L'induzione di una risposta infiammatoria in colture primarie epatociti di topi

L'obiettivo generale di questo procedimento è isolare con successo epatociti murini funzionali per studiare l'espressione e la secrezione di citochine infiammatorie come CRP e IL6 in risposta a mediatori della risposta epatica acuta. Questo metodo potrebbe contribuire a rispondere a domande fondamentali sulla funzione epatocellulare e sul ruolo delle citochine epatiche in un ambiente infiammatorio prolungato, come quello presente nella malattia renale cronica. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce uno strumento solido per un'analisi semplice, rapida e riproducibile del metabolismo epatico e dell'infiammazione, nonché della risposta ai farmaci.

Per iniziare, preriscaldare il mezzo di perfusione epatica e il mezzo di digestione epatica in un bagno termico a 37 gradi Celsius. Preparare una pompa per la perfusione come mostrato qui. Quindi utilizzare il mezzo di perfusione epatica per riempire con attenzione il sistema di tubi della pompa.

Cercare di evitare la formazione di bolle d'aria nel sistema. Preparare il microscopio stereotassico per la procedura di perfusione. Successivamente, dopo aver anestetizzato un topo donatore seguendo il protocollo descritto, posizionare l'animale anestetizzato su un tampone assorbente.

Utilizzare del nastro adesivo per fissare gli arti del mouse. Successivamente, rasare e disinfettare l'addome del mouse. Quindi, utilizzare forbici chirurgiche con punte affilate e smussate per eseguire una laparotomia ventrale dal pube fino al margine craniale del fegato.

Incidere la parete addominale su entrambi i lati in una posizione caudale al diaframma. Esporre la vena cava inferiore o IVC spostando con attenzione l'intestino sul lato destro utilizzando bastoncini di cotone sterili. Con forbici chirurgiche fini e punte affilate, praticare incisioni laterali attraverso il diaframma sopraepatico e aprire la cavità toracica.

Quindi utilizzare seta chirurgica 5-0 per legare la vena cava inferiore toracica. Con un catetere venoso protetto, cannullare la vena cava inferiore infrarenale. Collegare la pompa di perfusione e iniziare la perfusione del fegato.

Se eseguita correttamente, la colorazione del fegato dovrebbe immediatamente schiarirsi e il tessuto dovrebbe gonfiarsi. Successivamente, con forbici chirurgiche fini, tagliare la vena porta, consentendo un adeguato drenaggio del sangue e del mezzo di perfusione. Dopo aver perfuso il fegato con circa 30 millilitri di mezzo di perfusione per fegato, arrestare la pompa di perfusione.

Passare al mezzo di digestione per il fegato e riavviare la pompa. Al termine della perfusione, rimuovere la cannula. Esporre delicatamente la regione centrale del fegato e individuare il tessuto connettivo che unisce i lobi epatici.

Afferrare le fibre connettive centrali e dissezionare con attenzione tutti i tessuti che trattengono il fegato in posizione. Rimuovere quindi delicatamente il fegato. Trasferire immediatamente l'organo in un tubo conico in polipropilene da 50 millilitri contenente 15 millilitri di mezzo di digestione per il fegato.

Quando si lavora sotto una cappa per colture cellulari, trasferire il fegato dal tubo conico in polipropilene da 50 millilitri in una piastra sterile per colture di tessuti. Con pinze sterili, strappare delicatamente i quattro lobi del fegato. Se eseguita correttamente, la soluzione di digestione dovrebbe diventare torbida a causa dell'isolamento degli epatociti dal fegato.

Utilizzando una punta sterile da 25 millilitri, filtrare il mezzo di digestione torbido attraverso un filtro cellulare in nylon da 70 micrometri in un nuovo tubo conico in polipropilene da 50 millilitri per rimuovere le particelle di tessuto non digerito e i detriti cellulari. Centrifugare il filtrato combinato a 50 volte g a quattro gradi Celsius per due minuti, quindi aspirare il soprannatante contenente i detriti cellulari in eccesso e utilizzare 25 millilitri di William's Medium E freddo 1X per risospendere delicatamente le cellule. Dopo aver ripetuto la filtrazione e il lavaggio degli epatociti per tre volte, aspirare il soprannatante per rimuovere i detriti cellulari in eccesso.

Risospendere le cellule in 25 millilitri di William's Medium E 1X caldo, contenente integratori per lo scongelamento e la semina degli epatociti primari, e filtrare la sospensione attraverso un nuovo filtro in nylon da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri. Dopo aver contato le cellule, seminarle in due millilitri di William's Medium E contenente integratori per lo scongelamento e la semina degli epatociti primari, su un piatto da coltura cellulare a sei pozzetti rivestito di collagene. Dopo due cambi di mezzo per privare progressivamente le cellule di nutrienti, trattare le cellule con PBS come veicolo, 25 nanogrammi per millilitro di FGF23, 100 microgrammi per millilitro di LPS o 50 nanogrammi per millilitro di IL6 in mezzo privo di siero.

Incubare le colture per 24 ore. Dopo aver preparato l'RNA utilizzando un kit con colonnina secondo le istruzioni del produttore, aggiungere 200 nanogrammi dell'RNA isolato in un tubo PCR. Quindi aggiungere 14 microlitri di acqua priva di endonucleasi e quattro microlitri di trascrittasi inversa nel tubo.

Collocare il tubo PCR nel termociclatore ed eseguire il seguente programma di trascrizione inversa per generare cDNA. Per eseguire la PCR quantitativa, combinare i seguenti componenti del mix maestro QPCR in un tubo posto sul ghiaccio. Vortexare il mix maestro.

Quindi aliquotare nove microlitri della soluzione in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere con attenzione un microlitro di cDNA in ogni pozzetto, preparando tre pozzetti per ciascun campione. Infine, eseguire i campioni in uno strumento di PCR in tempo reale e analizzare i dati secondo il protocollo descritto nel testo.

Viene mostrata un'immagine rappresentativa ottenuta mediante microscopia ottica di cellule primarie isolate e coltivate. L'analisi immunocitochimica dimostra che gli epatociti isolati esprimono fortemente albumina nonché il recettore 4 per il fattore di crescita dei fibroblasti. In questo esperimento, gli epatociti primari isolati sono stati trattati con FGF23, LPS o IL6 per 24 ore e i livelli di mRNA di CRP e IL6 sono stati analizzati mediante PCR quantitativa in tempo reale.

LPS, IL6 e FGF23 aumentano significativamente l'espressione di CRP e IL6. Come mostrato qui, i soprannatanti di colture cellulari di epatociti primari isolati sono stati analizzati mediante ELISA per determinare i livelli di CRP. Come dimostrato dall'analisi con QPCR, i trattamenti con LPS, IL6 e FGF23 aumentano significativamente i livelli di CRP nei soprannatanti cellulari rispetto alle cellule trattate con PBS.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in sole poche ore se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale ricordare di mantenere un ambiente sterile. Poiché si lavora con colture primarie, ridurre al minimo il rischio di possibili contaminazioni è la cosa più importante per ottenere risultati ottimali.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare con successo epatociti murini per lo studio di varie funzioni epatocellulari, come l'espressione e la secrezione di citochine epatiche.