L'induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare con successo epatociti murini funzionali per studiare l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie come CRP e IL6 in risposta ai mediatori della risposta della fase acuta epatica. Questo metodo potrebbe aiutare a rispondere a domande chiave sulla funzione epatocellulare e sul contributo delle citochine epatiche a un ambiente infiammatorio prolungato come si trova nella malattia renale cronica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce uno strumento robusto per un'analisi semplice, veloce e riproducibile della metabolomica epatica e dell'infiammazione, nonché per una risposta ai farmaci.

Per iniziare, preriscaldare il terreno di perfusione epatica e il mezzo di digestione epatica a bagnomaria a 37 gradi Celsius. Installare una pompa di perfusione come mostrato qui. Quindi utilizzare il terreno di perfusione epatica per pre-riempire accuratamente il sistema di tubi della pompa.

Cerca di evitare bolle d'aria nel sistema. Preparare il microscopio stereotassico per la procedura di perfusione. Quindi, dopo aver anestetizzato un topo donatore secondo il protocollo di testo, posizionare l'animale anestetizzato su un tampone assorbente.

Usa del nastro adesivo per fissare le estremità del mouse. Quindi, radere e disinfettare l'addome del topo. Quindi utilizzare forbici chirurgiche con punte affilate e smussate per eseguire una laparotomia ventrale dal pube al bordo craniale del fegato.

Incidere la parete addominale su entrambi i lati in una posizione caudale al diaframma. Esporre la vena cava inferiore o IVC spostando con cura l'intestino sul lato destro utilizzando tamponi di cotone sterili. Con forbici chirurgiche sottili e punte affilate e affilate, praticare incisioni laterali attraverso il diaframma sopraepatico e aprire la cavità toracica.

Quindi utilizzare la seta chirurgica 5-0 per legare l'IVC toracico. Con un catetere IV schermato, incannulare l'IVC infrarenale. Collega la pompa di perfusione e inizia a perfondere il fegato.

Se eseguito correttamente, il fegato dovrebbe iniziare immediatamente a sbiancare e gonfiarsi. Successivamente, con sottili forbici chirurgiche, sezionare la vena porta, consentendo un adeguato drenaggio del sangue e del mezzo di perfusione. Dopo aver perfuso il fegato con circa 30 millilitri di terreno di perfusione epatica, arrestare la pompa di perfusione.

Passare al mezzo di digestione del fegato e riprendere la pompa. Una volta completata la perfusione, rimuovere la cannula. Esporre delicatamente la regione centrale del fegato e individuare il tessuto di collegamento che collega i lobi del fegato.

Afferra le fibre di collegamento centrali e seziona con cura tutti i tessuti che tengono il fegato in posizione. Quindi rimuovere delicatamente il fegato. Trasferire immediatamente l'organo in una provetta conica di polipropilene da 50 millilitri contenente 15 millilitri di terreno di digestione epatica.

Mentre si lavora sotto una cappa per colture cellulari, trasferire il fegato dalla provetta conica in polipropilene da 50 millilitri in una piastra sterile per colture tissutali. Con una pinza sterile, strappare delicatamente i quattro lobi del fegato. Se eseguito correttamente, il mezzo di digestione dovrebbe diventare torbido a causa dell'isolamento degli epatociti dal fegato.

Utilizzando un puntale per pipetta sterile da 25 millilitri, filtrare il mezzo di digestione torbido attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in una nuova provetta conica in polipropilene da 50 millilitri per rimuovere le particelle di tessuto non digerite e i detriti cellulari. Centrifugare il filtrato combinato a 50 volte g a quattro gradi Celsius per due minuti, quindi aspirare il surnatante contenente detriti cellulari in eccesso e utilizzare 25 millilitri di 1X William's Medium E freddo per risospendere delicatamente le cellule. Dopo aver ripetuto per tre volte il filtraggio e il lavaggio degli epatociti, aspirare il surnatante per rimuovere i detriti cellulari in eccesso.

Risospendere le cellule in 25 millilitri di 1X William's Medium E caldo che contiene integratori primari per lo scongelamento e la placcatura degli epatociti e filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Una volta che le cellule sono state contate, piastreggile in due millilitri di William's Medium E che contiene integratori primari di scongelamento e placcatura degli epatociti su un cluster di coltura cellulare a sei pozzetti rivestito di collagene. Dopo due cambi di terreno per far morire di fame le cellule, trattare le cellule con PBS come veicolo, 25 nanogrammi per millilitro di FGF23, 100 microgrammi per millilitro di LPS o 50 nanogrammi per millilitro di IL6 in terreno privo di siero.

Incubare le colture per 24 ore. Dopo aver preparato l'RNA utilizzando un kit di colonna di rotazione secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 200 nanogrammi di RNA isolato a una provetta per PCR. Quindi aggiungere 14 microlitri di acqua priva di endonucleasi e quattro microlitri di trascrittasi inversa al tubo.

Posizionare la provetta per PCR nel termociclatore ed eseguire il seguente programma di trascrizione inversa per generare cDNA. Per eseguire la PCR quantitativa, combinare i seguenti componenti della miscela master QPCR in una provetta su ghiaccio. Vortice il master mix.

Quindi aliquotare nove microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere con cura un microlitro di cDNA in ogni pozzetto, preparando tre pozzetti per ogni campione. Infine, eseguire i campioni in uno strumento PCR in tempo reale e analizzare i dati secondo il protocollo di testo.

Qui è illustrata un'immagine rappresentativa al microscopio ottico di cellule primarie isolate e in coltura. L'analisi immunocitochimica dimostra che gli epatociti isolati esprimono altamente l'albumina e il recettore 4 del fattore di crescita dei fibroblasti. In questo esperimento, gli epatociti isolati primari sono stati trattati con FGF23, LPS o IL6 per 24 ore e i livelli di mRNA di CRP e IL6 sono stati analizzati mediante PCR quantitativa in tempo reale.

LPS, IL6 e FGF23 hanno aumentato significativamente l'espressione di CRP e IL6. Come mostrato qui, i surnatanti di colture cellulari provenienti da epatociti primari isolati sono stati analizzati mediante ELISA per i livelli di CRP. Come dimostrato con l'analisi QPCR, i trattamenti con LPS, IL6 e FGF23 hanno aumentato significativamente i livelli di CRP nei surnatanti cellulari rispetto alle cellule trattate con PBS.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere un ambiente sterile. A causa del lavoro con la coltura primaria, ridurre al minimo il rischio di possibili contaminazioni è molto importante per ottenere risultati ottimali.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con successo gli epatociti murini per studiare varie funzioni epatocellulari come l'espressione e la secrezione di citochine epatiche.