Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare la cinetica della sintesi del primer e del filamento ritardato del DNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della replicazione del DNA, come ad esempio come i primer vengano formati dalla DNA primasi, trasferiti alla DNA polimerasi e utilizzati da quest'ultima. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'identificazione dei passaggi chiave durante la sintesi dei frammenti di Okazaki.

Dato che in questo esperimento vengono utilizzati materiali radioattivi, è necessario seguire tutte le normative istituzionali relative all'uso sicuro e allo smaltimento dei materiali radioattivi. Iniziare prelevando aliquote di due microlitri di tampone colorante in formammide in otto tubi in polipropilene da 1,5 millilitro, pari al numero di punti temporali da analizzare. Successivamente, preparare una miscela da 20 microlitri composta da tampone, ATP, CTP, CTP marcato sul gruppo alfa-fosfato con P32, stampo di DNA a singolo filamento e la proteina gene quattro, o GP quattro primasi-elicasi.

Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, utilizzare una pipetta per prelevare due microlitri della miscela e mescolarli con due microlitri di tampone colorato con formammide in uno dei tubi da 1,5 millilitri preparati in precedenza. Questo è il controllo senza reazione.

Aggiungere due microlitri di cloruro di magnesio 0,1 M alla miscela di reazione e avviare immediatamente un cronometro. A intervalli di 10 secondi, prelevare manualmente campioni di due microlitri della miscela di reazione e mescolarli con il colorante in formammide nei tubi da 1,5 millilitri. Dopo aver raccolto tutti i punti temporali, riscaldare i campioni in un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Caricare aliquote dei campioni su un gel denaturante per elettroforesi. Iniziare questa procedura preparando le miscele di reazione. Preparare 400 microlitri di soluzione A contenente buffer, esamero GP4, stampo di DNA a filamento singolo, dNTPs, ATP, CTP e CTP marcato sul gruppo alfa-fosfato con P32.

Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente un buffer X e 20 millimolari di cloruro di magnesio. Successivamente, configurare lo strumento per il flusso con quench rapido. Accendere lo strumento e, dopo che appare il menu principale, digitare sette sulla tastiera dello strumento per spostare il driver della siringa nella posizione iniziale.

Aprire la posizione della siringa del tampone per il caricamento. Riempire la siringa C con la soluzione di arresto della reazione, quindi utilizzando una siringa da 10 millilitri riempire i serbatoi del tampone dello strumento A e B con il tampone. Rimuovere le bolle d'aria spingendo avanti e indietro gli stantuffi.

Modificare le posizioni delle manopole per sparare. Digitare due per regolare la posizione della barra del driver della siringa. Premere il pulsante di regolazione verso il basso per abbassare la siringa fino a quando il tampone non esce dal loop di uscita.

Premere esc per tornare al menu principale. Per lavare i tubi, collegare la linea di uscita a un vuoto. Modificare le manopole del campione per eseguire il risciacquo.

Posizionare le manopole in posizione orizzontale per chiudere la siringa del tampone. Accendere il vuoto, immergere i due anelli di lavaggio in acqua per 10 secondi e successivamente in metanolo per 10 secondi. Asciugare gli anelli aspirando aria per circa 15 secondi, o fino a completa asciugatura.

Per caricare i campioni, posizionare la manopola del campione su "load". Inserire la soluzione A in una siringa da un millilitro, collegare la siringa a uno dei porti di caricamento del campione; nello stesso modo, inserire la soluzione B nel porto di caricamento opposto. Iniziare la raccolta dei punti temporali digitando uno nel menu principale per un'esecuzione con flusso di arresto rapido.

Immettere il tempo di reazione e premere invio. Verrà visualizzato il numero del ciclo di reazione da utilizzare. Passare al ciclo di reazione richiesto.

Dopo aver lavato il tubo come mostrato in precedenza, ruotare le manopole del campione per caricare. Caricare le miscele di reazione nei loop del campione fino a poco al di fuori del compartimento centrale di miscelazione. Ruotare tutte le manopole per attivare lo scatto e verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta.

Posizionare una provetta da 1,5 millilitri all'estremità del loop di uscita. Premere avvio per eseguire la reazione. Dopo aver ripetuto la procedura di lavaggio del tubo, ricaricare le siringhe del buffer A e B fino a quando non raggiungono il pistone della siringa del buffer.

Ripetere i passaggi per l'esecuzione della reazione per ciascun punto temporale desiderato, con una sola eccezione: non caricare la soluzione B quando si arresta il controllo al tempo zero. Al termine del campionamento, premere escape per tornare al menu principale. Premere sette per riportare il driver della siringa del tampone alla sua posizione iniziale.

Avviare la pulizia dello strumento rimuovendo le siringhe della miscela di reazione; ruotare la manopola di caricamento del campione sulla posizione di caricamento. Sotto vuoto, lavare ciascun loop del campione con 10 millilitri di idrossido di sodio, acido fosforico e metanolo, rispettivamente. Premere verso il basso i pistoni di tutte e tre le siringhe per recuperare i tamponi di reazione e di arresto della reazione.

Lavare le siringhe con cinque millilitri di acqua almeno due volte. Riempire nuovamente le siringhe con cinque millilitri di acqua, ruotare le manopole sulla posizione di accensione, attivare il vuoto e abbassare il pistone mediante il comando da tastiera per rimuovere l'acqua. Lavare il tubo come dimostrato in precedenza.

Infine, spegnere lo strumento per l'analisi con flusso a quench rapido. I campioni vengono successivamente analizzati come descritto nel protocollo testuale. Questi risultati sono stati ottenuti prelevando manualmente campioni da una reazione di sintesi del primer catalizzata dalla GP quattro in condizioni di turnover multiplo.

Il precursore marcato CTP mostra la mobilità più elevata e migra verso il fondo del gel, seguito da specie che migrano più lentamente, corrispondenti al colorante e ai tetraribonucleotidi sintetizzati dalla GP quattro. A seconda della durata dell'incubazione e del contesto della sequenza del template, possono essere osservati ulteriori prodotti marcati corrispondenti a oligomeri più lunghi. Quando si utilizza uno strumento di arresto rapido per esaminare la reazione catalizzata dalla GP quattro su scale temporali comprese tra alcuni secondi e pochi millisecondi, è evidente che l'accumulo del primer non è lineare, ma presenta un andamento bifasico indicato dalla linea continua.

Questo suggerisce che la formazione del prodotto è rapida e che il rilascio è il passaggio limitante nella condizione di stato stazionario. La linea tratteggiata rappresenta una curva ipotetica dell'andamento che si otterrebbe se la formazione dell'innesco da parte della GP quattro non procedesse con un brusco aumento nella fase pre-stazionaria. Un esperimento di sintesi dell'innesco in condizioni di singolo turnover fornisce informazioni sulla formazione e sul decadimento delle specie intermedie durante la conversione del substrato in prodotto.

Un'immagine del gel mostra il corso temporale della formazione di tetrameri. Il grafico mostra la formazione di intermedi rispetto al tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti, se effettuata correttamente.

Non dimenticare che lavorare con reagenti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come un adeguato schermaggio devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.