Metodi per la Self-integrazione di Megamolecular biopolimeri sul asciugatura ad aria-LC Interfaccia
7 aprile 2017
Procedimento per l'essiccazione indotta autointegrazione di biopolimeri megamolecular sull'interfaccia cristallina aria-liquido viene fornito qui. Questa metodologia sarà utile non solo per comprendere i potenziali macroscopiche di biopolimeri, ma anche come un metodo di valutazione per materiali morbidi in campo biomedico e ambientale.
L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di valutare l'effetto dell'essiccazione dell'interfaccia aria-liquido cristallino o aria-LC sull'orientamento di biopolimeri megamolecolari come polisaccaridi, microtubuli e DNA come comportamenti dinamici visualizzati su scala millimetrica. Questo messaggio può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi della struttura dispersiva, come l'auto-organizzazione dei biopolimeri in un ambiente di essiccazione in cui gli organismi viventi sono strisciati sul terreno circa 500 milioni di anni fa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di prelevare viste laterali del campione durante il processo di essiccazione senza essiccare sul piano orizzontale.
Per iniziare questa procedura, aggiungere 0,5 grammi di sacran a 100 millilitri di acqua. Coprire il contenitore con pellicola trasparente e mescolare la soluzione a circa 80 gradi Celsius per più di 12 ore. Dopo aver lasciato raffreddare le soluzioni di gomma sacran e xantham, centrifugare la soluzione sacran per rimuovere le impurità.
Ora, preparare una soluzione di tubulina allo 0,5% in peso in tampone Britton-Robinson su ghiaccio. Mescolare 50 microlitri di soluzione di tubulina con 5 microlitri di GpCpp. Quindi incubare la soluzione a 37 gradi Celsius per tre ore per ottenere un microtubulo stabile o nucleo MT.
Successivamente, mescolare 950 microlitri della soluzione di tubulina e 50 microlitri della soluzione di tubulina contenente GpCpp. Quindi, lasciare riposare la soluzione per un giorno a circa 25 gradi Celsius per ottenere una soluzione MT stabile allo 0,5% in peso. Successivamente, preparare una soluzione di DNA allo 0,5% in peso e una soluzione tampone Tris-EDTA.
Mantenere le soluzioni campione di biopolimero allo 0,5% in peso a 25 gradi Celsius per l'esperimento di essiccazione. Tagliare un foglio di silicone in una forma appropriata con uno spessore di 1 millimetro. Assemblare una cella aperta su un lato composta dal distanziatore in silicone e da due vetrini non modificati.
Fissare entrambi i lati della cella con doppie clip per evitare che le soluzioni campione fuoriescano. Utilizzando un puntale per pipetta delle dimensioni di un millimetro, aggiungere lentamente da 100 a 300 microlitri di ciascuna soluzione di biopolimero allo 0,5% in peso in ciascuna cellula a circa 25 gradi Celsius. Rimuovere le bolle d'aria dalla cellula utilizzando un ago per siringa.
Successivamente, mettere le celle in un forno con circolatore d'aria per 18 ore a 60 gradi Celsius sotto pressione atmosferica per l'evaporazione. La direzione di un'operazione è opposta a quella della gravità. Questa collocazione si applica anche al monitoraggio per queste ultime revisioni.
Utilizzare una lampada alogena da 100 watt con una sorgente luminosa a superficie piana su un'ampia area per fornire una luce visibile diretta. Regolare i polarizzatori a 45 gradi e 135 gradi utilizzando i supporti. Fissa le posizioni della sorgente luminosa, dei polarizzatori, del tavolino del campione e della fotocamera utilizzando una guida ottica e una posizione dell'asta.
Posizionare il tavolino di campionamento tra i due polarizzatori. Quindi, posizionare la fotocamera a circa 20 centimetri dal tavolino di campionamento per consentire la messa a fuoco. Agli orari indicati nel protocollo di testo, posizionare i campioni di biopolimero tra i polarizzatori sul tavolino parallelo al piano XZ e coprire il dispositivo con una tenda nera.
Infine, fotografare i campioni attraverso polarizzatori lineari incrociati utilizzando una fotocamera reflex digitale a obiettivo singolo con un obiettivo zoom standard. È stata valutata l'autointegrazione da microdominio a macrodominio su un'interfaccia aria-LC di essiccazione. Prima dell'essiccazione, sono state osservate regioni luminose con luce trasmessa in uno stato sparso.
Dopo l'essiccazione, la regione sotto l'interfaccia aria-LC e la soluzione sacrana sono diventate alte e l'intensità della soluzione di xantina è diminuita con piccoli macrodomini. L'analisi spazio-temporale ha mostrato che l'intensità di picco attorno all'interfaccia aria-liquido e lo spessore sono aumentati, indicando che i microdomini iniziano a orientarsi dall'interfaccia aria-LC e crescono in un dominio su scala millimetrica parallelo all'interfaccia. Le immagini microscopiche di polarizzazione della fase fluida sacra hanno mostrato una regione blu, il che significa che si è formato un singolo macrodominio.
La fase fluida della gomma di xantano mostrava regioni blu, gialle e rosa, il che significa che i macrodomini multipli si sono formati con orientamenti arbitrari. Prima dell'essiccazione, le soluzioni sacran e MT hanno mostrato stati LC simili con domini sparsi. Durante l'essiccazione, la soluzione MT è stata sottoposta ad auto-integrazione e i domini sparsi sono stati integrati in un unico macrodominio.
La soluzione di DNA non ha mostrato alcun orientamento specifico nella fase liquida. Il record di essiccazione sacra ha mostrato una significativa birifrangenza e sono stati osservati fasci ondulati per il record di essiccazione MT. Il record di essiccazione del DNA ha mostrato macrodomini a forma di grano in direzioni arbitrarie.
Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'ingegneria biomedica che utilizzano biopolimeri per esplorare una visualizzazione della dinamica del flusso d'aria sui processi di essiccazione e bagnatura in approcci geometrici.
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Panoramica
Questo articolo presenta un metodo per l'auto-integrazione indotta dall'essiccazione di biopolimeri megamolecolari all'interfaccia aria-liquido cristallino. La tecnica è finalizzata allo studio del comportamento dei biopolimeri in un ambiente in via di essiccazione, un aspetto rilevante per applicazioni sia biomediche che ambientali.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biopolimeri
- Materiali morbidi
- Applicazioni biomediche
Sfondo
- I biopolimeri megamolecolari includono polisaccaridi, microtubuli e DNA.
- Comprendere l'auto-organizzazione dei biopolimeri è fondamentale per diversi campi scientifici.
- Questo studio esplora la dinamica dei biopolimeri in condizioni di essiccazione.
- La tecnica consente viste laterali dei campioni durante il processo di essiccazione.
Scopo dello studio
- Valutare l'effetto dell'interfaccia aria-LC sull'orientamento dei biopolimeri.
- Visualizzare i comportamenti dinamici dei biopolimeri su scala millimetrica.
- Indagare questioni relative all'auto-organizzazione dei biopolimeri.
Metodi Utilizzati
- Preparazione di una soluzione di sacran sciogliendo 0,5 grammi in 100 millilitri di acqua.
- Agitazione della soluzione a circa 80 gradi Celsius per oltre 12 ore.
- Centrifugazione della soluzione di sacran per rimuovere le impurità.
- Osservazione del comportamento del biopolimero durante il processo di essiccazione.
Risultati principali
- I comportamenti dinamici dei biopolimeri sono stati visualizzati con successo.
- Il processo di essiccazione ha influenzato l'orientamento dei biopolimeri.
- Le viste laterali hanno fornito informazioni uniche sul processo di auto-integrazione.
- Il metodo ha potenziali applicazioni in diversi campi.
Conclusioni
- Il metodo di auto-integrazione indotta dal processo di essiccazione è efficace per lo studio dei biopolimeri.
- Questa tecnica può migliorare la comprensione del comportamento dei biopolimeri in ambienti naturali.
- Applicazioni future potrebbero includere progressi nella ricerca biomedica e ambientale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la visualizzazione dell'auto-integrazione di biopolimeri megamolecolari all'interfaccia cristallina aria-liquido durante l'essiccazione, offrendo spunti sul comportamento dei materiali morbidi in applicazioni biomediche e ambientali. Catturando i cambiamenti spazio-temporali nell'ordine orientazionale sotto evaporazione controllata, supporta la riduzione dei rischi meccanicistici nella caratterizzazione precoce dei biopolimeri. L'approccio fornisce una piattaforma scalabile e priva di marcatori per valutare l'organizzazione dei biopolimeri senza perturbare gli stati nativi, in linea con le esigenze di validazione degli obiettivi e di sviluppo di saggi nei processi di scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi della dinamica di auto-organizzazione dei biopolimeri sotto stress da essiccazione, chiarificando le associazioni funzionali tra polisaccaridi, proteine del citoscheletro e DNA.
- Valore operativo: Fornisce un protocollo riproducibile di acquisizione d'immagini in vista laterale, mediante luce cross-polarizzata, per monitorare l'integrazione di domini su scala millimetrica senza artefatti di essiccazione orizzontale.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative della birifrangenza e della morfologia dei domini che riflettono i cambiamenti nell'allineamento molecolare durante l'evaporazione del solvente.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione del saggio grazie a un design della cella con un lato aperto e a un allineamento fisso del polarizzatore, consentendo confronti coerenti tra diversi tipi di biopolimeri.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Collega l'auto-integrazione indotta dal disseccamento in vitro ai processi naturali di disidratazione dei tessuti, offrendo un sistema rilevante per lo studio della funzione di barriera in tessuti cutanei o vascolari.
- Valore operativo: Facilita la previsione della fiducia correlando il comportamento all'interfaccia aria-liquido cristallino con le transizioni di fase del biopolimero in massa osservabili mediante microscopia a polarizzazione.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro di scoperta iniziale, supportando la verifica delle ipotesi nella validazione del target e consentendo la preparazione di biopolimeri pronti per saggi per analisi successive e studi meccanicistici.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi visualizzando come le condizioni di essiccazione influenzino l'orientamento dei biopolimeri da micro- a macrodomini, fornendo informazioni sull'interazione con il bersaglio in condizioni di stress ambientale.
- Screening: Permette la preparazione standardizzata di soluzioni di sacran, microtubuli e DNA in camere ambientali controllate, rendendo gli saggi pronti all'uso.
- Analisi: Fornisce risultati quantitativi mediante l'analisi dell'intensità e dello spessore dei domini birifrangenti, consentendo il confronto della cinetica di auto-integrazione tra diverse classi di biopolimeri.
- Ricerca Translazionale: Si collega alla continuità preclinica modellando i cambiamenti strutturali indotti dall'essiccazione, rilevanti per la funzione della barriera epiteliale o per il rimodellamento della matrice extracellulare.
- Riutilizzo Aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per la valutazione della stabilità delle formulazioni di biopolimeri sotto stress da disidratazione, applicabile in diversi progetti.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Riduce l'ambiguità meccanicistica nell'autoassemblaggio dei biopolimeri osservando direttamente l'integrazione guidata dall'interfaccia aria-LC.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità attraverso l'assemblaggio standardizzato delle cellule, l'evaporazione controllata in temperatura e un allineamento ottico fisso.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione nella selezione dei biopolimeri prevedendo precocemente gli esiti strutturali indotti dall'essiccazione durante la fase di scoperta.
- Impatto sul portafoglio: Permette la priorizzazione dei candidati biopolimeri in base al rischio, sulla base del loro comportamento di auto-integrazione e della stabilità orientazionale.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in microscopia a polarizzazione e manipolazione di biopolimeri in condizioni controllate di idratazione.
- È basato su rotaie ottiche, polarizzatori, sorgenti luminose alogene e camere ambientali per garantire un'evaporazione stabile.
- Necessita di standardizzazione nel caricamento del campione, nella rimozione di bolle d'aria e nella sigillatura, al fine di prevenire artefatti ai bordi durante l'essiccazione.
- L'adattamento a diversi sistemi modello richiede la validazione della concentrazione, della compatibilità con i tamponi e della cinetica di nucleazione per ciascun biopolimero.
- I limiti pratici includono la sensibilità alle vibrazioni, alle fluttuazioni di umidità e alla necessità di condizioni di imaging in campo oscuro per evitare il fotoblesamento.
