Name: Linduzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Impara l'isolamento enzimatico di epatociti primari di topo per studiare le citochine infiammatorie CRP e IL6. Questo metodo offre un'analisi rapida e riproducibile della risposta epatica acuta.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH (R01HL128714 a CF) e (F31DK10236101 a KS) e l&#39;American Heart Association (CF e AG).

Tutti i protocolli di animali e procedure sperimentali sono state approvate dal Comitato Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC) dell &#39;Università di Miami Miller School of Medicine. 1. Preparazione <ol><li> mezzi di perfusione epatica di preriscaldamento e fegato digerire media in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. </li><li> Impostare una pompa di perfusione (30 mL / min). precompilare con attenzione il sistema di tubi della pompa con mezzi di perfusione epatica. Evitare eventuali bolle d&#39;aria nel sistema e preparare il microscopio stereotassica. </li><li> Coat piatti di coltura cellulare utilizzando collagene di tipo I secondo il protocollo del produttore. </li></ol> 2. Il recupero del fegato <ol><li> Anestetizzare il mouse donatore utilizzando ossigeno / inalazione isoflurano (isoflurano 4% / 2 L / min di ossigeno). <ol><li> Mantenere anestesia abbassando isoflurano al 2-2,5% o iniettando ketamina (100 mg / kg di peso corporeo per via intraperitoneale) e xilazina (10 mg / kg di peso corporeo intraperitoneally). Continuo anestesia isoflurano è preferito da ketamina abbassa la pressione sanguigna e può causare epatotossicità. </li></ol></li><li> Posizionare il mouse anestetizzato su un tampone assorbente. Fissare le estremità del topo con del nastro adesivo. </li><li> Shave e disinfettare l&#39;addome del mouse ed eseguire una laparotomia ventrale dal pube fino al confine craniale del fegato con le forbici chirurgiche con punte affilate / smussato. Incidere la parete addominale su entrambi i lati, caudale del diaframma. </li><li> Esporre la vena cava inferiore (IVC) spostando attentamente l&#39;intestino al lato destro. sezionare con cura il tessuto grasso intorno alla IVC utilizzando sterili tamponi punta di cotone e pinze punta angolata. </li><li> Incidere il diaframma sovraepatica e aprire la cavità toracica da due incisioni laterali con le forbici chirurgiche sottili con punte taglienti / appuntiti. Legare l&#39;toracica IVC utilizzando seta chirurgica (5/0). </li><li> Cannulate il infrarenale IVC utilizzando un catetere IV schermato, rimuovere con attenzione l&#39;ago,collegare la pompa di perfusione e iniziare perfusione del fegato. Se eseguita correttamente, il fegato dovrebbe iniziare immediatamente a scottare e si gonfiano. </li><li> Transetto della vena porta che consente il drenaggio adeguato dei mezzi di comunicazione di sangue e perfusione con le forbici chirurgiche sottili. </li><li> Profumato fegato con circa 30 ml di fegato mezzi perfusione, e poi passare a fegato digerire i media (30 ml). Spegnere la pompa di perfusione e rimuovere la cannula volta perfusione è completa. </li><li> esporre delicatamente la regione centrale del fegato e individuare il tessuto connettivo che collega i lobi del fegato. Afferra le fibre che collegano centrali e con attenzione sezionare tutti i tessuti che tengono il fegato in atto e rimuovere delicatamente il fegato. </li><li> Trasferire immediatamente il fegato in un tubo conico da 50 ml in polipropilene contenente 15 ml di fegato digerire media. NOTA: Non c&#39;è tempo-linea specifica per questo passo. Dopo perfusione, il fegato rimane in mezzi Digest per il trasporto ad una cappa sterile coltura cellulare. Tutti spassi ubsequent devono essere eseguite in un ambiente sterile. </li></ol> 3. Isolamento e trattamento delle cellule <ol><li> All&#39;interno di una cappa di coltura cellulare, trasferire il fegato da terreni contenenti digestione 50 mL provetta di polipropilene conica in una piastra di coltura tissutale sterili. </li><li> Utilizzando pinze sterili, strappare delicatamente i quattro lobi del fegato. Se eseguita correttamente, medio digestione dovrebbe diventare torbida a causa di isolare epatociti dal fegato. </li><li> Utilizzando una punta 25 mL pipetta sterile, filtrare il mezzo di digestione torbida attraverso un colino 70 micron cella nylon in una nuova provetta conica da 50 ml in polipropilene per rimuovere le particelle di tessuto non digerito e detriti cellulari. </li><li> Ripetere i punti 3.2 e 3.3 con sterile PBS (PBS). Questo aiuta a rimuovere eventuali residui epatociti dal fegato. </li><li> Centrifugare a 50 xg per 2 minuti a 4 ° C. Aspirare il surnatante contenente detriti cellulari in eccesso e delicatamente risospendere le cellule in 25 ml 1x freddoWilliams &#39;Media E. </li><li> Utilizzando un 25 mL punta pipetta sterile, filtrata del risospensione attraverso un nuovo 70 micron colino cella di nylon in un tubo da 50 ml in polipropilene conica per ottenere una sospensione più pulito. </li><li> Ripetere i punti 3.5 e 3.6 per tre lavaggi aggiuntivi utilizzando freddo Williams &#39;Medium E 1x per ottenere una sospensione di cellule più chiara. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, aspirare il surnatante per rimuovere i detriti delle cellule in eccesso. Risospendere e celle filtranti in 25 ml caldo Williams &#39;Media e 1x che contiene lo scongelamento degli epatociti primari e integratori placcatura attraverso un nuovo 70 micron colino cella di nylon in un tubo da 50 ml in polipropilene conica. </li><li> Contare le celle all&#39;interno della sospensione cellulare 25 mL con un emocitometro. In media si aspettano 15 - 20 milioni di cellule per il fegato adulto. Determinare la vitalità delle cellule utilizzando trypan colorazione blu. </li><li> cellule piastra in 2 ml di Williams &#39;Media e 1x che contiene lo scongelamento degli epatociti primari e supplementi placcatura su un collagene rivestito ce 6-benell cultura del cluster (9 x 10 5 cellule per pozzetto). </li><li> Dopo 4 ore, cambiare media per Williams &#39;Media e 1x che contiene gli integratori di manutenzione epatociti primari. </li><li> Dopo 24 ore, il siero di fame le cellule con medie di Eagle modificato di Dulbecco (DMEM) supporti 1x per 6 ore. </li><li> Trattare cellule con PBS come veicolo, FGF23 (25 ng / mL), LPS (100 ug / mL) o IL-6 (50 ng / ml) in terreno privo di siero e incubare per 24 h. </li></ol> 4. Isolamento di RNA <ol><li> Preparare RNA utilizzando un kit Spin Column commerciale in base alle istruzioni del produttore. </li></ol> 5. Generazione di cDNA da RNA isolato mediante trascrizione inversa <ol><li> Aggiungere 200 ng di campione di RNA isolato dalla provetta. </li><li> Aggiungere 14 ml di-endonucleasi libera H 2 O per PCR tubo dal punto 5.1. </li><li> Aggiungere 4 ml di trascrittasi inversa per provetta PCR dal punto 5.1. </li><li> Risospendere il contenuto con precauzione per fare miscela omogenea; centrifugare delicatamente. </li&gt; <li> Mettere provetta PCR contenente il composto in un termociclatore. Eseguire termociclatore per trascrizione inversa: 1 ciclo di 25 ° C (5 min), 42 ° C (30 min), 85 ° C (5 min) e poi mantenere a 4 ° C. Il prodotto finale sarà il cDNA desiderato. </li></ol> 6. Analisi di celle quantitativa Real-time PCR (qPCR) <ol><li> Preparare la piastra a 96 pozzetti. <ol><li> Mettere tutti i componenti della reazione qPCR su ghiaccio: 1 ml di cDNA, .25 micron di primer in avanti, .25 micron inversione di fondo, 5 ml SYBR Green, 3,5 microlitri PCR acqua di grado per un volume totale di 10 microlitri. Utilizzando SYBR Green, preparare master mix per eseguire tutti i campioni in triplice copia. </li><li> Una volta che il master mix è completo, vortex per rendere omogenea. Aliquota 9 ml di qPCR master mix in ciascun pozzetto di una piastra da 96 WLL. Dopo, aggiungere con cautela 1 ml di cDNA in ciascun pozzetto. Volume di reazione totale sarà di 10 ml. </li><li> Dopo il caricamento è completo, sigillare piastra a 96 pozzetti con otticapellicola adesiva e centrifugare brevemente piastra a 96 pozzetti (50 xg per 1 min). </li></ol></li><li> Campioni eseguito in uno strumento di Real-Time PCR. Mettere sigillato piastra a 96 pozzetti in vero e proprio strumento Time-PCR e campioni Esegui come strumento per le raccomandazioni del produttore. Esempi di cicli standard e veloci sono stati inseriti. <ol><li> Per i parametri di ciclismo normali, utilizzare il seguente: denaturazione iniziale a 94 ° C per 120 s, quindi 40 cicli di 94 ° C per 15 s, 60 ° C per 60 s, e quindi opzionalmente tenere a 4 ° C. </li><li> Per i parametri ciclo rapido: utilizzare il seguente: denaturazione iniziale a 94 ° C per 30 s, quindi 40 cicli di 95 ° C per 5 s, 58 ° C per 15 s, quindi 72 ° C per 10 s. </li></ol></li><li> Fare riferimento al manuale dello strumento per una guida su come analizzare i dati. </li></ol> 7. Analisi dei sopranatanti cellulari di ELISA NOTA: Tutte le operazioni vengono eseguite secondo il protocollo del produttore. </p&gt; <ol><li> Preparazione del campione <ol><li> Dispensare 398 ml di diluente in tubi separati. Pipettare 2 ml del campione surnatante cellulare nella provetta di diluente 398 ml. Ciò fornirà una piega diluizione 200. </li><li> Ripetere il passaggio 7.1.1 per ogni campione da analizzare. </li></ol></li><li> Procedura <ol><li> Pipettare 100 ml di campione diluito 200 volte e uno standard nei pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Incubare la piastra a 96 pozzetti a 25 ° C per 45 minuti su un agitatore per micropiastre a 150 rpm. </li><li> Lavare i pozzetti 5 volte con soluzione tampone di lavaggio 1x. Una volta che l&#39;ultimo lavaggio, rimuovere tutta la soluzione di lavaggio residua con carta assorbente. </li><li> Aggiungere 500 ml di reagente HRP-coniugato in tutti i pozzetti. </li><li> Ripetere i punti 7.2.2 - 7.2.3. </li><li> Pipettare 100 ml di tetrametilbenzidina (TMB) dei reagenti in ciascun pozzetto della piastra da 96 pozzetti. </li><li> Mescolare delicatamente piastra a 96 pozzetti a 25 ° C per 20 minuti su una micropiastraagitatore a 150 rpm. Arrestare la reazione aggiungendo direttamente 100 ml di soluzione di stop in ogni pozzetto e mescolare delicatamente. Una volta aggiunto alla soluzione di arresto il colore deve diventare giallo. Questo informa che la soluzione di arresto è stato correttamente miscelata. </li><li> Utilizzo di un lettore di micropiastra, determinare la densità ottica a 450 nm entro i primi 5 minuti. </li></ol></li><li> Calcolo dei risultati <ol><li> Calcolare una tabella di valori di assorbanza media (A 450) per ogni campione e ciascuno standard. </li><li> Montare una curva standard tracciando la media A 450 di ogni standard contro la sua concentrazione standard in ng / mL su un grafico lineare. Consentire l&#39;asse x per rappresentare la concentrazione e l&#39;asse y per rappresentare A 450 valori. </li><li> Utilizzando la media A 450 da ciascun campione diluito, determinare la concentrazione della proteina desiderata in ng / mL dalla curva standard. </li><li> Moltiplicare la concentrazione del campione per la diluizione di fattor. Ciò consentirà per determinare la concentrazione effettiva della proteina desiderata nel campione surnatante cellulare. </li><li> Tracciare la tabella costruita da campioni in un grafico a linee. Se OD 450 valori non rientrano della curva standard, i campioni devono essere diluiti in modo appropriato e ri-testati. </li><li> Normalizzare i risultati a 500.000 cellule. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno conflitti di interesse da dichiarare.

Isolando epatociti primari da topi è uno strumento veloce, economico e affidabile per studiare le risposte infiammatorie ex vivo. Se eseguita correttamente, i risultati possono essere facilmente generati e riprodotti in modo tempestivo ed economicamente efficiente. I seguenti punti devono essere attentamente valutati per assicurare un isolamento efficace. L&#39;incisione chirurgica e incannulamento della IVC devono essere eseguite in anestesia generale e non dopo l&#39;eutanasia. Un...

Malattia renale cronica (CKD) può essere definita come uno stato di infiammazione acuta e cronica 1. Nei pazienti con insufficienza renale cronica, i livelli sierici del fattore di crescita dei fibroblasti ormone phosphaturic 23 (FGF23) progressivo aumento al fine di mantenere l&#39;omeostasi fosfato sierico 2. L&#39;aumento dei livelli sierici di FGF23 sono indipendentemente associati con la morbilità e mortalità cardiovascolare tra i pazienti che iniziano il trattamento di emodialisi 3, 4. Inoltre, diversi studi clinici hanno dimostrato una forte correlazione tra i livelli di FGF23 elevate e livelli sierici di proteina C-reattiva (CRP), interleuchina-6 (IL-6) e Tumor Necrosis Factor α (TNF-alfa) 5, 6. Inoltre, in uno studio sperimentale, abbiamo recentemente dimostrato che FGF23 può indirizzare direttamente epatociti e provocare una risposta infiammatoria aumentando CRP e IL-6 produzione nel fegato 7. Quindi, FGF23 potrebbe agire come un fattore che contribuisce alla circolazione infiammazione sistemica in CKD. Nei primi anni &#39;70, epatociti primari sono stati isolati e studiati per la prima volta 8. Da allora le cellule epatiche in coltura primaria sono stati ampiamente utilizzati per esaminare il trattamento metabolico, la funzione ormonale, il metabolismo dei farmaci e la tossicità, nonché immunità e le risposte infiammatorie 9, 10. Protocolli precedenti hanno descritto principalmente l&#39;isolamento enzimatica di epatociti primari da tessuto epatico umano 11, 12. Mentre un modello eccellente, questo lascia la possibilità di studiare come genetica manipolazione riguarda i meccanismi di segnalazione epatica complessi così come conseguenze funzionali su diversi tipi di stimoli. Nel seguito si descrive l&#39;isolamento di epatociti primari murini. In particolare, l&#39;effetto di diversi mediatori della risposta di fase acuta epatica, come lipopolisaccaride (LPS), IL-6 e FGF23 può essere analizzato in modo facile, veloce e riproducibile 13. Qui, vi presentiamo un protocollo per l&#39;isolamento enzimatica di epatociti di topi adulti, e dimostriamo che induttori stabiliti di infiammazione, come LPS e IL-6, così come mediatori infiammatori innovative come le FGF23, in grado di stimolare direttamente l&#39;espressione e la secrezione di citochine infiammatorie, come la PCR e iL-6 in epatociti coltivati.

<table><tbody><tr><td>Consumabili</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 &mu; m Filtro cellulare in nylon</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>BD Insyte Autoguard</td><td>BD</td><td>381412</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo conico</td><td>in polipropilene Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>100 Applicatori con punta in cotone da 6 pollici&nbsp;</td><td>Puritan</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>1cc U-100 Siringa da insulina 28 G 1/2</td><td>Becton Dickinson</td><td>329420</td><td></td></tr><tr><td>Piatto per colture tissutali 100 x 20 mm Stile</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>6 pozzetti Cluster di coltura cellulare</td><td>Costar</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>5/0 Seta chirurgica intrecciata nera (100 iarde)</td><td>LOOK</td><td>SP115</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Minipuls 3 Pompa di perfusione</td><td>Kit</td> per ematocitometro Gilson <td>F155007</td><td></td></tr><tr><td>, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-474</td><td></td></tr><tr><td>Occhiali di copertura per ematocitometro, Propper</td><td>VWR</td><td>48300-470</td><td></td></tr><tr><td>Forbice chirurgiche - Affilate/smussate</td><td>F.S.T.</td><td>14001-12</td><td></td></tr><tr><td>Forbici Iris-ToughCut Dritte</td><td>F.S.T.</td><td>14058-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont SS-45 Pinze</td><td>F.S.T.</td><td>11203-25</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per tessuti per studenti</td><td>F.S.T.</td><td>991121-12</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di acido acetico, 2.0 N</td><td>Sigma</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; A8976-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano, USP 250 mL</td><td>Piramal Healthcare</td><td>&nbsp; &nbsp; 66794-013-25</td><td></td></tr><tr><td>KetaVed 1.000 mg/10 mL (100 mg/mL)</td><td>VEDCO</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 50989-161-06</td><td></td></tr><tr><td>Xilazina 100 mg/mL</td><td>AnaSed Iniezione</td><td>139-236</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di Willams E (1x)</td><td>gibco</td><td>12551-032</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di perfusione epatica (1x)</td><td>gibco</td><td>17701-038</td><td></td></tr><tr><td>Terreno di digestione epatica (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>17703034</td><td></td></tr><tr><td>Integratori per lo scongelamento e la placcatura degli epatociti primari Life</td><td>Technologies</td> Integratori per la manutenzione degli epatociti primari <td>CM3000</td><td></td></tr> Life Technologies Soluzione <tr><td>salina tampone fosfato CM4000 (PBS) pH 7,4</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>10010031</td><td></td></tr><tr><td>Collagene di tipo 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di tripano blu</td><td>VWR</td><td>45000-717</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

l&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

Induction of an Inflammatory Response in Primary Hepatocyte Cultures from Mice

Il fegato svolge un ruolo determinante nella regolazione dell&#39;infiammazione sistemica. Nella malattia renale cronica in particolare, il fegato reagisce in risposta al ambiente uremico, stress ossidativo, endotossiemia e la clearance dell&#39;amlodipina circolante citochine proinfiammatorie producendo un gran numero di proteine ​​della fase acuta. strumenti sperimentali per studiare l&#39;infiammazione e il ruolo di fondo di epatociti sono cruciali per comprendere la regolamentazione e il contributo di citochine epatiche ad una risposta di fase acuta sistemica e uno scenario pro-infiammatoria prolungata, particolarmente in un contesto complicato come la malattia renale cronica. Dal momento che lo studio complessi meccanismi di infiammazione in vivo rimane difficile, e di solito ad alta intensità di risorse richiede l&#39;utilizzo di animali transgenici, epatociti isolati primari forniscono uno strumento robusto per acquisire conoscenze meccanicistici nella risposta della fase acuta epatica. Poiché questa tecnica in vitro offre costi contenuti, alta reproducibilità e la conoscenza tecnica comune, epatociti isolati primari possono anche essere facilmente utilizzato come un approccio di screening. Qui, descriviamo un metodo enzimatico-based per isolare epatociti murini primari, e descriviamo la valutazione di una risposta infiammatoria in queste cellule utilizzando ELISA e quantitativa real-time PCR.

Istologia Immagini luce microscopia rappresentativi di cellule isolate e coltivate primarie sono descritte nella Figura 1A. Immunocytochemical analisi dimostra che epatociti isolati altamente esprimono albumina (rosso) e fattore di crescita dei fibroblasti receptor 4 (FGFR4) (verde). I nuclei sono colorati con 4 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (blu). (Figura 1B). <p class="jove_step"...

Qui vi mostriamo un approccio enzimatico per isolare epatociti primari da topi adulti, e descriviamo la quantificazione di una risposta infiammatoria con ELISA e PCR in tempo reale.

L&#39;induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

The liver plays a decisive role in the regulation of systemic inflammation. In chronic kidney disease in particular, the liver reacts in response to the ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è isolare con successo epatociti murini funzionali per studiare l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie come CRP e IL6 in risposta a mediatori della risposta epatica acuta. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla funzione epatocellulare e sul ruolo delle citochine epatiche in un ambiente infiammatorio prolungato, come quello presente nella malattia renale cronica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce uno strumento solido per un'analisi semplice, rapida e riproducibile del metabolismo epatico e dell'infiammazione, nonché della risposta ai farmaci.Per iniziare, preriscaldare il mezzo di perfusione epatica e il mezzo di digestione epatica in un bagno termico a 37 gradi Celsius. Preparare una pompa per la perfusione come mostrato qui. Quindi utilizzare il mezzo di perfusione epatica per riempire con attenzione il sistema di tubi della pompa.Cercare di evitare la formazione di bolle d'aria nel sistema. Preparare il microscopio stereotassico per la procedura di perfusione. Successivamente, dopo aver anestetizzato un topo donatore seguendo il protocollo descritto, posizionare l'animale anestetizzato su un tampone assorbente.Utilizzare del nastro adesivo per fissare gli arti del mouse. Successivamente, rasare e disinfettare l'addome del mouse. Quindi, utilizzare forbici chirurgiche con punte affilate e smussate per eseguire una laparotomia ventrale dal pube fino al margine craniale del fegato.Incidere la parete addominale su entrambi i lati in una posizione caudale al diaframma. Esporre la vena cava inferiore o IVC spostando con attenzione l'intestino sul lato destro utilizzando bastoncini di cotone sterili. Con forbici chirurgiche fini e punte affilate, praticare incisioni laterali attraverso il diaframma sopraepatico e aprire la cavità toracica.Quindi utilizzare seta chirurgica 5-0 per legare la vena cava inferiore toracica. Con un catetere venoso protetto, cannullare la vena cava inferiore infrarenale. Collegare la pompa di perfusione e iniziare la perfusione del fegato.Se eseguita correttamente, la colorazione del fegato dovrebbe immediatamente schiarirsi e il tessuto dovrebbe gonfiarsi. Successivamente, con forbici chirurgiche fini, tagliare la vena porta, consentendo un adeguato drenaggio del sangue e del mezzo di perfusione. Dopo aver perfuso il fegato con circa 30 millilitri di mezzo di perfusione per fegato, arrestare la pompa di perfusione.Passare al mezzo di digestione per il fegato e riavviare la pompa. Al termine della perfusione, rimuovere la cannula. Esporre delicatamente la regione centrale del fegato e individuare il tessuto connettivo che unisce i lobi epatici.Afferrare le fibre connettive centrali e dissezionare con attenzione tutti i tessuti che trattengono il fegato in posizione. Rimuovere quindi delicatamente il fegato. Trasferire immediatamente l'organo in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri contenente 15 millilitri di mezzo di digestione per il fegato.Quando si lavora sotto una cappa per colture cellulari, trasferire il fegato dal tubo conico in polipropilene da 50 millilitri in una piastra sterile per colture di tessuti. Con pinze sterili, strappare delicatamente i quattro lobi del fegato. Se eseguita correttamente, la soluzione di digestione dovrebbe diventare torbida a causa dell'isolamento degli epatociti dal fegato.Utilizzando una punta sterile da 25 millilitri, filtrare il mezzo di digestione torbido attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 millilitri per rimuovere le particelle di tessuto non digerito e i detriti cellulari. Centrifugare il filtrato combinato a 50 volte g a quattro gradi Celsius per due minuti, quindi aspirare il soprannatante contenente i detriti cellulari in eccesso e utilizzare 25 millilitri di William's Medium E freddo 1X per risospendere delicatamente le cellule. Dopo aver ripetuto la filtrazione e il lavaggio degli epatociti per tre volte, aspirare il soprannatante per rimuovere i detriti cellulari in eccesso.Risospendere le cellule in 25 millilitri di William's Medium E 1X caldo, contenente integratori per lo scongelamento e la semina degli epatociti primari, e filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro in nylon da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver contato le cellule, seminarle in due millilitri di William's Medium E contenente integratori per lo scongelamento e la semina degli epatociti primari, su un piatto da coltura cellulare a sei pozzetti rivestito di collagene. Dopo due cambi di mezzo per privare progressivamente le cellule di nutrienti, trattare le cellule con PBS come veicolo, 25 nanogrammi per millilitro di FGF23, 100 microgrammi per millilitro di LPS o 50 nanogrammi per millilitro di IL6 in mezzo privo di siero.Incubare le colture per 24 ore. Dopo aver preparato l'RNA utilizzando un kit con colonnina secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 200 nanogrammi dell'RNA isolato in un tubo PCR. Quindi aggiungere 14 microlitri di acqua priva di endonucleasi e quattro microlitri di trascrittasi inversa nel tubo.Collocare il tubo PCR nel termociclatore ed eseguire il seguente programma di trascrizione inversa per generare cDNA. Per eseguire la PCR quantitativa, combinare i seguenti componenti del mix maestro QPCR in un tubo posto sul ghiaccio. Vortexare il mix maestro.Quindi aliquotare nove microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere con attenzione un microlitro di cDNA in ogni pozzetto, preparando tre pozzetti per ciascun campione. Infine, eseguire i campioni in uno strumento di PCR in tempo reale e analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo.Viene mostrata un'immagine rappresentativa ottenuta mediante microscopia ottica di cellule primarie isolate e coltivate. L'analisi immunocitochimica dimostra che gli epatociti isolati esprimono fortemente albumina nonché il recettore 4 per il fattore di crescita dei fibroblasti. In questo esperimento, gli epatociti primari isolati sono stati trattati con FGF23, LPS o IL6 per 24 ore e i livelli di mRNA di CRP e IL6 sono stati analizzati mediante PCR quantitativa in tempo reale.LPS, IL6 e FGF23 aumentano significativamente l'espressione di CRP e IL6. Come mostrato qui, i soprannatanti di colture cellulari di epatociti primari isolati sono stati analizzati mediante ELISA per determinare i livelli di CRP. Come dimostrato dall'analisi con QPCR, i trattamenti con LPS, IL6 e FGF23 aumentano significativamente i livelli di CRP nei soprannatanti cellulari rispetto alle cellule trattate con PBS.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sole poche ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale ricordare di mantenere un ambiente sterile. Poiché si lavora con colture primarie, ridurre al minimo il rischio di possibili contaminazioni è la cosa più importante per ottenere risultati ottimali.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con successo epatociti murini per lo studio di varie funzioni epatocellulari, come l'espressione e la secrezione di citochine epatiche.

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