Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging è quello di visualizzare e quantificare la neurite ottica e l'infiammazione cerebrale nel modello EAE di sclerosi multipla in topi viventi. Il metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroimmunologia, come i nuovi meccanismi che influenzano il decorso dell'EAE e della sclerosi multipla. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la neurite ottica evocata dall'EAE e l'infiammazione cerebrale possono essere osservate e quantificate nei topi vivi durante il decorso della malattia.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia perché possiamo osservare l'effetto dei farmaci, che non si rivelano dai punteggi EAE. In questa procedura sciogliere PTX a due microgrammi per millilitro in 1x PBS e mescolare bene. Quindi iniettare 100 microlitri di PLP/CFA nei topi per via sottocutanea due volte alla base della coda durante una breve anestesia con isoflurano.

Non iniettare nella parte posteriore del collo, perché qualsiasi reazione immunitaria nella parte superiore della schiena o nel collo disturberà l'imaging della testa e del midollo spinale. Una o due ore dopo l'immunizzazione, iniettare 100 microlitri di PTX nei topi per via intraperitoneale. Quindi, 24 ore dopo l'immunizzazione, iniettare nuovamente nei topi 100 microlitri di PTX.

Per i topi di controllo, iniettare due volte 100 microlitri di CFA senza PLP alla base della coda. Dal settimo giorno dopo l'immunizzazione, valutare quotidianamente i sintomi clinici secondo i sistemi di punteggio standard. Quando i topi raggiungono un punteggio maggiore di uno, che si verificherà intorno al giorno 10-12 dopo l'immunizzazione, eseguire il primo imaging all'inizio della malattia.

Quindi eseguire il secondo imaging al culmine della malattia, che è circa uno o due giorni dopo lo sviluppo dei sintomi iniziali, e durerà da uno a tre giorni. Successivamente, i topi si riprenderanno completamente entro sette-10 giorni. L'imaging durante gli intervalli può ancora mostrare perdite vascolari, ma gli indicatori di infiammazione dovrebbero essere negativi.

Per eseguire l'imaging in vivo, mantenere i topi sotto il 2%-2,5% di anestesia con isoflurano durante tutte le procedure di imaging. Posiziona due topi uno accanto all'altro nell'apparecchio e posiziona le spine superiori dei topi al centro. Quindi, proteggi il sito di immunizzazione con un panno nero.

Aprire il software per l'acquisizione delle immagini e inizializzare la fotocamera. Quindi scatta un'immagine di base per valutare il corretto posizionamento dei topi. Successivamente utilizzare la messa a fuoco B con una distanza di 6,5 centimetri dalla fotocamera per catturare tutte le immagini.

Successivamente, miscelare il reagente chemiluminescente pronto all'uso a 40 milligrammi per millilitro prima di riempire la siringa. Quindi, iniettarne 100 microlitri nei topi per via intraperitoneale e acquisire le immagini di bioluminescenza cinque, 10 e 15 minuti dopo l'iniezione. In questa procedura aprire il software di analisi della bioluminescenza.

Nella barra dei menu in alto, fai clic sull'icona Browser file. Passare alla directory della cartella dell'esperimento e aprire i file, quindi configurare le colonne che mostrano le descrizioni rilevanti per l'esperimento. Per il controllo di qualità, fare clic su un file di un mouse che non risponde senza i sintomi di EAE, o su un mouse naïve per verificare la specificità dei segnali EAE.

Come ulteriore controllo della specificità del segnale, controllare l'immagine di base prima dell'iniezione della sonda per ciascun topo, che dovrebbe essere negativa. Per selezionare un'immagine clicca sul primo file del primo mouse EAE e controlla l'intensità e la localizzazione della bioluminescenza. Controlla tutte le immagini una per una.

Per la quantificazione, utilizzare l'immagine con il segnale più forte per ogni topo. Per regolare ed esportare l'immagine, fare doppio clic sul primo file da quantificare. In una nuova finestra visualizzata sotto il pulsante Opzioni, personalizza le etichette da visualizzare in ogni schermata.

Nella tavolozza degli strumenti a destra, vai a Regolazione immagine. Per impostazione predefinita, le intensità minima e massima sono impostate su auto e visualizzate in pseudocolore arcobaleno. Selezionare Manuale per modificare le impostazioni, se necessario.

Quindi, fai clic su Esportazione immagine, seleziona PNG, la directory e un nome per l'immagine. Per la quantificazione delle regioni di interesse, vai allo strumento ROI nella tavolozza degli strumenti. Seleziona il metodo ROI e il numero di ROI.

Nella finestra ROI all'interno della finestra immagine, regolare le dimensioni e la posizione della ROI. Utilizza soglie ROI identiche per tutte le immagini quando viene utilizzato lo strumento ROI automatico. Utilizza aree identiche per tutte le immagini se le dimensioni e le posizioni del ROI sono definite manualmente.

Successivamente, fai clic su Misura ROI. Personalizza le colonne sui dettagli dell'esperimento in una nuova finestra pop-up e salvale. Quando sei pronto, seleziona tutto e copia e incolla la tabella in un foglio di calcolo.

Successivamente, esporta l'immagine come PNG con le ROI in posizione. Quindi, salva e chiudi il file immagine. Ecco gli esempi di due topi SJL/J che sono stati ripresi al giorno 10 e 14 dopo l'induzione EAE.

Il segnale bioluminescente intorno agli occhi era più alto al giorno 10 ed è scomparso quando i topi hanno iniziato a riprendersi. I grafici a barre qui mostrano la quantificazione dei segnali bioluminescenti al giorno 10 e 14, mentre i punteggi EAE clinici sono mostrati qui. In questa figura, le immagini bioluminescenti di cinque topi in ciascun gruppo mostrano l'effetto del farmaco in cui la neurite ottica è stata ridotta nei topi trattati con R-flurbiprofene.

La quantificazione della conta totale dei bioluminescenti nei ROI ha confermato la significativa efficacia del trattamento. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore, a seconda del numero di topi da riprendere. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di utilizzare topi bianchi e di osservare attentamente il decorso clinico dell'EAE.

Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come l'analisi FACS o l'immunoistochimica, per rispondere a ulteriori domande, come l'infiltrazione di cellule immunitarie nel midollo spinale. Dopo aver visto il video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la neurite ottica e l'infiammazione cerebrale nel modello EAE di sclerosi multipla utilizzando l'imaging bioluminescente.