Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare Mycobacterium tuberculosis

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una valutazione multidimensionale di come i composti influenzano la sopravvivenza di M. tuberculosis all'interno dei macrofagi umani. Questo metodo è incentrato su un test di efficacia basato sulla luciferasi. Se combinato con la citotossicità, un test MIC può fornire informazioni utili sulla modifica dei composti HIT nello sviluppo di farmaci per la tubercolosi.

Il vantaggio principale del nostro metodo è che consente di risparmiare tempo e manodopera. Sta sostituendo un saggio dell'unità formante colonie CFU con un test basato sulla luciferasi. In generale, le persone che non conoscono questa tecnica avranno difficoltà a trovare la coerenza con il pipettaggio manuale anziché con l'automazione.

Una tecnica di pipettaggio coerente è fondamentale. Coltivare cellule THP1 in RPMI in terreno completo. Mantenendo una densità cellulare compresa tra 0,2 e un milione di cellule per millilitro di terreno tra i passaggi.

Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'OD600 di una sospensione batterica in crescita attiva. Quindi calcolare la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 OD600 equivale a tre volte 10 al settimo batterio per millilitro. Pipettare una quantità sufficiente di batteri per un MOI di 10 a uno in una nuova provetta da centrifuga.

Quindi pellettare i batteri a 3.000 volte G per 10 minuti. Per opsonizzare i batteri, aggiungere 50 microlitri di siero umano a 450 microlitri di RPMI 1640 e usarlo per risospendere il pellet batterico a una densità di uno volte 10 all'ottavo batterio per 500 microlitri di terreno. Lasciare incubare la miscela a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, utilizzando un emocitometro e un microscopio invertito, determinare la densità della coltura cellulare THP1. Quindi, in provette da centrifuga sterili, pellettare le celle a 100 volte G a 37 gradi Celsius per 10 minuti. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI in terreno completo ad una densità di un milione di cellule per millilitro.

Aggiungere PMA a una concentrazione finale di 40 nanogrammi per millilitro. Questo è un mix di differenziazione. La combinazione di M. tuberculosis opsonizzato con differenziazione THP1 si mescola con un MOI di 10 a uno.

E aliquotare la miscela finale a 100 microlitri per pozzetto in una piastra bianca a fondo piatto da 96 pozzetti. Quindi lasciare che la differenziazione e l'infezione incubino a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica per una notte. Il giorno seguente, utilizzare 100 microlitri di RPMI per lavare i pozzetti due volte.

Quindi aggiungere i composti diluiti alle concentrazioni desiderate e l'RPMI in mezzo completo. Incubare le piastre per tre giorni. Quando si utilizzano pipette multicanale, ricordarsi di esercitare un'azione lenta e costante dello stantuffo e di far atterrare sempre i puntali della pipetta nello stesso punto all'interno di ciascun pozzetto per ridurre al minimo il disturbo alle cellule THP1.

Dopo l'incubazione, aspirare il terreno dai pozzetti e aggiungere 50 microlitri di reagente per il dosaggio della luciferasi a ciascun pozzetto. Quindi utilizzare sigillanti per piastre adesive trasparenti per sigillare le piastre. Incubare le piastre a 22 gradi Celsius per cinque minuti, quindi utilizzare un luminometro per ottenere una lettura a un secondo per pozzetto.

Per differenziare le cellule THP1, dopo aver preparato la miscela di differenziazione come dimostrato in precedenza in questo video, erogare 100 microlitri della miscela di differenziazione in ciascun pozzetto di una piastra di cellule limpida da 96 pozzetti. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato con il 5% di anidride carbonica durante la notte. Il giorno seguente, aspirare il terreno dai pozzetti e utilizzare RPMI 1640 per lavarli due volte.

Aggiungere ai pozzetti 100 microlitri di composti diluiti in RPMI incompleti. Quindi, incubare le cellule per tre giorni. Sciogliere 0,5 grammi di MTT in 100 millilitri di PBS per ottenere una soluzione madre di cinque milligrammi per millilitro.

Quindi filtrare sterilizzare la soluzione. Due ore e mezza prima della fine del periodo di incubazione di tre giorni, aggiungere 25 microlitri di soluzione MTT a ciascun pozzetto di cellule e completare il periodo di incubazione. Preparare il 50% di NN dimetilformammide o DMF mescolando 250 millilitri di DMF con 250 millilitri di acqua deionizzata.

Preparare il buffer di estrazione MTT come segue. Adagiare 100 grammi di SDS in una bottiglia da 500 millilitri e aggiungere 300 millilitri di DMF al 50%. Applicare a fuoco basso per consentire alla SDS di sciogliersi.

Aggiungere 10 millilitri di acido acetico puro e 12,5 millilitri di acido cloridrico molare. Quindi, utilizzare il 50% di DMF per riempire la bottiglia fino a 500 millilitri. Al termine del periodo di trattamento, aggiungere 100 microlitri di tampone di estrazione a ciascun pozzetto.

Incubare la miscela a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica per una notte. Il giorno seguente, leggere l'assorbanza a 570 nanometri. Per eseguire un test della resazurina, coltivare M. tuberculosis in 7H9 ADST fino alla fase midlock.

Diluire la coltura con 7H9 ADST a un OD600 di 0,01. Utilizzare 7H9 ADST per diluire i composti a due volte le concentrazioni di prova. E aliquotare 100 microlitri di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto di una piastra trasparente a 96 pozzetti.

Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius in un'incubatrice umidificata per cinque giorni. Sciogliere 10 milligrammi di resazurina in 100 millilitri di acqua deionizzata.

E il filtro sterilizza la soluzione. Aggiungere 30 microlitri di soluzione di resazurina ai pozzetti. Quindi incubare le cellule per 48 ore.

La crescita batterica è indicata da una conversione del colore dal blu al rosa. Effettuare analisi quantitative secondo il protocollo di testo. Questo grafico a dispersione mostra i dati grezzi di luminescenza misurati in unità di luminescenza relative per il trattamento di varie concentrazioni di rifampicina su cellule M.tuberculosis e THP1.

In questo grafico, viene mostrata la percentuale di riduzione e luminescenza nei pozzetti trattati rispetto ai pozzetti non trattati. La rifampicina è in grado di ridurre il 99,9% delle unità di luce relativa, o RLU, da M.tuberculosis intracellulare a una concentrazione di 0,1 microgrammi per millilitro. Simile ai risultati precedentemente pubblicati determinati da CFU.

In questa figura viene illustrata la citotossicità causata dall'aumento delle concentrazioni di G1-1H utilizzate nel test MTT. Le concentrazioni di 10 e tre micromolari sono chiaramente al di sotto del cutoff IC 50. Questa figura mostra gli effetti di varie concentrazioni dell'antibiotico apramicina sulla conversione della resazurina da parte di M. tuberculosis.

Il MIC90 in brodo era compreso tra 2,5 e cinque microgrammi per millilitro. Questo è leggermente superiore al valore precedentemente pubblicato di 1,5 microgrammi per millilitro. Ma è ancora ben all'interno dell'intervallo accettabile.

Come dimostrato qui, l'evaporazione diventa significativa per tutti gli esperimenti con tempi di incubazione prolungati. Quindi bisogna fare attenzione a mantenere le incubatrici ben umidificate per evitare incongruenze. Una volta padroneggiata, questa tecnica può fornire dati intracellulari affidabili in soli quattro giorni.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di essere delicati con le cellule THP1 e di essere coerenti con il pipettaggio se si tenta senza automazione. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi, come lo screening ad alto contenuto, per determinare se i composti colpiti sono batteriostatici o battericidi. Dopo il suo sviluppo, questo protocollo ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della scoperta di farmaci per la tubercolosi per valutare rapidamente l'efficacia dei composti contro la MTB all'interno dei macrofagi umani.

Non dimenticare che lavorare con il microbatterio tubercolosi è pericoloso. Utilizzare precauzioni e attrezzature adeguate quando si maneggia questo microrganismo.