Un sensore Aptamero-based per Unchelated gadolinio (III)

L'obiettivo generale di questo test basato sulla fluorescenza è rilevare la presenza di ione gadolinio tossico non chelato in soluzioni acquose contenenti agenti di contrasto per risonanza magnetica. Questo metodo può aiutare a facilitare gli agenti di contrasto MRI a base di gadolinio fornendo un mezzo per garantire un'elevata parità degli agenti sintetizzati. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è in grado di rilevare la concentrazione submicromolare di gadolinio tossico non chelato con una selettività relativamente elevata rispetto ad altri cationi metallici biologici.

Per iniziare questa procedura, preparare il tampone di analisi come descritto nel protocollo di testo. Utilizzando idrossido di sodio e acido cloridrico, regolare il pH a 7,4. Quindi, filtrare il tampone attraverso un filtro sterile monouso per flaconi con una membrana in PES da 0,2 micron.

Quindi, trasferire 497 microlitri del tampone del saggio in una nuova provetta per microcentrifuga. Aggiungere un microlitro di soluzione madre preparata di aptamero di gadolinio e due microlitri di soluzione madre preparata per QS. Trasferisci 50 microlitri di questa soluzione per sensori 2X Gadolinio in ciascuna delle nove provette PCR.

Successivamente, posizionare i tubi in un termociclatore. Impostare il termociclatore per riscaldare i campioni a 95 gradi Celsius per cinque minuti, quindi raffreddare lentamente le soluzioni a 25 gradi Celsius in 15 minuti. È importante ricordare di riscaldare le soluzioni del sensore 2X al gadolinio a 95 gradi, seguito da un lento raffreddamento a temperatura ambiente prima di aggiungere la soluzione di ioni gadolinio.

Per iniziare, sciogliere il tricloruro di gadolinio solido nel tampone di saggio per creare una soluzione madre di gadolinio tre della concentrazione desiderata. Utilizzando la diluizione seriale, preparare sei tre soluzioni di gadolinio da 100 microlitri come indicato nel protocollo di testo. Successivamente, sciogliere l'agente di contrasto da testare nel tampone di saggio.

Utilizzare la diluizione seriale per preparare tre diverse concentrazioni. Quindi, rimuovere le provette PCR contenenti la soluzione del sensore di gadolinio 2X dal termociclatore. Trasferire 50 microlitri di ciascuna soluzione di gadolinio tre in provette PCR separate.

Pipettare più volte ogni soluzione su e giù per mescolare. Quindi, trasferire separatamente 50 microlitri di ciascuna soluzione di agente di contrasto nelle restanti provette per PCR. Mescolare pipettando su e giù più volte.

Incubare tutte e nove le soluzioni per cinque minuti a temperatura ambiente. Successivamente, trasferire 45 microlitri di ciascuna soluzione in una piastra da 384 pozzetti in duplicati. Quindi, registra e analizza i dati di fluorescenza come indicato nel protocollo di testo.

In questo studio, lo ione gadolinio trivalente non chelato viene rilevato in soluzione acquosa utilizzando un metodo basato sulla fluorescenza. Il sensore fluorescente viene sviluppato collegando un fluoroforo all'aptamero. Il sensore viene quindi ibridato con un filamento di quenching, che viene etichettato con una molecola di quencher scuro.

L'aggiunta di gadolinio tre sposta il filamento di estinzione dall'aptamero, causando un aumento dell'emissione di fluorescenza. Le curve di calibrazione sono ottenute utilizzando 100 aptameri nanomolari di gadolinio e 200 nanomolari QS e tracciate la fluorescenza grezza o la variazione di piega della fluorescenza. Entrambe le curve mostrano un intervallo lineare per le concentrazioni di gadolinio tre al di sotto di un micromolare e la saturazione del segnale a concentrazioni superiori a tre micromolari.

Due diversi lotti di acido gadoterico vengono quindi analizzati per concentrazioni che vanno da zero millimolari a 20 millimolari. Mentre l'emissione di fluorescenza del campione ad alta purezza non aumenta notevolmente in questo intervallo, si osserva un cambiamento significativo nel campione contenente gadolinio tre non chelato a concentrazioni fino a cinque millimolari. Durante il tentativo di questa procedura, è importante assicurarsi che non ci siano bolle d'aria nei pozzetti della micropiastra, poiché ciò altererà la lettura della fluorescenza.

Utilizzando questa procedura, potremmo essere in grado di rilevare anche piccole quantità di ioni gadolinio calcolati in soluzioni contenenti agenti di contrasto. Questo sarà un buon metodo per determinare la purezza degli agenti. Lavorare con sostanze chimiche può essere pericoloso e prendere precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale è importante durante l'esecuzione di questa procedura.