Cinetica di Lagging filamento sintesi del DNA In Vitro Dai replica proteine ​​batteriofago T7

L'obiettivo generale di questa procedura è esaminare la cinetica del primer e della sintesi del DNA a filamento ritardato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della replicazione del DNA, come ad esempio come i primer si formano dalla DNA primasi, vengono trasferiti e utilizzati dalla DNA polimerasi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'identificazione dei passaggi chiave durante la sintesi dei frammenti di Okazaki.

Poiché in questo esperimento vengono utilizzati materiali radioattivi, devono essere seguite tutte le normative istituzionali relative all'uso e allo smaltimento sicuro dei materiali radioattivi. Inizia aliquotando due microlitri di tampone colorante di formammide in otto provette di polipropilene da 1,5 millilitri, pari al numero di punti temporali da analizzare. Successivamente, preparare una miscela da 20 microlitri composta da tampone, ATP, CTP, CTP marcato sul gruppo alfa-fosfato da P32, modello di DNA a filamento singolo e la proteina quattro del gene o elicasi GP quattro primasi.

Incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Dopo cinque minuti, utilizzare un pipettatore per rimuovere due microlitri della miscela e mescolarla con due microlitri di tampone colorante di formammide in una delle provette da 1,5 millilitri preparate in precedenza. Questo è il controllo senza reazione.

Aggiungere due microlitri di cloruro di magnesio 0,1 molare alla miscela di reazione e avviare immediatamente un timer. A intervalli di 10 secondi, prelevare manualmente due campioni di microlitri della miscela di reazione e mescolare con il colorante formamidico nelle provette da 1,5 millilitri. Dopo aver raccolto tutti i punti temporali, riscaldare i campioni in un blocco termico a 95 gradi Celsius per cinque minuti.

Caricare le aliquote dei campioni su un gel denaturante per l'elettroforesi. Iniziare questa procedura preparando le miscele di reazione. Preparare 400 microlitri di soluzione A contenente tampone, GP quattro esameri, modello di DNA a filamento singolo, dNTP, ATP, CTP e CTP marcati sul gruppo alfa-fosfato da P32.

Preparare 400 microlitri di soluzione B, contenenti un tampone X e 20 millimolari di cloruro di magnesio. Quindi, impostare lo strumento a flusso di estinzione rapida. Accendere lo strumento e, dopo che viene visualizzato il menu principale, digitare sette sulla tastiera dello strumento per spostare il driver della siringa nella posizione iniziale.

Aprire la posizione della siringa tampone per caricare. Riempire la siringa C con la soluzione di quench, quindi, utilizzando una siringa da 10 millilitri, riempire i serbatoi tampone dello strumento A e B con il tampone. Rimuovere le bolle d'aria spingendo gli stantuffi verso l'interno e verso l'esterno.

Modificare le posizioni della manopola per sparare. Digitare due per regolare la posizione della barra di trascinamento della siringa. Premere il pulsante di regolazione verso il basso per abbassare la siringa fino a quando il tampone non esce dall'anello di uscita.

Digita esc per tornare al menu principale. Per lavare il tubo, collegare la linea di uscita a un aspirapolvere. Cambiare le manopole del campione in flush.

Impostare le manopole in posizione orizzontale per chiudere la siringa tampone. Accendi l'aspirapolvere, immergi i due anelli di risciacquo in acqua per 10 secondi, quindi immergi il metanolo per 10 secondi. Asciugare gli anelli aspirando aria per circa 15 secondi o fino a quando non sono asciutti.

Per caricare i campioni, modificare la posizione della manopola del campione su caricare. Posizionare la soluzione A in una siringa da un millilitro, collegare la siringa a una delle porte di caricamento del campione, allo stesso modo, posizionare la soluzione B nella porta di caricamento del campione opposta. Iniziare la raccolta dei punti temporali digitandone uno nel menu principale per un'esecuzione del flusso di spegnimento.

Immettere il tempo di reazione e premere invio. Verrà visualizzato il numero dell'anello di reazione da utilizzare. Passare al ciclo di reazione richiesto.

Dopo aver lavato la provetta come dimostrato in precedenza, ruotare le manopole del campione per caricare. Caricare le miscele di reazione nei loop del campione fino a quando non si trova appena fuori dal vano di miscelazione centrale. Ruotare tutte le manopole per sparare e verificare che tutte le manopole siano nella posizione corretta.

Posizionare un tubo da 1,5 millilitri all'estremità dell'anello di uscita. Premi vai per eseguire la reazione. Dopo aver ripetuto la procedura di lavaggio dei tubi, ricaricare le siringhe tampone A e B fino a quando non colpiscono il driver della siringa tampone.

Ripetere i passaggi per eseguire la reazione per ogni punto temporale desiderato, con un'eccezione, non caricare la soluzione B quando si spegne il controllo del punto di tempo zero. Al termine della raccolta di campioni, immettere escape per tornare al menu principale. Premere sette per riportare il driver della siringa tampone nella posizione iniziale.

Avviare la pulizia dello strumento rimuovendo le siringhe della miscela di reazione, ruotare la manopola di caricamento del campione in posizione di carico. Sotto vuoto, lavare ogni circuito del campione con 10 millilitri ciascuno di idrossido di sodio, acido fosforico e metanolo. Premere su tutti e tre gli stantuffi della siringa per recuperare i tamponi di reazione e di spegnimento.

Lavare le siringhe con cinque millilitri di acqua almeno due volte. Riempi nuovamente le siringhe con cinque millilitri d'acqua, ruota le manopole in posizione di fuoco, accendi l'aspirapolvere e abbassa il driver tramite il comando da tastiera per rimuovere l'acqua. Lavare il tubo come dimostrato in precedenza.

Infine, spegnere lo strumento a flusso di estinzione rapida. I campioni vengono successivamente analizzati come descritto nel protocollo di testo. Questi risultati sono stati ottenuti campionando manualmente una reazione di sintesi di primer catalizzata da GP four in condizioni di turnover multiplo.

Il precursore marcato CTP mostra la massima mobilità e migra verso il fondo del gel, seguito da specie a migrazione più lenta, corrispondenti al colorante e ai tetraribonucleotidi sintetizzati da GP quattro. A seconda della durata dell'incubazione e del contesto della sequenza stampo, si possono osservare ulteriori prodotti marcati corrispondenti a oligomeri più elevati. Quando si utilizza uno strumento di tempra rapida per esaminare la reazione catalizzata da GP 4 in scale temporali nell'intervallo di secondi fino a pochi ms, è evidente che l'accumulo di primer non è lineare, ma mostra un profilo bifasico indicato dalla linea continua.

Ciò suggerisce che la formazione del prodotto è rapida e il rilascio è limitante allo stato stazionario. La linea tratteggiata rappresenta un'ipotetica curva di progresso che risulterebbe se la formazione del primer da parte di GP 4 non procedesse con un burst pre-stazionario. Un esperimento di sintesi di primer a singolo turnover fornisce informazioni sulla formazione e il decadimento delle specie intermedie durante la conversione del substrato in prodotto.

L'andamento temporale della formazione dei tetrameri è mostrato dall'immagine del gel. Il grafico mostra la formazione intermedia rispetto al tempo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 90 minuti, se eseguita correttamente.

Non dimenticare che lavorare con reagenti radioattivi può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è necessario prendere sempre precauzioni come un'adeguata schermatura.