Name: Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA In Vitro Dai replica proteine batteriofago T7 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri la cinetica della sintesi del filamento ritardato del DNA utilizzando le proteine di replicazione del batteriofago T7. Questo metodo consente di identificare i passaggi chiave nella sintesi dei frammenti di Okazaki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ringraziamo i membri del laboratorio C.C.R. per i commenti e S. Moskowitz per la preparazione delle figure. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health Grants F32GM101761 (A.J.H.) e GM54397 (C.C.R.).

NOTA: Seguire tutte le normative istituzionali per quanto riguarda l&#39;uso sicuro e lo smaltimento di materiale radioattivo, incluso ma non limitato a, l&#39;utilizzo di dispositivi di protezione individuale, come guanti, occhiali di sicurezza, camice da laboratorio, e scudi acrilico appropriate. NOTA: Il buffer standard consiste di 40 mM HEPES-KOH, pH 7,5, 50 mM di potassio glutammato, 5 mM DTT, 0,1 mM EDTA (questo buffer viene pre-fatta ad una concentrazione 5x) e 0,3 mM di ogni dNTP. Proteine replica T7 sono purificati come descritto 8, 9, 10. DNA a singolo filamento contenente un singolo sito di riconoscimento T7 primasi (5&#39;-GGGTC-3 &#39;, 5&#39;-GTGTC-3&#39;, 5&#39;-TGGTC-3 &#39;) possono essere acquistati da una varietà di aziende sintesi del DNA (la lunghezza il ssDNA può dipendere l&#39;enzima di scelta, per T7 primasi, un pentamero è la lunghezza minima template per sintetizzare un primer integrale 11, come il criptico C è essenziale, tuttavia, se il primer deve essere prorogato di polimerasi, nucleotidi aggiuntivo deve essere presente alla fine del 3 &#39;del modello. Le reazioni vengono avviate mediante aggiunta di una concentrazione finale di 10 mM MgCl 2 e incubate a 25 ° C. Campionamento manuale funziona bene per time-punti pari o superiore a 5 secondi. Se sono necessari punti temporali più brevi di questo, si consiglia di utilizzare uno strumento di flusso rapido tempra per ottenere dati precisi. 1. Multiple-fatturato Primer Sintesi Reaction di campionamento manuale <ol><li> Prima di iniziare l&#39;esperimento, un&#39;aliquota 2 ml di tampone dye formamide (93% (v / v) formammide, 50 mM EDTA, 0,01% xilene cianolo e 0,01% blu di bromofenolo) in 8 1.5 mL tubi di polipropilene. In generale, il numero di tubi è uguale al numero di punti temporali analizzati. </li><li> Preparare una miscela costituita da 20 l 1x tampone, 0,1 mM ATP e CTP, 0,25 mCi / mL [α- 32 P] CTP, 0.1 micron SSDmodello di NA, e 0,1 micron GP4 (espressa come concentrazione esamero - 0,6 micron monomero). </li><li> Incubare la miscela a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Rimuovere 2 ml della miscela utilizzando una pipetta e mescolare con 2 ml di buffer colorante formammide in una provetta da 1,5 ml preparata al punto 1.1 per il controllo nessuna reazione (tempo zero). </li><li> Aggiungere 2 ml di 0,1 M MgCl 2 di miscela di reazione (ad una concentrazione finale di 10 mM). </li><li> prelevare manualmente 2 campioni ml di miscele di reazione utilizzando una pipetta ad intervalli di 10 s e mescolare con la tintura formammide dosata in provette da 1,5 ml preparata al punto 1.1. </li><li> campioni di calore a 95 ° C per 5 min in un blocco di calore. </li><li> Caricare aliquote di campioni su un gel denaturante. I piccoli prodotti di primer tetraribonucleotide sintetizzati dal primasi T7 sono risolti bene su un 0,4 mm di spessore 25% acrilammide: bisacrylamide (19: 1), 3 M urea, 1x TBE (100 mM Tris-borato, 1 mM EDTA). </li><li> Mettere tutto il gel sulla crcarta PHY e coprire con pellicola trasparente. gel secco utilizzando un essiccatore gel. </li><li> Preparare una serie di diluizioni del resto della miscela di reazione e macchiare lo stesso volume caricati sul gel cromatografia su carta, cioè, individuare 4 ml della diluizione se 4 ml di campione sono stati caricati. NOTA: Questo servirà come la curva standard per determinare la concentrazione dei prodotti formati durante la reazione. Ad esempio, cinque diluizioni utilizzando tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA) funzionano bene, coprono una gamma 1:25 a 1: 15.625 (5 2 -5 6), ma le diluizioni dovrebbero essere regolato a seconda del livello di attività. </li><li> Esporre gel secco e standard utilizzando uno schermo phosphorimager. Quantificare la radioattività nella serie di diluizioni e costruire una curva standard come descritto 8, 12 NOTA: L&#39;inclusione di T7 DNA polimerasi alla miscela di reazione consente di Exala mia l&#39;uso di primer tetraribonucleotide da questo enzima. In modo ottimale, la concentrazione polimerasi va saturando per semplificare l&#39;interpretazione dei dati. Una concentrazione polimerasi di 0,4 micron o superiore dà buoni risultati. Inoltre, l&#39;effetto di altri proteine, come legame al DNA a singolo filamento di proteine, su entrambi sintesi primer o ritardo-strand iniziazione può essere esaminato in questo modo. </li></ol> 2. Multiple-fatturato Primer Sintesi di reazione con uno strumento Rapid-tempra <ol><li> Preparazione di miscele di reazione <ol><li> Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 0,2 micron GP4 esamero, 0,2 um modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 0,2 mM ATP e CTP (compresi 0,5 mCi / ml [α- 32 P] CTP. </li><li> Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl 2. </li></ol></li><li> Il funzionamento dello strumento flusso rapido tempra <ol><li> Accendere rapstrumento flusso id-tempra; dopo la visualizzazione del menu principale, 7 sulla tastiera dello strumento per spostare la siringa temporizzata alla posizione iniziale. </li><li> posizione siringa aperta buffer &quot;LOAD&quot;. </li></ol></li><li> Siringhe Caricamento tampone <ol><li> Allegare una contenente tampone 10 ml siringa alla porta dell&#39;unità siringa. Cambiare posizione della manopola siringa per &quot;LOAD&quot;. </li><li> Utilizzando 10 siringhe ml, riempire tampone strumento serbatoio A e B con 10 mM Tris, pH 7,5, 1 mM EDTA e riempire la siringa C con soluzione di raffreddamento (250 mM EDTA e 0,2% SDS). Rimuovere le bolle d&#39;aria spingendo pistoni dentro e fuori. </li><li> posizioni Modifica manopola su &quot;FIRE&quot;. Tipo 2 per regolare la posizione della barra siringa temporizzata. Premere il tasto &quot;REGOLAZIONE DOWN&quot; per abbassare la siringa fino a tampone viene fuori il loop di uscita: (7-va giù continuamente; 8-grande passo verso il basso; 9-piccole passo verso il basso). Tipo &quot;ESC&quot; per tornare al menu principale. </li></ol></li><li> tubi Wash <ol><li> Attlinea di uscita ach al vuoto. Modificare le manopole di esempio a &quot;filo&quot;. Vicino tampone siringa impostando le manopole in posizione orizzontale. Accendere vuoto e immergere le anse a filo 2 in H 2 O per 10 s, poi immergere in MeOH per 10 s. loop Dry aspirando aria per ~ 15 s, o fino a secco. </li></ol></li><li> Caricamento campioni <ol><li> Cambiare posizione della manopola di esempio per &quot;LOAD&quot;. Mettere la soluzione A alla siringa da 1 ml. Inserire la siringa in una delle porte di carico campione. Ripetere l&#39;operazione per la soluzione B, e posto in fronte al porto di carico del campione. </li></ol></li><li> Raccolta dei termini di punti <ol><li> Nel menu principale, digitare 1 per eseguire tempra-flow. Inserire tempo di reazione (s) e premere il tasto &quot;ENTER&quot;. verranno visualizzati il ​​numero ciclo reazione da usare. Passare a ciclo reazione desiderata. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4. </li><li> Girare le manopole di esempio per &quot;caricare&quot;. reazione del carico mescola in loop del campione fino alle porte del vano di miscelazione centrale. Girare tutte le manopole a &quot;FIRE &quot;. Verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta. </li><li> Mettere 1,5 ml di tubo sulla fine del ciclo di uscita. Premere il tasto &quot;Go&quot; per avviare la reazione. Ripetere procedura di lavaggio nel passaggio 2.2.4. Ricarica siringhe tampone A e B fino a colpire il conducente. </li><li> Ripetere i passaggi 2.2.6.2-2.2.6.3 per ogni punto di tempo desiderato. Eccezione: Non caricare soluzione contenente il reagente di partenza (cioè, MgCl 2 in questo caso) quando tempra il controllo del tempo-zero. </li><li> Al termine la raccolta di campioni, immettere &quot;ESC&quot; per tornare al menu principale. Premere il tasto &quot;7&quot; per tornare conducente tampone siringa alla sua posizione iniziale. </li></ol></li><li> Strumento clean-up <ol><li> Rimuovere reazione siringhe miscela. Ruotare la manopola di carico campione in posizione &quot;LOAD&quot;. Sotto vuoto, lavare ogni ciclo campione con 10 mL di 0,2 N NaOH, seguito da 10 mL 0,3 NH 3 PO 4 e 10 mL di MeOH. </li><li> Girare le manopole siringa in posizione &quot;LOAD&quot;. Premere verso il basso tutti i 3 syrpistoni Inge per recuperare i buffer di reazione e di tempra. Lavare siringhe con 5 mL H 2 O almeno due volte. </li><li> Riempire le siringhe di nuovo con 5 ml di H 2 O e girare le manopole in posizione &quot;FIRE&quot;. Cambiare posizioni della manopola e accendere vuoto per rimuovere H 2 O. filo come al punto 2.2.4. Spegnere strumento. Nota: i prodotti vengono analizzati come descritto nei passaggi 1.7-1.12. Inoltre, polimerasi T7 DNA e altre proteine ​​replica possono essere aggiunti nella miscela di reazione per analizzare il loro effetto sulla sintesi primer o estensione. </li></ol></li></ol> 3. Single-fatturato Primer Sintesi di reazione NOTA: Single-fatturato test di primer sintesi / estensione vengono effettuate in modo simile a reazioni multiple di fatturato, con alcune importanti differenze: questi test seguono la conversione del radiomarcato ATP in primer o di estensione prodotti, tuttavia la concentrazione di substrati e proteine sono consideBly più alto. Inoltre, per raggiungere risoluzione millisecondo per consentire l&#39;analisi della reazione di sintesi di primer, si deve utilizzare una macchina flusso rapido raffreddamento. <ol><li> Preparazione delle miscele di reazione. <ol><li> Preparare 400 ml di soluzione A, contenente tampone 1x, 3 micron esamero GP4, 6 micron modello ssDNA, 0,6 mm dNTP, 1 mM CTP, e 2 nm [γ- 32 P] ATP. Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente tampone 1x e 20 mm MgCl 2. </li></ol></li><li> Il funzionamento del flusso Rapid-tempra <ol><li> Effettuare le reazioni come descritto al punto 2.2. Eventualmente aggiungere polimerasi T7 DNA o proteina legante T7-stranded DNA singola ad una concentrazione di 15 mM e 20 mM, rispettivamente. In questo caso, i prodotti di estensione si accumulano in un regime di tempo che consente il campionamento manuale della reazione. </li></ol></li></ol> Analisi 4. I dati <ol><li> Fit curve di avanzamento dei prodotti a dei minimi non linearemodelli piazze utilizzando il software disponibile in commercio in grado di minimi quadrati adatta e / o integrazione numerica. I dettagli dell&#39;operazione saranno variano a seconda del software utilizzato, ma al di sotto sono forme generalizzate di equazioni utilizzate per il montaggio dei dati. </li><li> Determinare la velocità di formazione del prodotto di molteplici reazioni di sintesi fatturato iniettore inserendo progredire curve ad una equazione lineare. Se c&#39;è una significativa curvatura, utilizzare il metodo tasso iniziale 13, 14 inserendo i dati ad una singola funzione esponenziale: y = A (e - k t), dove y è la concentrazione del prodotto, A è l&#39;ampiezza reazione, k è la costante di velocità osservata, t è il tempo, espresso in secondi. La pendenza della retta tangente al tempo = 0 è il tasso iniziale. NOTA: reazioni di sintesi di primer stato Fit pre-stabili ad una equazione lineare o per l&#39;equazione di stato pre-stazionario scoppiare y = A (e - BU Kprimo t) + tasso ss t, dove A è l&#39;ampiezza di reazione, k scoppio è la costante di velocità osservata per lo scoppio stato pre-stazionario, il tasso ss è lo stato stazionario tasso ss = k gatto [enzima]), t è il tempo , in secondi. Fit reazioni di sintesi di primer singolo fatturato progresso curve ad un singolo esponenziale funzione y = A (e - k t). Nel caso di GP4, inserire i dati per integrazione numerica 15, ad un modello con tre NTP gradini di condensazione, in cui ogni intermedio è in equilibrio con l&#39;enzima, utilizzando un software disponibile in commercio. </li></ol>

<ol><li>Kornberg, A., Baker, T. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKornberg%2C+A+%22DNA+replication%22">DNA replication</a>. , 2nd, W.H. Freeman. (1992).</li>
<li>Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motors%2C+switches%2C+and+contacts+in+the+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Motors, switches, and contacts in the replisome.</a> Annu Rev Biochem. 78, 205-243 (2009).</li>
<li>Mendelman, L. V., Notarnicola, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+bacteriophage+T7+gene+4+proteins+in+providing+primase+and+helicase+functions+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Roles of bacteriophage T7 gene 4 proteins in providing primase and helicase functions in vivo.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (22), 10638-10642 (1992).</li>
<li>Qimron, U., Lee, S. J., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+initiation+and+extension+by+T7+DNA+primase%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Primer initiation and extension by T7 DNA primase.</a> EMBO J. 25 (10), 2199-2208 (2006).</li>
<li>Kato, M., Ito, T., Wagner, G., Richardson, C. C., Ellenberger, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modular+architecture+of+the+bacteriophage+T7+primase+couples+RNA+primer+synthesis+to+DNA+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Modular architecture of the bacteriophage T7 primase couples RNA primer synthesis to DNA synthesis.</a> Mol Cell. 11 (5), 1349-1360 (2003).</li>
<li>Kusakabe, T., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+4+DNA+primase+of+bacteriophage+T7+mediates+the+annealing+and+extension+of+ribo-oligonucleotides+at+primase+recognition+sites%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Gene 4 DNA primase of bacteriophage T7 mediates the annealing and extension of ribo-oligonucleotides at primase recognition sites.</a> J Biol Chem. 272 (19), 12446-12453 (1997).</li>
<li>Lee, S. J., Zhu, B., Hamdan, S. M., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+sequence-specific+template+binding+by+the+DNA+primase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of sequence-specific template binding by the DNA primase of bacteriophage T7.</a> Nucleic Acids Res. 38 (13), 4372-4383 (2010).</li>
<li>Hernandez, A. J., Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primer+release+is+the+rate-limiting+event+in+lagging-strand+synthesis+mediated+by+the+T7+replisome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Primer release is the rate-limiting event in lagging-strand synthesis mediated by the T7 replisome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (21), 5916-5921 (2016).</li>
<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+residue+in+DNA+polymerases+of+the+Escherichia+coli+DNA+polymerase+I+family+is+critical+for+distinguishing+between+deoxy-+and+dideoxyribonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A single residue in DNA polymerases of the Escherichia coli DNA polymerase I family is critical for distinguishing between deoxy- and dideoxyribonucleotides.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (14), 6339-6343 (1995).</li>
<li>Kim, Y. T., Tabor, S., Bortner, C., Griffith, J. D., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+characterization+of+the+bacteriophage+T7+gene+2.5+protein.+A+single-stranded+DNA-binding+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Purification and characterization of the bacteriophage T7 gene 2.5 protein. A single-stranded DNA-binding protein.</a> J Biol Chem. 267 (21), 15022-15031 (1992).</li>
<li>Frick, D. N., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+primases%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">DNA primases.</a> Annu Rev Biochem. 70, 39-80 (2001).</li>
<li>Lee, S. J., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Essential+lysine+residues+in+the+RNA+polymerase+domain+of+the+gene+4+primase-helicase+of+bacteriophage+T7%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Essential lysine residues in the RNA polymerase domain of the gene 4 primase-helicase of bacteriophage T7.</a> J Biol Chem. 276 (52), 49419-49426 (2001).</li>
<li>Cao, W., De La Cruz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+full+time+course+analysis+of+nonlinear+enzyme+cycling+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Quantitative full time course analysis of nonlinear enzyme cycling kinetics.</a> Sci Rep. 3, 2658(2013).</li>
<li>Wang, M. H., Zhao, K. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+determining+kinetic+constants+of+complexing+inactivation+at+identical+enzyme+and+inhibitor+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A simple method for determining kinetic constants of complexing inactivation at identical enzyme and inhibitor concentrations.</a> FEBS Lett. 412 (3), 425-428 (1997).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fitting+enzyme+kinetic+data+with+KinTek+Global+Kinetic+Explorer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Fitting enzyme kinetic data with KinTek Global Kinetic Explorer.</a> Methods Enzymol. 467, 601-626 (2009).</li>
<li>Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+century+of+enzyme+kinetic+analysis%2C+1913%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">A century of enzyme kinetic analysis, 1913.</a> FEBS Lett. 587 (17), 2753-2766 (2013).</li>
<li>Biswas, T., Resto-Roldan, E., Sawyer, S. K., Artsimovitch, I., Tsodikov, O. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+non-radioactive+primase-pyrophosphatase+activity+assay+and+its+application+to+the+discovery+of+inhibitors+of+Mycobacterium+tuberculosis+primase+DnaG%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A novel non-radioactive primase-pyrophosphatase activity assay and its application to the discovery of inhibitors of Mycobacterium tuberculosis primase DnaG.</a> Nucleic Acids Res. 41 (4), e56(2013).</li>
<li>Sanyal, G., Doig, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+DNA+replication+enzymes+as+targets+for+antibacterial+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Bacterial DNA replication enzymes as targets for antibacterial drug discovery.</a> Expert Opin Drug Discov. 7 (4), 327-339 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il fattore più importante nel realizzare questi esperimenti è la disponibilità di enzima purificato altamente attiva. Durante il lavoro con GP4, per esempio, abbiamo scoperto che la memorizzazione dell&#39;enzima purificato in tampone (20 mM fosfato di potassio, pH 7,4, 0,1 mM EDTA, 1 mM DTT) contenente 50% glicerolo a -20 ° C porta ad una riduzione l&#39;attività specifica del preparato nell&#39;arco di pochi mesi. Pertanto ora flash congelamento piccole aliquote di gp4 purificato in 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 50 mM NaCl,...

La replicazione del DNA è una caratteristica conservato di tutta la vita cellulare. Mentre l&#39;identità e il numero dei componenti di replica variano ampiamente, i meccanismi generali sono condivisi tra evoluzione 1. Qui, descriviamo gel a base, discontinue esperimenti cinetici, utilizzando substrati radioattivi, volti a comprendere la cinetica della sintesi del DNA in ritardo filamento in vitro da componenti del replisoma T7. Il meccanismo di replicazione del batteriofago T7 è molto semplice, composto da soli quattro proteine (la DNA polimerasi, GP5, e il suo fattore processività, E. coli tioredossina, le bifunzionali GP4 primasi-elicasi, e la proteina legante il DNA a singolo filamento, GP2. 5) 2. Questa caratteristica lo rende un sistema interessante modello per studiare i meccanismi conservati biochimici coinvolti nella replicazione del DNA. Particolare enfasi è posta sulla formazione di primer ribonucleotide da T7 DNA primasi, una critical passo per l&#39;inizio della sintesi del DNA. Inoltre, si può anche esaminare l&#39;utilizzo di questi primer di polimerasi T7 DNA o altre proteine ​​di replica includendoli nella miscela di reazione. Il T7 primasi-elicasi, GP4, catalizza la formazione di primer per la sintesi del DNA a specifiche sequenze di DNA chiamati siti di riconoscimento primasi, o PRS, (5&#39;-GTC-3 &#39;). La citosina nel PRS è criptico, è essenziale per il riconoscimento del sito, ma non viene copiato nel prodotto 3. Il primo passo nella sintesi di primer da gp4 comporta la formazione del dinucleotide pppAC, che viene poi estesi ad un trimero, ed eventualmente primers tetranucleotide funzionali pppACCC, pppACCA o pppACAC seconda della sequenza nel modello 4. Questi primer possono essere utilizzati da polimerasi T7 DNA per iniziare la sintesi di DNA, che è anche un processo gp4 assistito 5, 6. A questo proposito, il primasidominio stabilizza i brevissimi tetraribonucleotides con il modello, impedendo loro di dissociazione, si impegna DNA polimerasi in maniera atta a garantire il primer / modello nel polimerasi sito attivo 7. Questi passaggi (RNA sintesi di primer, primer per handoff polimerasi, ed estensione) si ripetono in cicli multipli di replicare il filamento in ritardo e devono essere coordinati con la replicazione del filamento principale. I saggi descritti qui sono altamente sensibili e possono essere eseguite in tempi moderata. Tuttavia, essi sono relativamente bassi-throughput e grande cura deve essere esercitata in uso e lo smaltimento dei materiali radioattivi. A seconda della velocità con cui la reazione procede, si potrebbe impiegare uno strumento rapido raffreddamento per ottenere campioni su scale temporali suscettibili per un&#39;analisi significativa degli insegnamenti tempo di reazione sia stazionario o lo stato pre-stazionario. Recentemente, abbiamo usato saggi descritti qui per fornire evidence dell&#39;importanza del rilascio primer dominio primasi del gp4 nell&#39;avvio di frammenti di Okazaki. Inoltre, abbiamo trovato prove di un ruolo di regolamentazione per il T7 DNA a singolo filamento di proteine, gp2.5 vincolante, nel promuovere la formazione di primer efficiente e l&#39;utilizzo 8.

<table><tbody><tr><td>Tris cristalli preimpostati pH 7.5</td><td>SIGMA</td><td>T4128</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>SIGMA</td><td>93362</td><td></td></tr><tr><td>L-Acido glutammico sale di potassio monoidrato</td><td>SIGMA</td><td>G1501&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio esaidrato</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>5958-04</td><td></td></tr><tr><td>1,4-Ditiotreitolo</td><td>J.T. Baker</td><td>F780-02</td><td></td></tr><tr><td>Sodio Dodecil Solfato</td><td>MP Biomedicals</td><td>811030</td><td></td></tr><tr><td>(Ethylenedinitrilo) Acido tetraacetico, sale disodico, diidrato</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>4931-04</td><td></td></tr><tr><td>[&alpha;-32P] CTP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU508H</td><td>radioattivo, adottare misure protettive</td></tr><tr><td>[&gamma;-32P] ATP</td><td>PerkinElmer</td><td>BLU502A</td><td>radioattivo, adottare misure protettive</td></tr><tr><td>100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP&nbsp;</td><td>Affymetrix</td><td>77100</td><td>quattro dNTP parte del set</td></tr><tr><td>100 mM ATP e CTP</td><td>Epicentro</td><td>RN02825</td><td>parte del set NTP</td></tr><tr><td>costrutti ssDNA</td> Integrated <td>DNA Technologies</td><td>N/A</td><td>sequenze personalizzate&nbsp;</td></tr><tr><td>metanolo&nbsp;</td><td>Macron Fine Chemicals</td><td>3017-08</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>Thermo Scientific</td><td>17899</td><td></td></tr><tr><td>blu bromofenolo</td><td>SIGMA</td><td>B8026&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>cilene xyanol&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>X4126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>acrilammide</td><td>SIGMA</td><td>A9099</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Metilenebisacrilammide</td><td>SIGMA</td><td>M7279&nbsp;</td><td>Tossico</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-940</td><td></td></tr><tr><td>Acido borico</td><td>Mallinckrodt Chemicals</td><td>2549</td><td></td></tr><tr><td>Strumento a flusso rapido di estinzione</td><td>Kintek Corp.</td><td>RQF-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Esploratore Kintek</td><td>Kintek Corp.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Kaleidagraph&nbsp;</td><td>Synergy Software</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

cinetica di lagging filamento sintesi del dna<em&gt; in vitro</em&gt; dai replica proteine ​​batteriofago t7

Kinetics of Lagging-strand DNA Synthesis In Vitro by the Bacteriophage T7 Replication Proteins

Qui forniamo protocolli per l'esame cinetico della sintesi di DNA a filamento ritardato in vitro da parte delle proteine di replicazione del batteriofago T7. Il replisoma T7 è uno dei sistemi di replicazione più semplici conosciuti, composto da sole quattro proteine, che è una caratteristica interessante per gli esperimenti biochimici. Particolare enfasi è posta sulla sintesi di primer ribonucleotidici da parte della primasi-elicasi T7, che vengono utilizzati dalla DNA polimerasi per avviare la sintesi del DNA. Poiché i meccanismi di replicazione del DNA sono conservati nel corso dell'evoluzione, questi protocolli dovrebbero essere applicabili, o utili come trampolino di lancio concettuale, ai ricercatori che utilizzano altri sistemi modello. I protocolli qui descritti sono altamente sensibili e un ricercatore esperto può eseguire questi esperimenti e ottenere dati per l'analisi in circa un giorno. L'unica apparecchiatura specializzata richiesta è uno strumento a flusso rapido, ma questa apparecchiatura è relativamente comune e disponibile da varie fonti commerciali. I principali svantaggi di questi saggi, tuttavia, includono l'uso della radioattività e la relativa bassa produttività.

I risultati mostrati in figura 1A sono stati ottenuti come descritto al punto 1 del protocollo, cioè, campionando manualmente una reazione di sintesi di primer catalizzata da GP4 in condizioni multiple-turnover. Qui, una gamma di prodotti dopo elettroforesi su gel può essere osservato mediante CTP marcato con 32 P alla α-posizione in reazioni di sintesi di primer (Figura 1A). Il precursore marcato, CTP, mostra la mobi...

Descriviamo saggi discontinui sensibili basati su gel per esaminare la cinetica dell'inizio del filamento ritardato utilizzando le proteine di replicazione del batteriofago T7.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA<em&gt; In Vitro</em&gt; Dai replica proteine ​​batteriofago T7

Here we provide protocols for the kinetic examination of lagging-strand DNA synthesis in vitro by the replication proteins of bacteriophage T7. The T7 ...

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare la cinetica della sintesi del primer e del filamento ritardato del DNA. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della replicazione del DNA, come ad esempio come i primer vengano formati dalla DNA primasi, trasferiti alla DNA polimerasi e utilizzati da quest'ultima. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'identificazione dei passaggi chiave durante la sintesi dei frammenti di Okazaki.Dato che in questo esperimento vengono utilizzati materiali radioattivi, è necessario seguire tutte le normative istituzionali relative all'uso sicuro e allo smaltimento dei materiali radioattivi. Iniziare prelevando aliquote di due microlitri di tampone colorante in formammide in otto tubi in polipropilene da 1,5 millilitro, pari al numero di punti temporali da analizzare. Successivamente, preparare una miscela da 20 microlitri composta da tampone, ATP, CTP, CTP marcato sul gruppo alfa-fosfato con P32, stampo di DNA a singolo filamento e la proteina gene quattro, o GP quattro primasi-elicasi.Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, utilizzare una pipetta per prelevare due microlitri della miscela e mescolarli con due microlitri di tampone colorato con formammide in uno dei tubi da 1,5 millilitri preparati in precedenza. Questo è il controllo senza reazione.Aggiungere due microlitri di cloruro di magnesio 0,1 M alla miscela di reazione e avviare immediatamente un cronometro. A intervalli di 10 secondi, prelevare manualmente campioni di due microlitri della miscela di reazione e mescolarli con il colorante in formammide nei tubi da 1,5 millilitri. Dopo aver raccolto tutti i punti temporali, riscaldare i campioni in un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti.Caricare aliquote dei campioni su un gel denaturante per elettroforesi. Iniziare questa procedura preparando le miscele di reazione. Preparare 400 microlitri di soluzione A contenente buffer, esamero GP4, stampo di DNA a filamento singolo, dNTPs, ATP, CTP e CTP marcato sul gruppo alfa-fosfato con P32.Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenente un buffer X e 20 millimolari di cloruro di magnesio. Successivamente, configurare lo strumento per il flusso con quench rapido. Accendere lo strumento e, dopo che appare il menu principale, digitare sette sulla tastiera dello strumento per spostare il driver della siringa nella posizione iniziale.Aprire la posizione della siringa del tampone per il caricamento. Riempire la siringa C con la soluzione di arresto della reazione, quindi utilizzando una siringa da 10 millilitri riempire i serbatoi del tampone dello strumento A e B con il tampone. Rimuovere le bolle d'aria spingendo avanti e indietro gli stantuffi.Modificare le posizioni delle manopole per sparare. Digitare due per regolare la posizione della barra del driver della siringa. Premere il pulsante di regolazione verso il basso per abbassare la siringa fino a quando il tampone non esce dal loop di uscita.Premere esc per tornare al menu principale. Per lavare i tubi, collegare la linea di uscita a un vuoto. Modificare le manopole del campione per eseguire il risciacquo.Posizionare le manopole in posizione orizzontale per chiudere la siringa del tampone. Accendere il vuoto, immergere i due anelli di lavaggio in acqua per 10 secondi e successivamente in metanolo per 10 secondi. Asciugare gli anelli aspirando aria per circa 15 secondi, o fino a completa asciugatura.Per caricare i campioni, posizionare la manopola del campione su "load". Inserire la soluzione A in una siringa da un millilitro, collegare la siringa a uno dei porti di caricamento del campione; nello stesso modo, inserire la soluzione B nel porto di caricamento opposto. Iniziare la raccolta dei punti temporali digitando uno nel menu principale per un'esecuzione con flusso di arresto rapido.Immettere il tempo di reazione e premere invio. Verrà visualizzato il numero del ciclo di reazione da utilizzare. Passare al ciclo di reazione richiesto.Dopo aver lavato il tubo come mostrato in precedenza, ruotare le manopole del campione per caricare. Caricare le miscele di reazione nei loop del campione fino a poco al di fuori del compartimento centrale di miscelazione. Ruotare tutte le manopole per attivare lo scatto e verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta.Posizionare una provetta da 1,5 millilitri all'estremità del loop di uscita. Premere avvio per eseguire la reazione. Dopo aver ripetuto la procedura di lavaggio del tubo, ricaricare le siringhe del buffer A e B fino a quando non raggiungono il pistone della siringa del buffer.Ripetere i passaggi per l'esecuzione della reazione per ciascun punto temporale desiderato, con una sola eccezione: non caricare la soluzione B quando si arresta il controllo al tempo zero. Al termine del campionamento, premere escape per tornare al menu principale. Premere sette per riportare il driver della siringa del tampone alla sua posizione iniziale.Avviare la pulizia dello strumento rimuovendo le siringhe della miscela di reazione; ruotare la manopola di caricamento del campione sulla posizione di caricamento. Sotto vuoto, lavare ciascun loop del campione con 10 millilitri di idrossido di sodio, acido fosforico e metanolo, rispettivamente. Premere verso il basso i pistoni di tutte e tre le siringhe per recuperare i tamponi di reazione e di arresto della reazione.Lavare le siringhe con cinque millilitri di acqua almeno due volte. Riempire nuovamente le siringhe con cinque millilitri di acqua, ruotare le manopole sulla posizione di accensione, attivare il vuoto e abbassare il pistone mediante il comando da tastiera per rimuovere l'acqua. Lavare il tubo come dimostrato in precedenza.Infine, spegnere lo strumento per l'analisi con flusso a quench rapido. I campioni vengono successivamente analizzati come descritto nel protocollo testuale. Questi risultati sono stati ottenuti prelevando manualmente campioni da una reazione di sintesi del primer catalizzata dalla GP quattro in condizioni di turnover multiplo.Il precursore marcato CTP mostra la mobilità più elevata e migra verso il fondo del gel, seguito da specie che migrano più lentamente, corrispondenti al colorante e ai tetraribonucleotidi sintetizzati dalla GP quattro. A seconda della durata dell'incubazione e del contesto della sequenza del template, possono essere osservati ulteriori prodotti marcati corrispondenti a oligomeri più lunghi. Quando si utilizza uno strumento di arresto rapido per esaminare la reazione catalizzata dalla GP quattro su scale temporali comprese tra alcuni secondi e pochi millisecondi, è evidente che l'accumulo del primer non è lineare, ma presenta un andamento bifasico indicato dalla linea continua.Questo suggerisce che la formazione del prodotto è rapida e che il rilascio è il passaggio limitante nella condizione di stato stazionario. La linea tratteggiata rappresenta una curva ipotetica dell'andamento che si otterrebbe se la formazione dell'innesco da parte della GP quattro non procedesse con un brusco aumento nella fase pre-stazionaria. Un esperimento di sintesi dell'innesco in condizioni di singolo turnover fornisce informazioni sulla formazione e sul decadimento delle specie intermedie durante la conversione del substrato in prodotto.Un'immagine del gel mostra il corso temporale della formazione di tetrameri. Il grafico mostra la formazione di intermedi rispetto al tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti, se effettuata correttamente.Non dimenticare che lavorare con reagenti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che precauzioni come un adeguato schermaggio devono sempre essere adottate durante l'esecuzione di questa procedura.

kinetics-lagging-strand-dna-synthesis-vitro-bacteriophage-t7

Research

Ricerca

JoVE Journal

Genetics

Genetica

Questo protocollo dimostra una semplice molecola singola tecnica di microscopia a fluorescenza per la visualizzazione di replicazione del DNA da replisomes singoli in tempo reale.

Visualizzazione singola molecola di DNA replica con microscopia a fluorescenza

Descriviamo un metodo per osservare la replicazione in tempo reale di singole molecole di DNA mediate da proteine ​​del sistema di replica batteriofago.

Osservazione diretta del DNA Enzimi Replica utilizzando un singolo-molecola di DNA Stretching Assay

Il destino del replisoma a seguito di una collisione con un testa-a RNA polimerasi (RNAP) è sconosciuta. Troviamo che le bancarelle replisoma su collisione con uno scontro RNAP, ma riprende allungamento dopo lo spostamento del RNAP dal DNA. MFD promuove riavviare la replica, facilitando lo spostamento del RNAP dopo la collisione.

Riavviare diretta di una forchetta di replica in stallo da un Head-On polimerasi RNA

Source: Rustad, M., et al. Synthesis of Infectious Bacteriophages in an E. coli-based Cell-free Expression System. J. Vis. Exp. (2017).This video demonstrates the synthesis of bacteriophages using a cell-free transcription–translation (TXTL) system. A master mix is prepared using a bacterial crude extract, an energy mix, an amino acid mix, an inhibitor for a DNA-degrading enzyme, and bacteriophage DNA, then incubated. The in vitro molecular machinery enables viral protein expression and DNA...

Bacteriophage Synthesis Using a Cell-Free Transcription-Translation System

Una nuova generazione di piattaforme senza cellula trascrizione-traduzione è stata progettata per costruire sistemi biochimici in vitro mediante l'esecuzione di circuiti di gene. In questo articolo, descriviamo come batteriofagi, quali MS2, ΦΧ174 e T7, sono sintetizzati dal loro genoma utilizzando un sistema di TXTL senza cellula e. coli .

Sintesi dei batteriofagi infettive in un e. coli -basato sistema di espressione senza cellula

Un tempo, accurato e riproducibile efficiente quantitativa PCR (qPCR) metodo per enumerare fago T7 è descritto qui. Il protocollo descrive chiaramente la preparazione di DNA genomico dei fagi, preparazione di reazione di PCR, qPCR ciclismo condizioni e analisi dei dati di qPCR.

PCR quantitativa del batteriofago T7 da Biopanning

In questo manoscritto, descriviamo un protocollo per esaminare funzionalmente la trascrizione e l'attività inibitoria di agenti antibatterici che mirano alla trascrizione batterica.

In vitro trascrizione saggi e la loro applicazione in Drug Discovery

Le interazioni RNA-proteina sono al centro di molti processi cellulari. Qui, descriviamo un metodo in vivo per isolare RNA specifico e identificare nuove proteine ad esso associate. Questo potrebbe gettare nuova luce su come gli RNA sono regolati nella cellula.

Novel RNA-Proteine ​​leganti isolamento dalla rapida Metodologia

L'oogenesi della Drosophila continua ad essere eccezionalmente utile nello studio della proliferazione e dell'ereditarietà mitocondriale. Questo manoscritto descrive un protocollo dettagliato utilizzato per marcare il DNA mitocondriale replicante (mtDNA) nelle ovaie adulte di Drosophila con 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), che facilita la scoperta di meccanismi associati all'eredità mitocondriale che erano precedentemente discutibili.

In Situ etichettatura di DNA mitocondriale di replica in Drosophila adulti ovaie di Edu colorazione

Descriviamo qui un approccio relativamente veloce e semplice per mappare i tempi di replicazione dei mammiferi a livello di genoma, dall'isolamento cellulare all'analisi di base dei risultati del sequenziamento. Verrà fornita una mappa genomica di un programma di replicazione rappresentativo seguendo il protocollo.

Determinazione genoma a livello di timing di replicazione del DNA dei mammiferi da contenuti di misura

Scopri la cinetica della sintesi del filamento ritardato del DNA utilizzando le proteine di replicazione del batteriofago T7. Questo metodo consente di identificare i passaggi chiave nella sintesi dei frammenti di Okazaki.

Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA

Esplora altri video