Analizzando Synaptic Modulazione di Drosophila melanogaster Fotorecettori dopo l'esposizione alla luce prolungata

L'obiettivo generale di questa procedura sperimentale è quello di comprendere le dinamiche sinaptiche in un singolo neurone in diverse condizioni di attivazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della plasticità sinaptica, come rivelare i cambiamenti nella composizione molecolare delle sinapsi dopo la maturazione dell'attività del neurone. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi semi-automatizzata di molteplici aspetti delle sinapsi, tra cui il loro numero, la distribuzione e il livello di arricchimento dei componenti molecolari dopo le sinapsi.

Per questo esperimento, raccogli le mosche in fiale normali entro sei ore dall'eclosione. Caricare le fiale di raccolta in un rack in acrilico trasparente. In una piccola incubatrice impostata a 25 gradi Celsius, posizionare il rack a una distanza precisa da un pannello LED dove l'esposizione alla luce è in media di 1000 lux.

Quindi, vola da una a tre volte utilizzando una delle seguenti condizioni, oscurità costante, 12 ore di luce seguite da 12 ore di buio o luce costante. Successivamente, seziona e colora il cervello usando tecniche standard. Per montare i cervelli di mosca, caricare una micropipetta con mezzo di montaggio e depositare due gocce da 2 microlitri al centro di un vetrino da microscopio a circa 2 cm di distanza.

Posizionare un vetrino coprioggetti su ogni goccia e lo spazio tra circa 0,2 mm. Quindi depositare 15 microlitri di terreno di montaggio sopra i vetrini coprioggetto e nella fessura. Sotto un microscopio da dissezione, depositare il cervello nella fessura della micropipetta.

E poi posizionare il cervello, con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Infine, attacca un vetrino coprioggetti e sigillalo lungo i bordi con uno smalto trasparente. I cervelli possono quindi essere visualizzati utilizzando tecniche standard per ricostituire le immagini 3D.

In questo caso, la luminescenza GFP è documentata in cellule con espressione attiva di Brp utilizzando il metodo star. Anche in questo esempio, gli assoni dei fotorecettori R7 e R8 sono stati immunolabled con anticiaoptin, che è stato osservato utilizzando anticorpi secondari marcati con RFP. Per quantificare il numero, la distribuzione e il livello di delocalizzazione del puncta Brp GFP, il primo carico ha ricostituito immagini 3D del cervello realizzate da pile di immagini.

I puncta Brp sono visualizzati in bianco. A questo punto, trovare la regione di interesse. In questo caso, i terminali dell'assone R8 si trovano seguendo l'assottigliamento degli assoni positivi all'anticiaoptin nel punto di ingresso nello strato midollare M3.

Su ciascun terminale dell'assone R8 identificare il puncta Brp GFP utilizzando il modulo di rilevamento spot. Seleziona aggiungi nuovi punti, quindi seleziona la regione di interesse solo per il segmento nelle impostazioni dell'algoritmo. Una volta definita la regione di analisi, impostare il canale sorgente su Brp GFP, quindi impostare il diametro XY stimato su 0,35 micron.

E poi, spunta la sottrazione dello sfondo nel rilevamento spot. Successivamente, seleziona la qualità come tipo di filtro e i puncta vengono filtrati automaticamente. Completare questo passaggio facendo clic su Fine.

Ripetere il metodo di rilevamento spot per tutti gli assoni R8 nel set di dati. La prossima regione da identificare è il citoplasma degli assoni. Innanzitutto, generare oggetti superficie con la funzione superficie.

Quindi, selezionare Aggiungi nuove superfici e, nelle impostazioni dell'algoritmo, attivare o disattivare la regione di interesse solo per il segmento. A questo punto, seleziona manualmente la regione di interesse. Quindi, imposta i perimetri di calcolo.

Per trovare il canale del fotorecettore come sorgente, selezionare l'opzione fluida. Per la soglia, selezionare l'intensità assoluta. Abilita l'opzione Dividi oggetti che toccano.

Imposta il diametro dei punti di seduta su 0,5 micron e utilizza le impostazioni predefinite del filtro per la qualità e il numero di voxel. Il filtro viene quindi applicato automaticamente. A questo punto, andare a modificare ed eliminare i pezzi di superficie generati al di fuori della regione di interesse.

In questo caso, gli altri assoni. Dopo aver ripetuto il rilevamento della regione assonica per tutti gli assoni R8 nel set di dati, tutti i punti Brp e gli assoni R8 vengono identificati come un insieme di oggetti spot. E le corrispondenti regioni citoplasmatiche sono identificate come oggetti di superficie.

A questo punto, procedere definendo manualmente l'orientamento e lo spazio di ciascun assone. Questo è importante per la successiva quantificazione della densità di Brp GFP lungo ciascun neurone nel neuropilo midollare. A tale scopo, definire innanzitutto i punti di inizio e di fine.

Seleziona aggiungi nuovi punti di misurazione, quindi seleziona modifica seguito da seleziona superficie dell'oggetto per lavorare con la parte superiore degli oggetti di superficie. Per definire i punti iniziali, posizionare i punti di misurazione su tutti gli oggetti di superficie degli assoni R nello strato M1. Posizionare questi punti in un ordine sistematico e riproducibile.

Quindi, definire i punti finali. Seleziona aggiungi nuovi punti di misurazione, modifica e riposiziona la superficie dell'oggetto. Quindi, ripetendo lo stesso ordine sistematico, posizionare i punti di misurazione sul fondo degli assoni R nello strato M3.

Per quantificare l'intensità di fondo Brp, analizzare le regioni citoplasmatiche di due assoni R7. Selezionare, aggiungi nuove superfici e definire manualmente la regione di un assone R7 come è stato fatto per gli assoni R8. Utilizzare impostazioni identiche, ma non attivare l'opzione Abilita dividi toccando gli oggetti.

Lasciare questa opzione. Quindi, aggiungere un oggetto macchie fittizie all'interno di una regione assonale R7 definita. Seleziona Aggiungi nuovi punti, quindi salta la creazione automatica e modifica manualmente.

Quindi, selezionare il centro dell'oggetto e fare clic sull'oggetto superficie per posizionare l'oggetto macchie fittizie all'interno dell'assone R7. A questo punto, ripetere i passaggi di rilevamento della superficie e del punto per un secondo assone R7. E poi definire i punti terminali di inizio e fine degli assoni R7 come fatto con gli assoni R8.

Per questa analisi, assicurarsi di avere installato il software corretto. Aprire il dataset contenente i dati spot, i dati delle superfici e due oggetti punto di misurazione, ciascuno contenente lo stesso numero di punti di misurazione. Ispezionare i dati.

Entrambi gli oggetti punto di misurazione devono avere lo stesso numero di punti di misurazione affinché i calcoli funzionino. Una volta definiti i punti, le regioni degli assoni e i punti di inizio e fine, avvia il plug-in. Innanzitutto, controlla i metadati, in particolare la dimensione del voxel.

Apri le proprietà dell'immagine da modifica, quindi controlla le 3 dimensioni del voxel e i micron sotto le coordinate in geometria. Quindi, selezionare un canale per l'analisi dell'intensità. In questo caso, viene selezionato il canale che mostra Brp GFP.

Quindi definisci il nome del file per i risultati. Quindi, definisci il numero di contenitori su 10 e imposta la lunghezza dell'assone su 100%Quindi definisci le regioni dei punti impostando il raggio dello spot su 0,35 micron e la regione citoplasmatica circostante su 50 micron. Infine, eseguire il comando di rilevamento delle sinapsi e, successivamente, analizzare statisticamente l'output.

Seguendo i protocolli descritti, i puncta Brp GFP sono stati analizzati nelle sinapsi R8 di moscerini esposti a buio costante, luce costante o a un normale ciclo luce/buio. Il numero di Brp puncta è risultato significativamente ridotto nei fotorecettori R8 dei moscerini mantenuti in luce costante. La distribuzione del puncta è stata calcolata utilizzando un plugin personalizzato.

sinapsi R8 erano distribuite lungo tutta la diafisi assonale dallo strato M1 a quello M3, ma la loro densità era maggiore agli strati M1 e M3. Allo stesso modo, sono stati calcolati i livelli di delocalizzazione dei puncta. Sono rimasti invariati in tutte le condizioni, tuttavia i livelli di delocalizzazione di Brp GFP differivano da quelli di altri reporter, come Brp-short-cherry che diventa chiaramente disinnescato sotto luce costante.

È possibile che vi sia un'elaborazione inappropriata del frammento breve Brp dopo lo smontaggio dalla zona di disponibilità. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come analizzare le proprietà plastiche sinaptiche in un singolo neurone. Tali proprietà plastiche includono il numero di sinapsi, la loro distribuzione e l'etichetta di arricchimento di uno specifico componente molecolare dopo le sinapsi.