Inserire le provette di raccolta in un supporto trasparente in acrilico. All'interno di un piccolo incubatore impostato a 25 gradi celsius, posizionare il supporto a una distanza precisa da un pannello LED in cui l'esposizione alla luce sia in media di 1000 lux.Quindi, allevare le mosche da uno a tre giorni utilizzando una delle seguenti condizioni: buio costante, 12 ore di luce seguite da 12 ore di buio, oppure luce costante. Successivamente, dissezionare e colorare i cervelli

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Questa procedura utilizza una luce blu-attivati ​​canali delle cellule algali e strumenti specifici per l'espressione genetica di evocare i potenziali sinaptici con impulsi di luce a livello della giunzione neuromuscolare (NMJ)...

Channelrhodopsin2 stimolazione mediata dei potenziali Synaptic a Drosophila Giunzioni neuromuscolari

Questo video delinea il protocollo per la registrazione elettrofisiologica dell'attività dei fotorecettori nell'occhio di una Drosophila immobilizzata, consentendo una misurazione precisa delle variazioni di tensione in risposta agli stimoli luminosi.

Registrazione elettrofisiologica delle risposte di tensione dei fotorecettori retinici di Drosophila agli stimoli luminosi

Questo video dimostra un protocollo sperimentale per studiare il post-potenziale depolarizzante prolungato (PDA) nella Drosophila dagli occhi bianchi. L'occhio della mosca è esposto a intensi impulsi di luce blu per convertire il fotopigmento rodopsina in metarodopsina, avviando una cascata di segnalazione che apre canali ionici positivi e provoca la depolarizzazione della membrana. Poiché la luce blu impedisce la riconversione della metarodopsina in rodopsina, l'afflusso continuo di ioni...

Studio del postpotenziale depolarizzante prolungato (PDA) nei fotorecettori della Drosophila

Questo video dimostra l'allevamento di Drosophila melanogaster in specifiche condizioni di luce per studiare il ruolo delle proteine Bruchpilot nel rilascio di neurotrasmettitori e la conseguente modulazione dell'attività sinaptica.

Modulazione sinaptica in Drosophila dopo esposizione a luce prolungata

Questo video dimostra un protocollo per studiare il riciclaggio delle vescicole sinaptiche alle giunzioni neuromuscolari nelle larve di Drosophila che esprimono canalrodopsina utilizzando un colorante fluorescente. La luce blu attiva le canalrodopsine, causando l'afflusso di calcio e l'esocitosi delle vescicole sinaptiche. Il colorante si integra nelle membrane neuronali e viene internalizzato durante l'endocitosi, con conseguente miglioramento della fluorescenza. Un'ulteriore stimolazione...

Analisi del riciclaggio delle vescicole sinaptiche e dell'assorbimento del colorante fluorescente nelle larve di Drosophila

Qui si descrive un test di preferenza chiaro-scuro per Drosophila larva. Questo test fornisce informazioni sulla regolazione innata e circadiano di luce di rilevamento ed elaborazione photobehavior.

Luce Preferenza Assay per studiare Innata e circadiano Photobehavior Regolamentato<em&gt; Drosophila</em&gt; Larve

I microelettrodi affilati consentono un'accurata caratterizzazione elettrofisiologica dell'output dei fotorecettori e degli interneuroni visivi in Drosophila vivente. Qui mostriamo come utilizzare questo metodo per registrare risposte di tensione di alta qualità delle singole cellule alla stimolazione luminosa controllata. Questo metodo è ideale per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali negli occhi composti da insetti.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Questo protocollo introduce un saggio di luce-spot per studiare il comportamento fototattica larvale della Drosophila. In questo analisi, un punto luce viene generato come stimolazione della luce e il processo di prevenzione della luce larvale è registrato da un sistema di imaging basato sulla luce infrarossa.

Analisi basata su macchie di luce per l'analisi di Drosophila Larval Phototaxis

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Questo protocollo valuta l'attività sinaptica funzionale tra partner neuronali definiti in vivo nel sistema nervoso centrale delle larve di Drosophila melanogaster utilizzando strumenti codificati geneticamente. CsLa stimolazione optogenetica mediata da Chrimson dei neuroni sensoriali presinaptici cIVda induce la fotoconversione dipendente dal calcio di CaMPARI negli interneuroni postsinaptici del Bacino-4.

Caratterizzazione funzionale dei partner individuali pre- e postsinaptici nel sistema nervoso centrale larvale di Drosophila utilizzando CaMPARI

Scopri come quantificare le zone attive sinaptiche nei fotorecettori di Drosophila melanogaster dopo esposizione prolungata alla luce. Questo metodo semi-automatizzato analizza numero e distribuzione delle sinapsi.

Analizzando Synaptic Modulazione di

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