Il modello del coniglio di aterosclerosi accelerata: una prospettiva metodologica della ferita dell'aerostato dell'arteria iliaca
3 ottobre 2017
Modelli animali di aterosclerosi sono essenziali per capire il meccanismo e per indagare più recenti approcci per prevenire lo sviluppo della placca o rottura, delle cause principali di morte nel mondo industrializzato. Questo protocollo utilizza una combinazione di lesioni palloncino e dieta ricca di colesterolo per indurre placche aterosclerotiche nell'arteria iliaca coniglio.
L'obiettivo generale di questa procedura è indurre la formazione di placche aterosclerotiche nei conigli attraverso la rottura chirurgica dell'endotelio delle loro arterie iliache sinistre e l'alimentazione con una dieta aterogena. L'injury isolato nei conigli viene spesso eseguito sull'aorta per studiare la composizione della placca. Tuttavia, l'arteria iliaca è molto simile all'arteria coronarica umana, rendendola un sito interessante per la modellizzazione delle placche aterosclerotiche.
Il contenuto muscolare delle lesioni uniformi, l'attività del fattore tessutale oculare e le dimensioni vascolari costanti dell'arteria iliaca del coniglio sono tutti paragonabili a quelle dell'arteria coronaria umana. Ciò consente infine la valutazione di dispositivi prodotti industrialmente rispetto a parametri morfometrici e angiografici. Aurelien Frobert, un collaboratore del mio laboratorio, mostrerà la procedura.
Assicurarsi di sterilizzare tutti gli strumenti chirurgici utilizzando, ad esempio, un sterilizzatore a perle di vetro. Successivamente, preparare e verificare i due dispositivi di catetere a palloncino. Su ciascuno, fissare una siringa Luer lock da un millilitro riempita con soluzione salina fisiologica, quindi controllare la presenza di bolle d'aria intrappolate utilizzando il meccanismo di gonfiaggio del palloncino.
Successivamente, impostare il tappetino termico sulla piattaforma chirurgica a 37 gradi Celsius. Poi pesare il coniglio. Successivamente, somministrare un'iniezione di buprenorfina e anestetizzare il coniglio utilizzando il 5% di isoflurano a cinque litri al minuto per 10-15 minuti.
Ora, posizionare il coniglio anestetizzato su un tappetino riscaldante collocato su un piano chirurgico. Applicare sensori per monitorare la temperatura, la respirazione del coniglio e per acquisire elettrocardiogrammi. Successivamente, applicare una maschera facciale per somministrare il 4% di isoflurano a 2,5 litri al minuto.
Quindi confermare un adeguato livello di anestesia verificando la perdita dei riflessi faringeo e palpebrale. Un tono muscolare completamente rilassato è anch'esso indicatore di un'anestesia profonda. Successivamente, applicare un unguento oftalmico su entrambi gli occhi.
Successivamente, rimuovere i peli dalla zona ventrale appena sotto le articolazioni del ginocchio utilizzando un rasoio elettrico per animali. Poi, eliminare i peli residui e pulire la cute esposta con tre passaggi alternati di etanolo al 70% e betadina, quindi coprire l'animale in modo da lasciare esposta soltanto l'arto inferiore. Per iniziare l'intervento chirurgico, individuare l'arteria safena ed effettuare un'incisione di 1,5 centimetri.
Quindi, utilizzando pinze curve piccole, esporre con attenzione una piccola porzione dell'arteria safena. Prestare attenzione a non danneggiare la vena femorale o il nervo femorale. Durante questa esposizione, è molto importante pulire accuratamente l'arteria.
Successivamente, posizionare due asole di legatura libere al di sotto dell'arteria safena e legare un'asola di legatura vicino all'estremità distale dell'arteria. Quindi posizionare una pinza microvascolare lungo l'arteria al di sopra della legatura e chiudere la pinza per arrestare il flusso sanguigno. Applicare immediatamente una goccia di papaverina per dilatare l'arteria e prevenire spasmi di fase.
Successivamente, utilizzando il legaccio, sollevare l'arteria safena ed effettuare una piccola incisione arteriotomica mediante un ago da 24 gauge. Poi sollevare i lembi dell'incisione e inserire lentamente un ago per vene o un ago guida all'interno del lume dell'arteria. A questo punto, inserire con attenzione un catetere per embolectomia arteriosa nell'arteria safena.
Procedere delicatamente per evitare rotture. Quindi rimuovere il dispositivo di presa della vena e rilasciare la pinza microvascolare sull'arteria. Per creare la lesione, avanzare innanzitutto il catetere a palloncino fino al terzo segno.
Posizionare il catetere approssimativamente da due a cinque centimetri al di sopra della biforcazione iliaca. Successivamente, gonfiare il palloncino con 0,1 millilitri di soluzione salina fisiologica. A questo punto, applicare una molletta sul catetere e ritirarlo di sei centimetri ruotandolo per danneggiare il tessuto.
Dopo il ritiro, sgonfiare il palloncino. Per garantire una dilatazione completa dell'endotelio, ripetere il processo altre due volte. Quindi rimuovere il catetere e legare immediatamente il laccio emostatico appena al di sopra del sito di arteriotomia per arrestare l'emorragia.
Successivamente, applicare un antisettico adeguato intorno alla perforazione della ferita e rimuovere i coaguli di sangue con un batuffolo. Infine, chiudere l'incisione cutanea e disinfettare la sede dell'intervento chirurgico con soluzione di povidone-iodio. Quindi ripetere l'intero procedimento chirurgico sull'arteria iliaca controlaterale utilizzando il secondo catetere.
Dopo l'intervento chirurgico, pulire innanzitutto l'unto abtonico dai fianchi del coniglio. Successivamente somministrare sulfadoxina e trimethoprim. Quindi trasferire il coniglio con il cuscinetto riscaldante in una gabbia di recupero pulita, insieme a una patch di monitoraggio e clip.
Una volta che l'animale recupera la decubito esterna ed è in grado di deambulare, riporlo nella sua gabbia di origine. Per la gestione del dolore, somministrare buprenorfina. A questo punto, iniziare ad alimentare l'animale con una dieta aterogena per il tempo necessario.
Per raccogliere il lino sottile precoce, due o quattro settimane dopo l'intervento chirurgico, anestetizzare innanzitutto il coniglio e quindi sopprimere il coniglio con un'incisione intercardinale. Successivamente, aprire l'addome ed esporre il retroperitoneo. Poi seguire l'aorta verso la biforcazione iliaca e legarla al di sopra della biforcazione.
Procedere rimuovendo con attenzione i tessuti circostanti e isolando entrambe le arterie iliache. Ora dissezionare entrambe le arterie e immergerle in PBS freddo su ghiaccio. In seguito, rimuovere i coaguli utilizzando pinzette e dividere ciascuna arteria in 46 segmenti.
Quindi, immergere immediatamente i segmenti in uno stampo contenente composto OCT e congelare rapidamente i tessuti in azoto liquido. Conservare i tessuti a meno 80 gradi Celsius e successivamente colorare sezioni di cinque micron di spessore utilizzando metodologia standard. L'induzione di lesione da palloncino delle arterie iliache è stata eseguita con successo senza complicazioni in meno di un'ora.
I conigli sono stati recuperati entro un'ora e/o apparivano in buona salute senza perdita di peso significativa. Non si sono verificate complicazioni postoperatorie. Dopo quattro settimane di dieta aterogena, tutti i conigli presentavano ipercolesterolemia.
La combinazione di un'inflizione da palloncino e una dieta ricca di colesterolo ha determinato cambiamenti strutturali nella parete vascolare, portando allo sviluppo di placche aterosclerotiche entro due settimane. Arterie iliache non lesionate e danneggiate con il palloncino sono state isolate dallo stesso animale e confrontate. Le placche sono state caratterizzate da infiltrazione lipidica, nonché da migrazione e proliferazione delle cellule muscolari lisce.
Il lino continua a crescere nei vasi danneggiati mentre la dimensione del lume continua a ridursi. I cambiamenti risultanti erano molto pronunciati già dopo quattro settimane. Dopo due e quattro settimane, la quantificazione morfometrica ha rivelato un aumento dello spessore intima-media, un aumento dell'area della placca, una riduzione dell'area del lume e, infine, un aumento dell'accumulo di lipidi.
La colorazione con l'anticorpo anti actina alfa delle cellule muscolari lisce reagisce con l'actina muscolare, identificando così le cellule muscolari lisce vascolari. La colorazione con l'anticorpo monoclonale 11 rivela invece il citoplasma dei macrofagi. Insieme, queste colorazioni mostrano in che misura sia le cellule muscolari lisce sia i macrofagi proliferano nella placca aterosclerotica nei vasi danneggiati.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione della sicurezza automobilistica e saper eseguire facilmente un danno traumatico alle arterie iliache del coniglio. Questo danno, associato a una dieta aterogena, porta allo sviluppo di placche nelle arterie iliache in modo omogeneo e prevedibile nel tempo.
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Panoramica
Questo protocollo descrive un metodo per indurre placche aterosclerotiche nei conigli attraverso l'interruzione chirurgica dell'endotelio delle loro arterie iliache sinistre e l'alimentazione con una dieta aterogena. L'arteria iliaca viene scelta per la sua somiglianza con l'arteria coronaria umana, rendendola un modello pertinente per lo studio dello sviluppo delle placche.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Aterosclerosi
- Modelli Animali
- Ricerca Cardiovascolare
Sfondo
- L'aterosclerosi è una delle principali cause di morte nei paesi industrializzati.
- Comprendere la formazione delle placche è fondamentale per sviluppare strategie di prevenzione.
- L'arteria iliaca del coniglio rappresenta un modello adeguato grazie alle sue somiglianze anatomiche con le arterie coronariche umane.
- Questo studio mira a valutare gli effetti dell'aterosclerosi indotta su diversi parametri finali.
Scopo dello studio
- Indurre placche aterosclerotiche nei conigli per scopi di ricerca.
- Studiare i meccanismi dello sviluppo e della rottura delle placche.
- Valutare l'efficacia di nuovi dispositivi terapeutici e interventi.
Metodi Utilizzati
- Interruzione chirurgica dell'endotelio nell'arteria iliaca sinistra.
- Alimentazione dei conigli con una dieta aterogena per favorire la formazione di placche.
- Confronto della composizione della placca nell'arteria iliaca rispetto a quella nell'aorta.
- Valutazione di parametri morfometrici e angiografici mediante dispositivi prodotti commercialmente.
Risultati principali
- Induzione con successo di placche aterosclerotiche nel modello di coniglio.
- Dimostrazione della procedura da parte di Aurelien Frobert.
- Confronto delle caratteristiche delle placche tra arterie iliache e aortiche.
- Informazioni sul potenziale di interventi terapeutici nell'aterosclerosi.
Conclusioni
- L'arteria iliaca del coniglio è un modello prezioso per lo studio dell'aterosclerosi.
- Questo metodo può aiutare nella valutazione di nuovi trattamenti per la gestione delle placche.
- Sono necessarie ulteriori ricerche per esplorare le implicazioni di questi risultati.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale Esecutiva
Il modello di lesione da palloncino dell'arteria iliaca del coniglio accelera lo sviluppo della placca aterosclerotica, consentendo una valutazione rapida di interventi terapeutici entro un arco temporale di due settimane. Questo approccio supporta la validazione del bersaglio e la riduzione del rischio meccanicistico nella scoperta di farmaci cardiovascolari, fornendo un sistema riproducibile e rilevante per la malattia che riproduce la patologia coronarica umana. Il modello aumenta la sicurezza predittiva negli studi preclinici fornendo endpoint morfometrici e angiografici quantificabili per la valutazione dell'efficacia e della sicurezza dei farmaci.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche inducendo un danno endoteliale controllato e l'accumulo di lipidi in un distretto arterioso clinicamente rilevante.
- Valore operativo: Fornisce un metodo standardizzato e riproducibile per generare lesioni aterosclerotiche uniformi, supportando studi sull'interazione con il bersaglio.
- Valore strategico: Accelera i tempi di validazione del bersaglio, permettendo decisioni rapide di prosecuzione o interruzione dello sviluppo basate sulla morfologia della placca e sull'espressione dei biomarcatori.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera metriche quantificabili delle placche, come lo spessore intima-media, l'area lipidica e l'infiltrazione di macrofagi, per la standardizzazione delle letture del saggio.
- Valore operativo: Consente la formazione di lesioni con elevata frequenza di successo e bassa mortalità, supportando campagne di screening su larga scala.
- Valore strategico: Favorisce la prontezza del saggio per la valutazione degli effetti farmacologici sulla stabilizzazione della placca, sull'infiammazione e sull'accumulo lipidico.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Offre un sistema rilevante per la malattia con una composizione delle placche simile a quella umana, inclusa la proliferazione delle cellule muscolari lisce e le cellule schiumose di origine macrofagica.
- Valore operativo: Permette il monitoraggio longitudinale dell'evoluzione della placca mediante quantificazione morfometrica a intervalli definiti (ad esempio, due e quattro settimane).
- Valore strategico: Favorisce l'allineamento traslazionale dei biomarcatori correlando le caratteristiche delle lesioni con la risposta terapeutica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il modello si inserisce nel percorso di scoperta cardiovascolare, sostenendo la validazione precoce del bersaglio fino alla valutazione dell'efficacia preclinica, fornendo un modello di aterosclerosi rapido e quantificabile.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sui percorsi aterogenici mediante la formazione indotta e dipendente dal tempo di placche nell'arteria iliaca.
- Screening: Permette la valutazione standardizzata di composti attraverso lo sviluppo riproducibile di lesioni e parametri misurabili come la riduzione dell'area del lume e l'ispessimento intimale.
- Analisi: Fornisce dati morfometrici e angiografici (ad esempio, area della placca, accumulo di lipidi) che consentono un confronto oggettivo tra gruppi trattati.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla validazione preclinica modellando una patologia simile a quella coronarica umana e permettendo la valutazione degli effetti di dispositivi o farmaci sulla composizione della placca.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una piattaforma riutilizzabile per test iterativi di terapie cardiovascolari in progetti multipli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Fornisce informazioni meccanicistiche sui percorsi di sviluppo della placca, riducendo l'ambiguità nella validazione degli obiettivi.
- Valore operativo: Garantisce riproducibilità e standardizzazione attraverso protocolli chirurgici e dietetici definiti, con elevati tassi di successo.
- Valore strategico: Migliora l'efficienza del capitale accelerando i tempi preclinici e riducendo il rischio di fallimento in fasi avanzate grazie a una riduzione precoce del rischio biologico.
- Impatto sul portafoglio: Permette una priorizzazione dei candidati adeguata al rischio, basata sugli effetti modificatori della placca e sui profili di sicurezza.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in chirurgia vascolare su roditori, anestesia e assistenza postoperatoria.
- È subordinato all'accesso a cateteri a palloncino, piattaforme chirurgiche e infrastrutture di imaging o di istologia per l'analisi degli endpoint.
- Necessita di standardizzazione tra i gruppi per garantire una lunghezza costante della lesione, una durata uniforme della dieta e procedure di elaborazione dei tessuti riproducibili.
- Le considerazioni per l'adattamento includono il metabolismo lipidico specifico della specie e le differenze nella composizione delle placche rispetto alla malattia umana.
- I limiti pratici comprendono la finestra di induzione di due settimane, che potrebbe non riflettere la complessità cronica delle placche o la calcificazione osservate nell'aterosclerosi umana avanzata.
