Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una valutazione multidimensionale di come i composti influenzino la sopravvivenza di M.tuberculosis all'interno dei macrofagi umani. Questo metodo si basa su un saggio di efficacia basato sulla luciferasi. Combinato con un saggio di citotossicità e un saggio di MIC, può fornire informazioni utili per la modifica dei composti HIT nello sviluppo di farmaci contro la tubercolosi.

Il vantaggio principale del nostro metodo è che consente un risparmio di tempo e di lavoro. Esso sostituisce un saggio dell'unità formante colonie (CFU) con un saggio basato sulla luciferasi. In generale, le persone nuove rispetto a questa tecnica avranno difficoltà a mantenere la costanza nelle operazioni di pipettaggio manuale anziché automatizzato.

Una tecnica di pipettaggio costante è fondamentale. Coltivare le cellule THP1 in RPMI in mezzo completo, mantenendo una densità cellulare compresa tra 0,2 e un milione di cellule per millilitro di mezzo tra un passaggio e l'altro.

Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'OD600 di una sospensione batterica in crescita attiva. Calcolare quindi la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 OD600 pari a tre per 10 alla settima batteri per millilitro. Pipettare una quantità sufficiente di batteri per un MOI di 10 a 1 in un nuovo tubo da centrifuga.

Quindi, centrifugare i batteri a 3.000 ×g per 10 minuti. Per opsonizzare i batteri, aggiungere 50 microlitri di siero umano a 450 microlitri di RPMI 1640 e utilizzare la soluzione per risospendere il pellet batterico a una densità di 1 × 10⁸ batteri per 500 microlitri di mezzo. Lasciare incubare la miscela a 37 °C per 30 minuti.

Successivamente, utilizzando un emocitometro e un microscopio invertito, determinare la densità della coltura cellulare THP1. Quindi, in provette da centrifuga sterili, pellettare le cellule a 100 × g a 37 °C per 10 minuti. Aspirare il sopranatante e risospendere le cellule in mezzo RPMI completo a una densità di un milione di cellule per millilitro.

Aggiungere PMA fino a una concentrazione finale di 40 nanogrammi per millilitro. Questa è la miscela di differenziamento. Combinare *M. tuberculosis* opsonizzato con la miscela di differenziamento THP1 a un MOI di 10 a 1.

E aliquotare la miscela finale in 100 microlitri per pozzetto in una piastra bianca a 96 pozzetti con fondo piatto. Quindi lasciare differenziare e infettare in incubazione a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica per tutta la notte. Il giorno seguente, utilizzare 100 microlitri di RPMI per lavare i pozzetti due volte.

Quindi aggiungere composti diluiti alle concentrazioni desiderate e RPMI nel mezzo completo. Incubare le piastre per tre giorni. Quando si utilizzano pipette multicanale, ricordarsi di eseguire un'azione lenta e costante sul pistone e di posizionare sempre le punte della pipetta nello stesso punto all'interno di ogni pozzetto per minimizzare il disturbo alle cellule THP1.

Al termine dell'incubazione, aspirare il mezzo dalle pozzette e aggiungere 50 microlitri di reagente per il saggio della luciferasi in ciascuna pozzetta. Quindi sigillare le piastre utilizzando sigillanti adesivi trasparenti. Incubare le piastre a 22 gradi Celsius per cinque minuti, quindi utilizzare un luminometro per ottenere una lettura di un secondo per pozzetta.

Per differenziare le cellule THP1, dopo aver preparato il mix di differenziazione come mostrato precedentemente in questo video, distribuire 100 microlitri del mix di differenziazione in ogni pozzetto di una piastra trasparente a 96 pozzetti contenente le cellule. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con anidride carbonica al 5% per tutta la notte. Il giorno seguente, aspirare il mezzo dai pozzetti e lavarli due volte con RPMI 1640.

Aggiungere 100 microlitri di composti diluiti in RPMI incompleto nei pozzetti. Successivamente, incubare le cellule per tre giorni. Sciogliere 0,5 grammi di MTT in 100 millilitri di PBS per preparare una soluzione madre di cinque milligrammi per millilitro.

Quindi filtrare e sterilizzare la soluzione. Due ore e mezza prima della fine del periodo di incubazione di tre giorni, aggiungere 25 microlitri di soluzione di MTT in ogni pozzetto cellulare e completare il periodo di incubazione. Preparare il dimetilformammide al 50%NN o DMF mescolando 250 millilitri di DMF con 250 millilitri di acqua deionizzata.

Preparare il buffer di estrazione MTT come segue. Versare 100 grammi di SDS in un recipiente da 500 millilitri e aggiungere 300 millilitri di DMF al 50%. Applicare un leggero riscaldamento per consentire la dissoluzione del SDS.

Aggiungere 10 millilitri di acido acetico puro e 12,5 millilitri di acido cloridrico uno molare. Successivamente, utilizzare DMF al 50% per portare il volume fino al segno di 500 millilitri. Al termine del periodo di trattamento, aggiungere 100 microlitri di buffer di estrazione in ogni pozzetto.

Incubare la miscela a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica per tutta la notte. Il giorno seguente, leggere l'assorbanza a 570 nanometri. Per eseguire un saggio con resazurina, coltivare M.tuberculosis in 7H9 ADST fino alla fase esponenziale media.

Diluire la coltura con 7H9 ADST fino a un OD600 di 0,01. Utilizzare 7H9 ADST per diluire i composti a due volte le concentrazioni di prova. Aliquotare quindi 100 microlitri di ciascun composto diluito in ogni pozzetto di una piastra chiara a 96 pozzetti.

Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ogni pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato per cinque giorni. Sciogliere 10 milligrammi di resazurina in 100 millilitri di acqua deionizzata.

E filtrare il soluzione attraverso un filtro sterile. Aggiungere 30 microlitri di soluzione di resazurina nei pozzetti. Quindi incubare le cellule per 48 ore.

La crescita batterica è indicata da una variazione di colore da blu a rosa. Eseguire l'analisi quantitativa secondo il protocollo descritto nel testo. Questo diagramma a dispersione mostra i dati grezzi di luminescenza misurati in unità di luminescenza relativa per il trattamento con diverse concentrazioni di rifampicina su cellule di M.tuberculosis e THP1.

In questo grafico viene mostrata la riduzione percentuale e la luminescenza nei pozzetti trattati rispetto ai pozzetti non trattati. La rifampicina è in grado di ridurre il 99,9% delle unità di luce relative, o RLUs, del M. tuberculosis intracellulare a una concentrazione di 0,1 microgrammi per millilitro. Risultati simili a quelli pubblicati in precedenza e determinati da CFU.

In questa figura viene illustrata la citotossicità causata da concentrazioni crescenti di G1-1H utilizzate nel saggio MTT. Le concentrazioni di 10 e tre micromolari sono chiaramente al di sotto della soglia di IC 50. Questa figura mostra gli effetti di diverse concentrazioni dell'antibiotico apramicina sulla conversione del resazurina da parte di M. tuberculosis.

La MIC90 in brodo era compresa tra 2,5 e cinque microgrammi per millilitro. Questo valore è leggermente superiore rispetto al valore precedentemente pubblicato di 1,5 microgrammi per millilitro. Tuttavia, rientra comunque pienamente nel range accettabile.

Come dimostrato qui, l'evaporazione diventa significativa per tutti gli esperimenti con tempi di incubazione prolungati. Pertanto, è necessario prestare attenzione a mantenere gli incubatori ben umidificati per evitare inconsistenze. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire dati intracellulari affidabili già in soli quattro giorni.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di trattare con delicatezza le cellule THP1 e di essere costanti nel pipettaggio se si opera senza automazione. Dopo questa procedura, altri metodi come lo screening ad alto contenuto informativo possono essere utilizzati per determinare se i composti attivi sono batteriostatici o battericidi. Dopo il suo sviluppo, questo protocollo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci antitubercolari per valutare rapidamente l'efficacia dei composti contro il MTB all'interno dei macrofagi umani.

Non dimenticare che lavorare con microbacterium tuberculosis è pericoloso. Utilizza precauzioni e attrezzature adeguate quando manipoli questo microrganismo.