Una procedura completa per valutare il In Vivo Prestazioni del Cancro nanomedicina

L'obiettivo generale di questa procedura è valutare il comportamento in vivo di nanofarmaci antitumorali a livello sistemico, tissutale, di singola cellula e subcellulare in topi portatori di tumore e immunocompetenti. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo della nanomedicina del cancro. In che modo le nanomedicine si accumulano quantitativamente nei diversi tessuti degli animali viventi nel tempo?

Il vantaggio principale di questa tecnica è che questo approccio a doppia marcatura consente la caratterizzazione in vivo della nanomedicina dal livello macroscopico a quello microscopico. Scegliamo i liposomi come esempio per dimostrare la nostra procedura perché i liposomi sono attualmente in uso clinico e sono anche una piattaforma comune per le nanomedicine sperimentali. Per iniziare la procedura, sciogliere 20 milligrammi di una miscela lipidica, che include lo 0,1% per mole di un colorante fluorescente cationico lipofilo e due millilitri di cloroformio.

Quindi, asciugare i lipidi con un evaporatore rotante. Aggiungere 20 millilitri di soluzione salina tamponata con fosfato ai lipidi essiccati. Sonicare la miscela sul ghiaccio con un sonicatore a sonda da 3,8 millimetri a 30 watt per 30 minuti, mantenendo la miscela tra i quattro e i 20 gradi Celsius per tutto il tempo.

Centrifugare la sospensione di nanoparticelle liposomiali risultante a 4.000 G per 10 minuti. Scartare il pellet e lavare i liposomi con PBS, utilizzando un'unità di filtro centrifugo MWCO da 100 kilodalton a 4000 G.Trasferire i liposomi concentrati dalla camera superiore a una nuova provetta da centrifuga. I liposomi possono essere conservati in PBS in frigorifero per un massimo di una settimana.

Eseguire la diffusione dinamica della luce su una miscela di 50 microlitri di sospensione liposomica purificata e 950 microlitri di PBS. Misurare le dimensioni delle particelle e determinare la distribuzione delle dimensioni. Per iniziare la procedura di radiomarcatura, trasferire in una provetta da 1,5 millilitri, il volume necessario di liposomi purificati e PBS, per ottenere due milligrammi di lipidi.

A questo si aggiunge un millicurie di ossalato di zurconio-89 per un volume finale di 100 microlitri e un pH compreso tra 6,9 e 7,1. Mescolate il composto a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi, rimuovere lo zirconio-89 libero mediante filtrazione centrifuga con un'unità filtrante da 100 kilodalton a 4.000 G.Lavare il retentato con PBS sterile tre volte a 4.000 G.Quindi, diluire il retentato a circa tre microcurie per microlitro per l'iniezione.

Utilizzare l'HPLC ad esclusione dimensionale abbinato a un rivelatore di radiazioni per determinare la purezza radiochimica dei liposomi radiomarcati. Se la purezza radiochimica è inferiore al 95%, riformulare la dose. Utilizzare la diffusione dinamica della luce per confermare che i valori di dimensione e distribuzione delle particelle siano simili a quelli dei liposomi non radiomarcati.

Per iniziare la procedura di imaging, iniettare circa 300 microcurie di liposomi radiomarcati nella vena caudale di un topo melanoma trattenuto. Due minuti dopo l'iniezione, utilizzare una siringa da insulina calibro 28 per raccogliere da 10 a 20 microlitri di sangue dalla vena caudale del topo. Trasferire il campione di sangue in una provetta per conteggio pre-pesata.

Pesare il campione di sangue e misurare l'attività con un contatore gamma. Calcolare la concentrazione di radioattività come percentuale della dose iniettata per grammo. Quindici minuti dopo l'iniezione, raccogliere e misurare un altro campione di sangue allo stesso modo.

Quindi, anestetizzare il topo mediante somministrazione di isoflurano al 2% e ossigeno attraverso un cono. Raccogliere e misurare un terzo campione di sangue un'ora dopo l'iniezione. Quindi, lasciare che il topo si riprenda in una gabbia di recupero fino a quando non è stata riacquistata la normale mobilità.

Raccogliere ulteriori campioni quattro, otto, 24 e 48 ore dopo l'iniezione. Lasciare che il mouse si riprenda completamente tra un'iniezione e l'altra. Ospitare il topo in una stanza destinata agli animali ai quali sono stati somministrati materiali radioattivi.

A 24 o 48 ore dall'iniezione del liposoma, anestetizzare il topo con isoflurano al 2% e ossigeno. Posiziona il topo sulla pancia su un letto per scanner microPET-CT per piccoli animali. Continuare a erogare il 2% di isoflurano e ossigeno attraverso un cono nasale.

Applicare un unguento veterinario sugli occhi del topo per evitare che si secchino. Quindi, spostare il piano dello scanner nello strumento. Esegui una scansione statica PET di 15 minuti su tutto il corpo con almeno 50 milioni di eventi coincidenti, con un'energia da 250 a 700 kiloelettronvolt e una finestra di temporizzazione di coincidenza di sei nanosecondi.

Successivamente, eseguire una TAC di cinque minuti con 120 passi di rotazione superiori a 220 gradi, con circa 145 millisecondi per fotogramma. Dopo il completamento della scansione, sacrificare immediatamente il topo per asfissia da anidride carbonica. Confermare la morte pizzicando la zampa dell'animale, quindi eseguire la lussazione cervicale.

Perfondere i tessuti con PBS per rimuovere il sangue e raccogliere i campioni di tessuto pertinenti. Pesare i tessuti raccolti e misurarne l'attività. Calcolare l'accumulo di liposomi radiomarcati nel tessuto come percentuale della dose iniettata per grammo.

Conservare il tessuto tumorale in PBS freddo. Eseguire la citometria a flusso ex vivo e l'imaging in immunofluorescenza sul tessuto tumorale raccolto per misurare l'accumulo rispetto alle popolazioni cellulari. L'imaging PET/CT di topi portatori di tumore iniettati con nanoparticelle marcate con zirconio-89 ha mostrato un significativo accumulo di nanaparticelle nel tessuto tumorale 24 ore dopo l'iniezione.

L'emivita ematica delle nanoparticelle è stata determinata in circa 10 ore. Le misurazioni della biodistribuzione ex vivo a 24 ore dopo l'iniezione erano coerenti con le misurazioni PET/CT in vivo. L'accumulo di nanoparticelle è stato quindi studiato a livello di singola cellula con tecniche di immunocolorazione.

La citometria a flusso ha indicato che le nanoparticelle si accumulano preferenzialmente nei macrofagi assistiti dal tumore. L'imaging in immunofluescenza di campioni tumorali ha anche indicato un targeting specifico delle cellule endoteliali da parte delle nanoparticelle. Questa tecnica può aiutare i ricercatori a identificare nanofarmaci promettenti per la traduzione clinica.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre giorni se eseguita correttamente. Quando si radiomarcano i nanofarmaci, è importante applicare elevati standard di controllo della qualità. Seguendo questa procedura, altre nanomedicine, come nanoemulsioni, nanoparticelle polimeriche, micelle, anticorpi e frammenti di anticorpi, possono essere marcate al fine di misurare le loro prestazioni in vivo in topi portatori di tumore.