Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti
11 maggio 2017
Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.
Gli obiettivi generali di questo approccio sperimentale sono, in primo luogo, caratterizzare morfologicamente e biochimicamente gli ovociti di cavallo e, in secondo luogo, confrontare i gameti dello stesso animale che sono stati processati in vitro o in vivo. Questo approccio sperimentale può aiutare a rispondere a domande chiave sulla biologia degli ovociti e sulla fertilità nelle specie monovulatorie. Potrebbe anche migliorare la sicurezza delle procedure di manipolazione dei gameti.
Questo approccio è stato sviluppato per superare la limitata disponibilità di campioni di ovociti, in particolare da specie monovulatorie. A dimostrare le procedure dell'OPU saranno il professor Stefan Deleuze dell'Università di Liegi, Cecile Douet, responsabile del mio laboratorio, e Fabrice Reigner, responsabile dell'unità equina presso l'INRA Centre Val de Loire. Su base giornaliera, valutare il diametro dei follicoli ovarici in una coorte di cavalle adulte utilizzando l'ecografia.
Cerca un follicolo grande con un diametro maggiore di 33 millimetri. Una volta trovato, preparati a iniettare 1.500 unità di gonadotropina corionica umana per indurre la maturazione dell'ovocita in un follicolo dominante. Quindi, individuare il solco giugulare e tamponare il sito di iniezione con alcol.
Quindi, per far salire la vena, applicare una certa forza due o tre centimetri sotto il sito di iniezione. Inserire l'ago quasi parallelamente al collo, aspirare leggermente per assicurarsi che l'ago sia nella vena e iniettare l'ormone. Preparare una sonda ecografica per l'accesso vaginale.
Quindi, collegare l'ago a un sistema di aspirazione. 35 ore dopo l'iniezione di hCG, impostare la strumentazione per l'OPU e sedare la cavalla. Una buona analgesia è estremamente importante per la sicurezza dell'animale e dell'operatore.
Un animale che non avverte dolore o disagio consentirà la manipolazione dell'ovaio, rendendo più facili l'esecuzione di punture e vampate. Una volta inserita la sonda dell'ago, un operatore deve manipolare l'ovaio in modo che sia rivolto verso la sonda mentre l'altro operatore manipola l'ago. Individuare il follicolo dominante nell'immagine ecografica.
Quindi, usa l'ago per perforare la parete vaginale e la parete del follicolo dominante. Una volta effettuato l'accesso allo spazio follicolare, aspirare il liquido follicolare. Ruotare l'ago per raschiare la parete follicolare e attaccare il complesso cumulo-ovocita.
Quindi, versare il fluido in una grande capsula di Petri. E sotto uno stereoscopio, cerca il COC. Nel frattempo, sciacquare il follicolo con il PBS modificato di Dulbecco caldo contenente eparina.
Potrebbero essere necessari diversi getti per raccogliere il COC. Dopo aver trovato il COC, cambiare l'ago con un ago a doppio lume e raccogliere i COC immaturi da tutti i follicoli che hanno un diametro compreso tra cinque e 25 millimetri. Questi saranno utilizzati per la maturazione in vitro.
Una volta aspirati tutti i follicoli di un'ovaia, ripetere le stesse procedure per raccogliere i COC immaturi dall'altra ovaia. Ora, scegli tra i COC. Conserva solo COC con diversi strati completi di cellule cumuliformi e un ooplasma marrone finemente granulato.
Scartare gli altri. Al termine della procedura, iniettare alla cavalla 15.000 unità di benzil-penicillina per prevenire l'infezione. Quindi, ospita la cavalla in una stalla tranquilla e pulita per almeno due ore mentre si riprende.
Prima dell'inizio dell'OPU, scaldare un flacone di TCM-199 tamponato con HEPES a 37 gradi Celsius. Quindi, preparare il mezzo IVM. Erogare 500 microlitri di TCM-199 tamponato con bicarbonato di sodio integrato nei pozzetti di una capsula a quattro pozzetti.
Quindi, incubare la capsula a 38,5 gradi Celsius per almeno due ore. Trasferire i COC immaturi recuperati in un piatto di 3,5 centimetri riempito con due millilitri di HEPES TCM-199 riscaldato. Sposta i COC attraverso diverse regioni del piatto per lavare via delicatamente i detriti circostanti.
Ora, trasferisci i COC nel terreno IVM e incubali per 28 ore a 38,5 gradi Celsius. Per eseguire un conteggio cromosomico su COC maturi, incubarli in monastrolo da 100 micromolari per un'ora a 38,5 gradi Celsius. Successivamente, rimuovere le cellule del cumulo trattando i COC con ialuronidasi allo 0,5% in TCM-199 tamponato con HEPES.
Monitora questa reazione su un palco riscaldato impostato a 38 gradi Celsius. Entro circa cinque minuti, rimuovi tutte le cellule. Utilizzare un pipettaggio delicato per rimuovere le ultime cellule ostinate.
Quindi, rimuovere la zona pellucida utilizzando lo 0,2% di pronasi in TCM-199 tamponato con HEPES. Monitora questa reazione anche su un palco riscaldato. Il completamento dovrebbe richiedere circa cinque minuti.
Quindi, fissare gli ovociti in paraformaldeide al 4% in DPBS per 15 minuti a 38,5 gradi Celsius, seguiti da altri 45 minuti di fissazione a quattro gradi Celsius. Dopo la fissazione, lavare gli ovociti trasferendoli in sequenza tra tre pozzetti di alcol polivinilico allo 0,1% in DPBS. Utilizzare circa mezzo millilitro di soluzione per pozzetto.
Quindi, trasferire gli ovociti in un pozzetto riempito con Triton X-100 allo 0,3% in PBS e lasciarli incubare per 10 minuti a temperatura ambiente. Per bloccare i segnali non specifici, immergere le cellule in DPBS con l'1% di BSA e il 10% di siero d'asino normale. Incubare le cellule per almeno 30 minuti a temperatura ambiente.
Dopo 30 minuti, applicare l'anticorpo primario, quindi incubare le cellule a quattro gradi Celsius durante la notte. Il giorno seguente, lavare gli ovociti e applicare l'anticorpo secondario per un'ora a temperatura ambiente, al riparo dall'esposizione alla luce. Dopo aver applicato il secondario, lavare nuovamente gli ovociti.
Quindi, prima del montaggio, attaccare strisce di nastro biadesivo ai vetrini per fungere da supporti per vetrini. Ora, montare gli ovociti da tre a quattro per diapositiva in una goccia di terreno di montaggio non indurente e antisbiadimento integrato con 20 micromolari di YO-PRO-1. Lasciare riposare gli ovociti per circa 10 minuti, quindi applicare i vetrini.
Utilizzando la maturazione in vitro, 37 dei 44 COC raccolti da follicoli non dominanti sono stati maturati in metafase II. Gli ovociti maturati in vitro erano spesso affetti da aneuploidia, per lo più iperploidia. Questo non è stato osservato negli ovociti maturati in vivo.
Successivamente, sono state misurate la lunghezza del mandrino da polo a polo e il diametro del mandrino al massimo. Gli ovociti maturati in vitro erano significativamente più lunghi e larghi rispetto agli ovociti maturati in vivo. Negli stessi campioni, è stato misurato il livello globale di acetilazione di H4K16.
I risultati sono stati quelli attesi. L'acetilazione di H4K16 è risultata significativamente più bassa negli ovociti maturati in vitro rispetto agli ovociti maturati in vivo. Un team ben addestrato può processare cinque cavalle in una mattinata di OPU con un tasso di recupero dell'80% per l'ovocita preovulatorio e dal 50 al 60% di recupero degli ovociti immaturi.
Durante l'OPU, monitora sempre l'aspetto e il benessere dell'animale e sii pronto a fornire cure veterinarie adeguate, se necessario. L'approccio sperimentale può essere applicato anche agli ovociti di altre specie ed è particolarmente applicabile dove la disponibilità di campioni è un problema, come con gli esseri umani. Sulla base dei nostri risultati, è necessario intraprendere studi per comprendere meglio le condizioni di coltura necessarie per una corretta segregazione cromosomica e cambiamenti epigenetici.
L'obiettivo generale è quello di migliorare l'efficienza della maturazione in vitro sia per la medicina veterinaria che per il trattamento della fertilità umana.
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Panoramica
Questo manoscritto presenta un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente gli ovociti equini. Vengono descritti il recupero di ovociti equini immaturi e maturi mediante aspirazione ovocitaria guidata da ultrasuoni (OPU) e l'analisi della segregazione cromosomica, della morfologia del fuso, dell'acetilazione globale degli istoni e dell'espressione di mRNA.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia dell'ovocita
- Fertilità nelle specie monovulatorie
- Procedure di manipolazione dei gameti
Sfondo
- Comprendere le caratteristiche degli ovociti è fondamentale per la ricerca sulla fertilità.
- Le specie monovulatorie hanno una disponibilità limitata di ovociti.
- La PUV guidata da ultrasuoni può migliorare il prelievo dei campioni.
- Un'analisi comparativa dei gameti trattati in vitro e in vivo è essenziale.
Scopo dello studio
- Caratterizzare morfologicamente e biochimicamente gli ovociti equini.
- Confrontare i gameti provenienti dallo stesso animale elaborati in ambienti diversi.
- Migliorare la sicurezza nelle procedure di manipolazione dei gameti.
Metodi Utilizzati
- Prelevamento degli ovociti guidato da ultrasuoni (OPU) per la raccolta degli oociti.
- Valutazione del diametro dei follicoli ovarici nelle cavalle adulte.
- Indagine sulla segregazione cromosomica e sulla morfologia del fuso.
- Analisi dell'acetilazione globale degli istoni e dell'espressione dell'mRNA.
Risultati principali
- Corretta raccolta di ovociti equini immaturi e maturi.
- Informazioni sulla segregazione cromosomica e sulla morfologia del fuso.
- Dati sui livelli globali di acetilazione degli istoni.
- Sono stati stabiliti i profili di espressione degli mRNA rilevanti.
Conclusioni
- Lo studio fornisce un quadro di riferimento per la caratterizzazione degli ovociti nei cavalli.
- I risultati potrebbero migliorare la comprensione della fertilità nelle specie monovulatorie.
- Le tecniche di OPU possono migliorare la sicurezza della manipolazione dei gameti.
Domande Frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
La caratterizzazione della biologia degli ovociti in specie monovulatorie affronta un collo di bottiglia critico nella ricerca e sviluppo riproduttiva, dove la limitata disponibilità di campioni ostacola gli studi meccanicistici. Questo approccio consente un'analisi comparativa degli effetti della maturazione in vitro rispetto a quella in vivo sull'integrità cromosomica e sulla regolazione epigenetica, fornendo indicazioni predittive per l'ottimizzazione delle condizioni di coltura. Tali dati contribuiscono a ridurre i rischi delle tecnologie di riproduzione assistita identificando aneuploidie e difetti del fuso indotti dalla coltura prima della traduzione clinica.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi dei meccanismi di fedeltà meiotica quantificando l'incidenza di aneuploidia come indicatore funzionale della competenza nel corretto appaiamento cromosomico.
- Valore scientifico: Il profilo di acetilazione degli istoni (H4K16) associa lo stato epigenetico alla morfologia del fuso, supportando la validazione di bersagli nelle vie HDAC/HAT durante la maturazione dell'ovocita.
- Valore operativo: Fornisce un quadro citologico standardizzato per la valutazione dei parametri di qualità dell'ovocita, applicabile tra diverse specie anche in caso di limitata disponibilità di ovociti.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: I parametri morfometrici quantitativi dei cromosomi e del fuso definiscono metriche oggettive e riproducibili per la valutazione delle condizioni di coltura di maturazione.
- Valore operativo: I protocolli di immunomarcatura per la tubulina e le istoni acetilati generano saggi trasferibili per lo screening ad alto contenuto di modificatori epigenetici.
- Valore scientifico: L'analisi della stabilità dell'mRNA mediante qPCR in condizioni di silenzio trascrizionale fornisce informazioni per l'identificazione di target regolatori post-trascrizionali.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Il confronto diretto tra ovociti maturati in vitro e in vivo provenienti dallo stesso animale isola gli effetti specifici della coltura, aumentando la rilevanza traslazionale dei modelli preclinici.
- Valore operativo: Stabilisce valori di riferimento per le dimensioni del fuso e le soglie di acetilazione per definire stati fisiologici di maturazione in specie con vincoli monovulatori.
- Valore scientifico: I dataset sulle modifiche istoniche supportano la scoperta di biomarcatori per la previsione della competenza ovocitaria nei percorsi di riproduzione assistita.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo metodo si inserisce nella fase di biologia della scoperta, in cui informazioni meccanicistiche sulla qualità dei gameti guidano la validazione degli obiettivi a monte e lo sviluppo di saggi a valle per terapie riproduttive.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulla disregolazione epigenetica indotta dalla coltura e sul suo impatto sulla fedeltà del segregamento cromosomico.
- Screening: Fornisce letture quantitative standardizzate (numero di cromosomi, morfometria del fuso, livelli di acetilazione) per valutare gli effetti di composti o condizioni sulla maturazione degli ovociti.
- Analisi: Genera output misurabili (tassi di aneuploidia, intensità di H4K16, dimensioni del fuso) che consentono confronti statistici tra gruppi sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati ottenuti in vitro a parametri di riferimento in vivo, riducendo il rischio di estrapolazione specifica della specie nello sviluppo di modelli preclinici della fertilità.
- Riutilizzo aziendale: I protocolli OPU e di fissazione creano una piattaforma riutilizzabile per la caratterizzazione degli ovociti, applicabile ad altre specie monovulatorie soggette a scarsità di campioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella sicurezza del protocollo di maturazione grazie al collegamento diretto tra le condizioni di coltura e le metriche di integrità epigenetica e cromosomica.
- Valore operativo: Procedure standardizzate per la raccolta e la lavorazione degli ovociti migliorano la riproducibilità tra laboratori e specie.
- Valore strategico: La rilevazione precoce di difetti meiotici indotti dalla coltura riduce il rischio di fallimenti in fasi avanzate dello sviluppo delle tecnologie riproduttive assistite.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione basata sui dati delle formulazioni dei mezzi di maturazione in base a soglie di aneuploidia e normalità del fuso.
Considerazioni sull'implementazione
- È richiesta esperienza nella manipolazione degli ovociti, nella micromanipolazione e nella microscopia a fluorescenza per un'analisi accurata di cromosomi e fuso.
- La microscopia confocale a scansione laser e i sistemi con piattaforma riscaldata sono essenziali per la fissazione e l'acquisizione temporizzata delle strutture meiotiche.
- La standardizzazione tra laboratori nella validazione degli anticorpi (tubulina, H4K16ac) e nei protocolli di montaggio garantisce risultati quantitativi confrontabili.
- L'adattamento a specie diverse richiede l'ottimizzazione delle soglie dimensionali dei follicoli per la PUV e della somministrazione ormonale in base alla fisiologia riproduttiva.
- Le limitazioni includono la bassa resa di ovociti per sessione e l'impossibilità di valutare l'attività trascrizionale a causa del silenziamento globale durante la maturazione, spostando l'attenzione sulla regolazione post-trascrizionale.
