Name: Sistema per lefficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri un sistema di screening ad alto rendimento per valutare l'efficacia dei composti contro Mycobacterium tuberculosis all'interno dei macrofagi umani. Questo metodo basato su luciferasi sostituisce i saggi CFU tradizionali, riducendo tempi e lavoro nella ricerca di nuovi farmaci antitubercolari.

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1. ceppo batterico e crescita medio <ol><li> Rendere albumina destrosio e soluzione salina magazzino (ADS) solubilizzando 25 g di albumina di siero bovino, 10,0 g di destrosio, e 4,05 g di cloruro di sodio in 460 ml di acqua deionizzata. Filtro-sterilizzare ADS e conservare a 4 ° C. </li><li> Rendere 7H9 brodo aggiungendo 4,7 g di polvere 7H9 e 2 mL di glicerolo a 900 ml di acqua purificata. Autoclavare il brodo 7H9 a 121 ° C per 10 minuti e lasciare raffreddare a temperatura ambiente prima di procedere. Fare 7H9ADST aggiungendo 100 ml di ADS e 0,5 ml di Tween80 a 900 ml di brodo 7H9. Conservare a 4 ° C. </li><li> Pesare 50 mg di kanamicina solfato e sciogliere in 1 ml di acqua deionizzata; la concentrazione finale è di 50 mg / mL. Filtro-sterilizzare e conservare a -20 ° C. Aggiungere 0,5 ml di kanamicina soluzione madre per 1 L di 7H9ADST. NOTA: Questo terreno deve essere fatta fresca, così scalare i volumi modo appropriato secondo la dimensione cultura. </li><li> Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST integrato con kanamicina nella cultura in piedi. Agitare la cultura quotidiana e diluirlo prima che la raggiunga OD600 1,0 per evitare grumi. NOTA: Il ceppo M. tuberculosis utilizzato per lo sviluppo di questo metodo è stato trasformato con H37Rv pJAK2.A plasmide 12. pJAK2.A è un plasmide integrativo basato sul vettore pMV361, che permette l&#39;espressione ad alto livello del gene luciferasi di lucciola dal promotore HSP60 e può essere selezionata tramite kanamicina. </li></ol> 2. THP-1 Medium e manutenzione <ol><li> Aggiungere 50 ml di siero inattivato al calore fetale bovino (FBS) e 5 ml di 200 mM di L-glutammina a 500 ml di RPMI 1640 per fare mezzo RPMI incompleta (circa il 10% FBS e 2 mM glutammina). </li><li> Mantenere una coltura cellulare THP-1 secondo protocollo standard 13. Brevemente, crescere cellule THP-1 in mezzo RPMI incompleta mantenendo una densità cellulare da 0,2 a 1 milione per mL di terreno tra passaggi. </li></ol> 3. Screening intracellulare high-throughput Utilizzando luciferasi che esprimono M. tuberculosis H37Rv <ol><li> Misurare la densità ottica di una sospensione batterica attiva crescita in uno spettrofotometro ad una lunghezza d&#39;onda di 600 nm. Calcolare la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 OD 600 = 3 x 10 7 batteri per mL. </li><li> Pipettare i batteri sufficienti per una molteplicità di infezione (MOI) di 10: 1 in una nuova provetta da centrifuga. Pellet a 3.000 xg per 10 minuti e aspirare il liquido. Aggiungere 50 ml di siero umano a 450 ml di RPMI1640. Scala il volume di appropriarsi dei valori per l&#39;esperimento. </li><li> Per opsonize i batteri, risospendere il pellet ad una densità di 1 x 10 8 batteri per 500 ml di RPMI1640 contenente 10% di siero umano. Lasciare la miscela a incubare a 37 ° C per 30 min. Determinare la THP-1 cellule densità coltura contando con un emocitometro e un microsco invertitape. </li><li> Agglomerare le cellule in provette da centrifuga sterili a 100 xg e 37 ° C per 10 min. Aspirare il surnatante e risospendere le cellule in RPMI incompleta ad una densità di 1 milione di cellule per ml. Aggiungere forbolo-12-miristato-13-acetato (PMA) per un 40 ng ml di concentrazione / finale. NOTA: Questo sarà indicato come il mix di differenziazione. </li><li> Combinare opsonizzati M. tuberculosis con THP-1 mix differenziazione ad una MOI di 10: 1 e aliquota della miscela finale a 100 microlitri per pozzetto in una piastra bianca 96 pozzetti a fondo piatto. Regolarmente agitare la miscela per assicurare uniformità. Permettono la differenziazione e l&#39;infezione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. </li><li> Lavare i pozzetti due volte con 100 ml di RPMI ciascuno. Aggiungere composti diluiti alle concentrazioni desiderate in RPMI incompleta ed incubare per 3 giorni. </li><li> Aspirare il terreno dai pozzi. Aggiungere 50 ml di reagente saggio luciferasi in ciascun pozzetto. Sigillare le piastre con transparent sigillanti piastra adesivi. Consentire 5 min di incubazione a 22 ° C e quindi ottenere una lettura in un luminometro a 1 s per pozzetto. </li></ol> 4. Analisi citotossicità usando un 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazolio bromuro (MTT) 14 <ol><li> Differenziare le cellule THP-1 in RPMI incompleta completato con 40 ng / ml di PMA in chiaro piastre da 96 pozzetti. Mantenere una densità cellulare di 1 milione per mL e un&#39;aliquota di 100 microlitri per pozzetto. Lasciare differenziazione di procedere notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. </li><li> Aspirare il terreno dai pozzetti e lavarli due volte con RPMI 1640. Aggiungere composti diluite in RPMI incompleti ai pozzetti. Incubare per 3 giorni. </li><li> Sciogliere 0.5 g di MTT in 100 mL di tampone fosfato salino (PBS) per ottenere una soluzione stock di 5 mg / mL. filtro sterile e conservare a -20 ° C, al riparo dalla luce; è meglio per rendere questa soluzione fresca. </li><li> 2.5 h before la fine del periodo di incubazione di 3 giorni, aggiungere 25 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto e completare il periodo di incubazione. </li><li> Preparare 50% N, N-dimetil formammide (DMF) miscelando 250 ml di DMF con 250 mL di acqua deionizzata. </li><li> Preparare tampone di estrazione MTT come segue: Pesare 100 g di SDS in una bottiglia da 500 ml e aggiungere 300 ml di DMF al 50%. Applicare a fuoco basso per permettere al SDS sciogliere. Aggiungere 10 ml di acido acetico puro e 12,5 ml di 1 M HCl. Riempire fino al segno da 500 ml con il 50% DMF; la composizione finale del tampone di estrazione è del 50% DMF, 20% SDS, 2,5% di acido acetico e 2,5% 1 M di acido cloridrico. </li><li> Al termine del periodo di trattamento, aggiungere 100 ml di tampone di estrazione (riscaldato a 45 ° C per sciogliere i cristalli) a ciascun pozzetto. Lasciare la miscela a incubare durante la notte a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. Leggere l&#39;assorbanza a 570 nm. NOTA: Il test di citotossicità migliore viene eseguita in parallelo con un&#39;intracellularischermo lare con persone dello stesso lotto e l&#39;età di cellule THP-1. </li></ol> 5. In brodo di attività di analisi Utilizzando un resazurina Assay 3 <ol><li> Crescere M. tuberculosis in 7H9ADST alla fase di mid-log (~ 0,5-0,8 OD 600). Diluire la cultura con la 7H9ADST a 0,01 OD 600. Diluire i composti in 7H9ADST a 2x le concentrazioni di prova e un&#39;aliquota di 100 microlitri di ciascun composto diluito in ciascun pozzetto. </li><li> Trasferire 100 microlitri della sospensione batterica diluita in ciascun pozzetto. Lasciare le piastre di incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato per 5 giorni. Sciogliere 10 mg di resazurina in 100 mL di acqua deionizzata e filtro sterile. </li><li> Aggiungere 30 ml di soluzione di resazurina e monitorare il cambiamento di colore dopo 48 ore; la crescita batterica è indicato da una conversione di colore dal blu al rosa. NOTA: Un&#39;analisi quantitativa può essere eseguita misurando sia la fluorescenza a 590 nm con eccitazione a 530 - 560nm o l&#39;assorbanza a 570 nm e 600 nm 15. </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti per questo lavoro.

L&#39;obiettivo di questo studio era quello di creare un metodo semplice e conveniente HTS utilizzando un modello di infezione intracellulare umana per M. tuberculosis. La tubercolosi è una malattia umana caratterizzata da infezione di macrofagi alveolari di M. tuberculosis. A causa di problemi di biosicurezza, ricerca che coinvolgono modelli biologici sia del batterio e le cellule ospiti è stata utilizzata in passato. Tuttavia, è stato dimostrato che l&#39;uso di batteri surrogate e modelli non umani ...

Mycobacterium tuberculosis, l&#39;agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. TB Drug-sensibile è una malattia curabile che richiede più antibiotici per un periodo di 6 mesi. Pur essendo una malattia curabile, la mortalità TB è stato stimato a 1,5 milioni nel 2015 1. Negli ultimi 10 anni, ci sono stati crescenti preoccupazioni sulla prevalenza della farmaco-resistente M. tuberculosis. Multiresistente TB (MDR-TB) è definita come TBC che è resistente ad almeno isoniazide (INH) e rifampicina (RMP), e la maggior parte dei ceppi MDR-TB sono anche resistenti per selezionare farmaci di seconda linea TB, limitando così le opzioni di trattamento . Gli effetti della resistenza ai farmaci creano una sfida maggiore per il trattamento di pazienti co-infettati con il virus dell&#39;immunodeficienza umana (HIV); 400.000 pazienti in tutto il mondo sono morte di tubercolosi associata ad HIV nel 2015 1. Purtroppo, gli Stati Uniti Food and Drug Administrazione ha approvato un solo nuovo farmaco contro la TB MDR-TB, bedaquiline, negli ultimi 40 anni 2. I progressi nella ricerca di una migliore e più brevi terapie TB sono urgentemente necessarie al fine di rimanere in testa nella lotta contro la tubercolosi e la MDR-TB. Tradizionalmente, TB droga schermi vengono eseguite in vitro in condizioni di crescita in terreno di coltura, per cui i composti vengono aggiunti ad una coltura in crescita e la loro efficacia nel sradicare i microrganismi sono determinati dal conteggio delle unità formanti colonie (CFU) su terreno solido. Come conta CFU sono alta intensità di lavoro, che richiede tempo, e costoso, vari metodi indiretti sono stati sviluppati per alleviare questo problema. Tali metodi includono la vitalità dosaggio Alamar Blue 3, la determinazione della fluorescenza 4 dalla proteina verde fluorescente (GFP) o luminescenza 5 dai batteri luciferasi che esprimono, e la stima di adenosina trifosfato totale (ATP) 6, 7. TB tipica è caratterizzata da un&#39;infezione da M. tuberculosis del polmone, in cui i batteri risiedono e replicano all&#39;interno dei fagosomi di macrofagi alveolari 8. Lo schermo semplice in brodo fenotipica può soddisfare patogeni extracellulari; tuttavia, in prospettiva storica, ha colpito composti contro M. tuberculosis individuati con questo metodo spesso non riescono a essere all&#39;altezza delle aspettative durante le fasi di validazione a valle in modelli di infezione. Proponiamo che la tubercolosi farmaco è meglio eseguita in un modello di infezione cellula ospite intracellulare. Tuttavia, i modelli intracellulari possiedono molte barriere tecnologiche e biologiche di screening (HTS) sviluppo ad alta produttività. Un grande ostacolo è la complessità del processo di infezione, esemplificato da numerosi passaggi e la rimozione elaborato di batteri extracellulari da in-tra lavaggio. Un secondo ostacolo principale è il tempo lungo rigenze, il rilevamento crescita, normalmente svolto da CFU contando su piastre di coltura, è un processo che richiede più di 3 settimane per completare. Una soluzione per sostituire una conta è stata fornita mediante microscopia a fluorescenza automatizzata in combinazione con i batteri fluorescenti. Tuttavia, questa soluzione richiede un investimento iniziale che apparecchiatura è fuori portata per molti laboratori di ricerca. Un semplice, a basso costo, e il metodo HTS malattie rilevanti sarebbero migliorare notevolmente il processo di scoperta di nuovi farmaci. In questo studio, riportiamo un nuovo sistema modulare HTS che mira a fornire un rapido e altamente scalabile, ma economica, saggio atto a determinare l&#39;attività dei composti contro M. tuberculosis intracellulare. Questo sistema è composto da tre moduli: (i) intracellulari, (ii) citotossicità, e (iii) Prove in brodo. Il risultato finale combinato fornisce una descrizione completa delle proprietà dei componenti, con ulteriori informazioni riguardanti la modalità potenziale di azione. Questo scSistema reening è stato utilizzato in diversi progetti con varie librerie di composti modalità di azione che colpiscono, compresa l&#39;analisi di sinergia farmaco 9, la stimolazione dell&#39;autofagia 10, e l&#39;inibizione di M. tuberculosis -secreted fattore di virulenza (non pubblicata). I composti di modalità sconosciuta di azione sono stati studiati 11. Una versione modificata di questo metodo è stato adottato anche dal nostro partner industriale come il metodo di screening primario di identificare nuovi composti contro intracellulare M. tuberculosis 11.

<table><tbody><tr><td>RPMI 1640</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R5886</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12483020</td><td></td></tr><tr><td>Middlebrook 7H9</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>271210</td><td></td></tr><tr><td>Tween80</td><td>Fisher Scientific</td><td>T164</td><td></td></tr><tr><td>Albumina, pH bovino 7</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>Destrosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP350</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358</td><td></td></tr><tr><td>kanamicina solfato</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906</td><td></td></tr><tr><td>PMA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2128</td><td></td></tr><tr><td>N,N- Dimetilformammide (DMF)</td><td>Fisher Scientific</td><td>D131</td><td></td></tr><tr><td>1 M Acido idrocolorico (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>351279212</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Fisher Scientific</td><td>351269</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166</td><td></td></tr><tr><td>Resazurina</td><td>Alfa Aesar</td><td>B21187</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>THP-1</td> American <td>Type Culture Collection</td><td>TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>M. tubercolosis H37Rv</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra bianca a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3917</td><td></td></tr><tr><td>Piastra trasparente a fondo piatto a 95 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3595</td><td></td></tr><tr><td>Sigillante per lastre trasparente</td><td>Spettrofotometro Thermo Fisher Scientific</td><td>AB-0580</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td> per micropiastre <td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Biomate 3</td><td></td></tr><tr><td>Luminometro</td><td>Biotek</td><td>Epoch</td><td></td></tr><tr><td>Applied</td><td>Biosystems Tropix</td><td>TR717</td><td></td></tr></tbody></table>

sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; mycobacterium tuberculosis</em

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Il Mycobacterium tuberculosis, l'agente eziologico della tubercolosi (TB), è una delle principali cause di morbilità e mortalità in tutto il mondo. Con l'aumento della diffusione della tubercolosi multiresistente ai farmaci (MDR-TB), c'è una reale urgenza di sviluppare nuove strategie terapeutiche contro le infezioni da M. tuberculosis. Tradizionalmente, i composti vengono valutati in base alla loro attività antibatterica in condizioni di crescita in vitro in brodo; tuttavia, i risultati sono spesso fuorvianti per i patogeni intracellulari come M. tuberculosis poiché le condizioni di screening fenotipico in brodo sono significativamente diverse dalle condizioni effettive della malattia all'interno del corpo umano. Lo screening per gli inibitori che agiscono all'interno dei macrofagi è stato tradizionalmente difficile a causa della complessità, della variabilità dell'infezione e del lento tasso di replicazione di M. tuberculosis. In questo studio, riportiamo un nuovo approccio per valutare rapidamente l'efficacia dei composti sulla vitalità di M. tuberculosis in un modello di infezione da macrofagi. Utilizzando una combinazione di un test di citotossicità e un test di vitalità di M. tuberculosis in brodo, siamo stati in grado di creare un sistema di screening che genera un'analisi completa dei composti di interesse. Questo sistema è in grado di produrre dati quantitativi a un costo contenuto, alla portata della maggior parte dei laboratori e tuttavia è altamente scalabile per adattarsi a grandi ambienti industriali.

High-Throughput Screening intracellulare con M. tuberculosis che esprime il gene della luciferasi Figura 2A e 1 contengono i dati grezzi raccolti dal luminometro, espressi in unità luminescenti relativa (RLU), che mostra l&#39;effetto di un aumento di concentrazione di TB rifampicina farmaco su M. tuberculosis all&#39;interno cellule THP-1. La figura 2A è un dia...

Abbiamo sviluppato un sistema di screening ad alto rendimento modulare per scoprire nuovi composti contro Mycobacterium tuberculosis, il targeting intracellulare e in brodo coltura di batteri e citotossicità contro la cellula ospite di mammifero.

Sistema per l&#39;efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una valutazione multidimensionale di come i composti influenzino la sopravvivenza di M.tuberculosis all'interno dei macrofagi umani. Questo metodo si basa su un saggio di efficacia basato sulla luciferasi. Combinato con un saggio di citotossicità e un saggio di MIC, può fornire informazioni utili per la modifica dei composti HIT nello sviluppo di farmaci contro la tubercolosi.Il vantaggio principale del nostro metodo è che consente un risparmio di tempo e di lavoro. Esso sostituisce un saggio dell'unità formante colonie (CFU) con un saggio basato sulla luciferasi. In generale, le persone nuove rispetto a questa tecnica avranno difficoltà a mantenere la costanza nelle operazioni di pipettaggio manuale anziché automatizzato.Una tecnica di pipettaggio costante è fondamentale. Coltivare le cellule THP1 in RPMI in mezzo completo, mantenendo una densità cellulare compresa tra 0,2 e un milione di cellule per millilitro di mezzo tra un passaggio e l'altro.Utilizzare uno spettrofotometro per misurare l'OD600 di una sospensione batterica in crescita attiva. Calcolare quindi la densità batterica utilizzando il fattore di conversione di 0,1 O

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Immunologia e Infezioni

Questo video dimostra un test per valutare l'efficacia dei farmaci contro l'infezione da Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Viene generato un modello di infezione in vitro contenente aggregati di Mtb/macrofagi che imita l'infezione in vivo. Dopo l'introduzione di antibiotici adeguati, la loro efficacia viene testata tramite il dosaggio della resuzarina per monitorare la sopravvivenza dei batteri con l'aumentare delle concentrazioni di farmaci.

Un test per valutare l'efficacia di un farmaco contro un modello di infezione da Mycobacterium tuberculosis

Questo video dimostra un test in brodo per determinare l'efficacia degli antibiotici contro il Mycobacterium tuberculosis. La coltura batterica viene incubata con diverse concentrazioni di un antibiotico battericida. L'efficacia battericida viene misurata valutando la presenza di batteri vitali utilizzando un test della resazurina.

Valutazione dell'efficacia di un composto di prova contro i micobatteri in brodo

Qui descriviamo un saggio fenotipico applicabile agli schermi ad alta produttività /alto contenuto di RNA sintetico (siRNA), composto chimico e librerie mutanti Mycobacterium tuberculosis. Questo metodo si basa sul rilevamento di Mycobacterium tuberculosis con etichetta fluorescente all'interno di una cellula ospite etichettata fluorescentmente utilizzando la microscopia confocale automatizzata.

Un test fenotipico microscopico per la quantificazione dei micobatteri intracellulari adattati per lo screening ad alta produttività / alto contenuto

Il saggio charcoal agar resazurin a(CARA) è un metodo semi-quantitativo a medio rendimento per valutare l'attività degli agenti di prova contro i micobatteri che si replicano, non si replicano o entrambi.  Il CARA consente una rapida valutazione dell'attività dipendente dal tempo e dalla concentrazione e identifica i parametri da perseguire mediante saggi di unità formanti colonie (CFU).

Visualizzazione del carbone Agar resazurina Assay per semi-quantitativa, medio-throughput enumerazione dei micobatteri

È stato sviluppato un test in tempo reale ad alta produttività per identificare contemporaneamente (1) antimicrobici penetranti nelle cellule eucariotiche che prendono di mira un patogeno batterico intracellulare e (2) valutare la citotossicità delle cellule eucariotiche. Una variante della stessa tecnologia è stata successivamente combinata con la tecnologia di dispensazione digitale per consentire studi di sinergia facili, ad alta risoluzione, dose-risposta e bidimensionali e tridimensionali.

High Throughput, in tempo reale, Dual-lettura Prove di intracellulare antimicrobica attività e eucariotica citotossicità cellulare

Nuovi modelli e saggi che migliorerebbero il processo di sviluppo precoce dei farmaci antitubercolari di prossima generazione sono altamente auspicabili. Qui, descriviamo un test rapido, economico e compatibile con BSL-2 per valutare l'efficacia del farmaco contro il Mycobacterium tuberculosis che può essere facilmente adattato per lo screening ad alto rendimento.

Un test compatibile high-throughput per valutare Drug efficacia contro macrofagi diversi passaggi<em&gt; Mycobacterium tuberculosis</em

La quantificazione rapida ed efficiente della crescita intracellulare di M. tuberculosis è fondamentale per perseguire terapie migliori contro la tubercolosi (TB). Questo protocollo descrive un test di rilevamento colorimetrico basato sul brodo utilizzando un sistema di coltura liquida automatizzato per quantificare la crescita di Mtb nei macrofagi trattati con terapie candidate dirette dall'ospite.

Un sistema di coltura automatizzato da utilizzare nei test preclinici di terapie dirette all'ospite per la tubercolosi

La determinazione delle unità formanti colonie (CFU) è la tecnica gold standard per quantificare i batteri, tra cui il Mycobacterium tuberculosis che può richiedere settimane per formare colonie visibili. Qui descriviamo un micro-CFU per la determinazione di CFU con una maggiore efficienza temporale, una riduzione dello spazio di laboratorio e del costo dei reagenti e la scalabilità per esperimenti a media e alta produttività.

Saggio dell'unità formante microcolonie per la valutazione dell'efficacia dei vaccini contro la tubercolosi

Questo studio ha sviluppato un test per lo screening ad alto rendimento contro Mycobacterium abscessus con un ceppo doppio reporter di recente creazione, utilizzando la fluorescenza e la luminescenza per valutare rapidamente la vitalità batterica. Questo protocollo sarà rilevante per i ricercatori che mirano a selezionare nuovi farmaci contro questo batterio resistente ai farmaci.

Sviluppo di saggi per lo screening di farmaci ad alto rendimento contro i micobatteri

Qui presentiamo un protocollo per identificare potenziali candidati farmaci antitubercolosi tramite screening fenotipico, comprendendo la sintesi chimica di un composto di 4-aminochinolina, la determinazione della sua concentrazione inibitoria minima contro Mycobacterium tuberculosis e la valutazione della sua citotossicità nelle linee cellulari di mammiferi.

Identificazione dei potenziali candidati anti-TB: una guida passo dopo passo alla sintesi, alla determinazione della CIM e alla valutazione della citotossicità nelle cellule di mammiferi

Scopri un sistema di screening ad alto rendimento per valutare l'efficacia dei composti contro Mycobacterium tuberculosis all'interno dei macrofagi umani. Questo metodo basato su luciferasi sostituisce i saggi CFU tradizionali, riducendo tempi e lavoro nella ricerca di nuovi farmaci antitubercolari.

Sistema per lefficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare Mycobacterium tuberculosis (Video) | JoVE Journal

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Sistema per l'efficacia e la citotossicità Proiezione di inibitori di targeting intracellulare

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