Name: Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T10:10:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: Scopri tecniche di imaging in vivo per visualizzare neurite ottica e infiammazione cerebrale nel modello EAE di sclerosi multipla nei topi SJL/J. La bioluminescenza e il vicino infrarosso permettono di monitorare la progressione della malattia e valutare l'efficacia terapeutica in tempo reale.

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Questa ricerca è stata sostenuta dalla Deutsche Forschungsgemeinschaft (CRC1039 A3) e il programma di finanziamento della ricerca &quot;Landesoffensive zur Entwicklung Wissenschaftlich-ökonomischer Exzellenz&quot; (LOEWE) dello Stato di Hessen, Centro di Ricerca per traslazionale Medicina e Farmacologia TMP e la Else Kröner-Fresenius Fondazione (EKFS), Gruppo formazione mediante la ricerca traslazionale Research Innovation - Pharma (TRIP).

1. EAE induzione in SJL / J topi <ol><li> Topi <ol><li> Utilizzare 11 settimane di età femminile SJL / J topi e consentire loro di abituano alla sala sperimentale per circa 7 giorni. Utilizzare n = 10 topi per gruppo. </li><li> Per la valutazione degli effetti di farmaci, somministrare il farmaco e placebo per il gruppo di controllo in continuo tramite l&#39;acqua potabile o tramite pellet cibo a partire 3 o 5 giorni dopo l&#39;immunizzazione (n = 10 per gruppo). Durante il picco della malattia, somministrare farmaci o placebo con latte o 3% corn flakes acqua zucchero-imbevuti. </li></ol></li><li> materiale Immunizzazione <ol><li> Utilizzare un kit di induzione EAE costituito da antigene (peptide di proteine ​​proteolipid, PLP139-151, 1 mg / emulsione ml) in una emulsione con adiuvante completo di Freund (CFA, ucciso al calore Mycobacterium tuberculosis H37 Ra) e 2 flaconi (5 mcg ciascuna) di liofilizzato tossina della pertosse (PTX). </li><li> Sciogliere il PTX (2 mg / ml) in 1x PBS (PBS, cioè, &lt;/ Em&gt; aggiungere 1,5 ml di PBS in ogni provetta PTX, mescolare bene, togliere con la stessa punta della pipetta, e aggiungere 1 ml di PBS in un tubo da 50 ml); mescolare bene. </li></ol></li><li> Immunizzazione <ol><li> Iniettare PLP / CFA sottocutanea in 2 porzioni, ciascuna di 100 microlitri, sia alla base della coda. Non iniettare nella parte posteriore del collo, in quanto eventuali reazioni immunitarie della pelle nella parte superiore della schiena o al collo disturberanno l&#39;imaging della testa e del midollo spinale. </li><li> Iniettare 100 ml di PTX per via intraperitoneale (ip), due volte al mouse, il primo 1 - 2 ore dopo la vaccinazione e il secondo a 24 ore. </li><li> Per i topi di controllo, iniettare CFA senza PLP (2 porzioni di 100 ml) più PTX senza PLP. </li></ol></li><li> La gestione del mouse dopo la vaccinazione <ol><li> Pesare il mouse ogni altro giorno fino al giorno 7, si pesa quotidianamente. NOTA: I topi perdono circa 1 - 2 g di peso corporeo durante EAE. Il declino segna l&#39;inizio della EAE. </li><li> Valutare i sintomi clinici giorno tutti i giorni dalle 7 accordozione ai sistemi di valutazione standard (ad esempio, Score 0: nessuna modifica evidenti funzioni motorie; segnare 0,5: la paralisi distale della coda; segnare 1: paralisi completa della coda; segnare 1.5: paresi lieve di una o entrambe le zampe posteriori; punteggio 2: grave paralisi delle zampe posteriori; segnare 2,5: completa paralisi di una gamba posteriore; segnare 3: paralisi completa di entrambe le zampe posteriori; segnare 3,5:. paralisi completa delle zampe posteriori e la paresi di una gamba anteriore euthanize topi con i punteggi di 3.5 o superiore per &gt; 12 h. </li></ol></li><li> Naturalmente e ora di imaging EAE <ol><li> Eseguire la prima di imaging al momento della comparsa della malattia, quando i topi raggiungono punteggi&gt; 1, che avverrà intorno al giorno 10 - 12 dopo la vaccinazione. </li><li> Eseguire il secondo di imaging al picco, che sarà raggiunto 1 o 2 giorni dopo i sintomi iniziali sviluppano e durerà per 1 - 3 giorni. NOTA: In seguito, i topi recuperare completamente entro 7 a 10 giorni. Imaging durante gli intervalli può ancora mostrare perdite vascolari,ma gli indicatori di infiammazione dovrebbe essere negativo. </li></ol></li></ol> 2. Bioluminescent Imaging e vicino infrarosso di neurite ottica e cervello Infiammazione <ol><li> Impostazione del sistema di imaging <ol><li> Eseguire imaging in vivo con qualsiasi apparecchiatura che consente l&#39;analisi della bioluminescenza e segnali ad infrarossi. </li><li> Mantenere i topi sotto 2-2,5% isoflurano anestesia durante tutte le procedure di imaging. </li><li> Posizionare una o due topi accanto all&#39;altra nell&#39;apparato utilizzando le forniture di gas di mezzo. Posizionare il rachide superiore al centro. </li><li> Usare due mouse contemporaneamente, uno per gruppo, per la valutazione degli effetti di farmaci per confrontare coppie. Questo è importante per l&#39;imaging bioluminescente. </li><li> Schermare il sito dell&#39;immunizzazione con panno nero e prendere un&#39;immagine di fotografia e basale per valutare il corretto posizionamento dei mouse / mice. Utilizzare il B-fuoco con una distanza di 6,5 cm per la macchina fotografica per tutte le immagini. </li></ol></li><li> Iniezione e di imaging di sonda infiammazione bioluminescente <ol><li> Utilizzare le impostazioni del sistema di imaging in vivo in: Epi-BLI, Em filtro aperto, blocco di filtro Ex, fstop 1, binning 8, concentrarsi B = 6,5 cm, annunci di esposizione 120 s; prendere una immagine di base. </li><li> Iniettare 100 microlitri ip del reagente chemiluminescente ready-to-use (40 mg / mL). Mescolare bene prima di riempire la siringa. </li><li> Catturare immagini bioluminescenza 5, 10, e 15 minuti dopo l&#39;iniezione. L&#39;andamento temporale del picco bioluminescente differisce tra gli animali. NOTA: Il picco si verificherà 5 - 10 minuti dopo l&#39;iniezione; un calo a 15 min indica che ulteriori immagini sono necessarie. Utilizzare coppie murini di controllo e di trattamento gruppi per eliminare distorsioni minori a causa di diversi corsi di tempo. </li><li> Compilare descrizioni rilevanti per l&#39;esperimento. Osservare una finestra di dialogo pop-up automatico; include informazioni come ceppo di topi, sesso, punto di tempo, il tempo di iniezione sonda, gruppo, ecc. Salvare i file in tutto ocartella ne; avranno i tag di tempo e tutte le descrizioni. </li></ol></li><li> Iniezione e di imaging di nanoparticelle fluorescenti vicino infrarosso per l&#39;integrità BBB <ol><li> Utilizzare l&#39;imaging epifluorescenza vicino infrarosso nel B-focus (distanza: 6.5 cm). I massimi di eccitazione / emissione di nanoparticelle fluorescenti pegilati sono 675/690 nm. Catturare due immagini a diverse lunghezze d&#39;onda, a Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; utilizzare un 2-s esposizione, binning 8, e fstop 2. Prendere una immagine di base. </li><li> Iniettare 70 ml di nanoparticelle fluorescenti infrarossi pegilati iv attraverso la vena della coda e immaginare il mouse 3 ore e 24 ore dopo l&#39;iniezione utilizzando le impostazioni di cui sopra. Mescolare il pozzo soluzione prima di riempire la siringa. </li><li> Iniettare cloruro di sodio allo 0,9% in topi di controllo, che saranno necessarie per valutare la specificità del segnale. </li></ol></li><li> Iniezione e immagini della sonda vicino infrarosso fluorescente per l&#39;attività MMP <ol><li> La barba o depilare la testa e uregione della colonna vertebrale pper cautamente un giorno prima di prendere l&#39;immagine di base. La pelle non deve essere ferito. </li><li> Utilizzare l&#39;imaging epifluorescenza vicino infrarosso nel B-focus (distanza: 6.5 cm). I massimi di eccitazione / emissione della sonda attivabile MMP sono 680/700 nm. Catturare due immagini a diverse lunghezze d&#39;onda, a Ex640 / Em700 e Ex675 / Em720; utilizzare un 1-s esposizione, binning 8, e fstop 2. Prendere una immagine di base. </li><li> Aggiungere 200 ml di PBS 1x al tubo 1,5 ml della soluzione pronta per l&#39;uso (20 nmol / 1,5 ml in PBS 1x) in modo che sia sufficiente per 10 topi; mescolare bene prima di riempire la siringa. NOTA: Il volume disponibile non tiene conto del fatto che alcune volume perso durante il riempimento della siringa e iniezione. </li><li> Iniettare 150 ml di iv sonda attraverso la vena della coda 24 ore prima di imaging. Iniettare PBS solo in animali di controllo per valutare la specificità del segnale. </li><li> A 24 ore dopo l&#39;iniezione, prendere immagini Epi-FL almeno a due lunghezze d&#39;onda, Ex640 / Em700 e Ex 675 / EM720, con le impostazioni spiegato in precedenza (1-s di esposizione, messa a fuoco B, binning 8, e fstop 2). NOTA: L&#39;uso di due lunghezze d&#39;onda permette unmixing spettrale sottraendo il segnale aspecifico. </li></ol></li></ol> 3. Analisi Immagine <ol><li> Analisi bioluminescenza (BLI) <ol><li> Fare doppio clic sul software per aprirlo. </li><li> Nella barra dei menu in alto, fare clic sull&#39;icona del browser di file, passare alla directory della cartella dell&#39;esperimento, e selezionarlo; questo aprirà tutti i file nella cartella in una tabella. </li><li> Configurare le colonne che mostrano le descrizioni rilevanti per l&#39;esperimento. </li><li> Per il controllo di qualità, fare doppio clic su un file di un mouse non-responder, senza sintomi di EAE e / o un mouse ingenuo di verificare la specificità dei segnali EAE. NOTA: Non ci dovrebbe essere alcun segnale in topi naive e di segnale minima nei topi non-responder. <ol><li> Controllare l&#39;immagine di base prima che l&#39;iniezione del proa ciascuno mouse come ulteriore controllo della specificità del segnale; dovrebbe essere negativo. </li></ol></li><li> Per selezionare un&#39;immagine, fare doppio clic sul primo file del primo mouse EAE e controllare l&#39;intensità bioluminescente (LUT gamma bar) e la localizzazione. Controllare tutte le immagini una per una. Chiudere il file con l&#39;intensità più basso per ogni mouse (ad esempio, tenere 2 su 3 immagini per ogni mouse). </li><li> Regolazione immagine e l&#39;esportazione <ol><li> Fare doppio clic sul primo file da quantificare. Osservare una nuova finestra pop-up. Sotto &quot;opzioni&quot; (menu in alto), personalizzare le etichette per visualizzare in ogni immagine. </li><li> Nella palette strumento giusto, andare a &quot;Regolazione immagine&quot;. Per impostazione predefinita, le intensità minime e massime sono impostati su &quot;auto&quot; e visualizzati in arcobaleno pseudocolori. Selezionare &quot;manuale&quot; per modificare le impostazioni, se necessario. NOTA: Per esempio, tutte le immagini esportate possono avere barre identici LUT (minimi identici e maxima) per essere facilmente comparabili.La regolazione dei minimi e massimi non ha alcun impatto sui risultati quantitativi. </li><li> Clicca su esportazione delle immagini, selezionare png, la directory e un nome di immagine </li></ol></li><li> Quantificazione delle Regioni di interesse (ROI) <ol><li> Vai allo strumento &quot;ROI&quot; nella palette degli strumenti. Selezionare il metodo di ROI (cerchio, rettangolare, auto, o mano libera) e il numero di ROI. Osservare la finestra ROI pop-up nella finestra dell&#39;immagine. </li><li> Utilizzando il mouse, regolare le dimensioni e la posizione. Utilizzare soglie ROI identici per tutte le immagini se si utilizza lo strumento di auto-ROI. Utilizzare aree identiche per tutte le immagini se le dimensioni e le posizioni di ROI sono definite manualmente (ad esempio, ROI circolari). </li><li> Clicca su &quot;Misura RO.I. Osservare una nuova finestra pop-up. Personalizzare le colonne (ad esempio, il nome del file, il numero degli animali, il gruppo, esperimento, zona, conteggi totali, conte medie, conteggi SD, min e max conta, zona, tempo punto, il tempo di iniezione della sonda, ecc.) Salvare le impostazioni personalizzate. Quando reAdy, selezionare tutto (Ctrl + A), e copiare e incollare la tabella in un foglio di calcolo. </li><li> Esportare l&#39;immagine come png con le ROI in atto. Salvare e chiudere il file di immagine. </li></ol></li><li> Ripetere la procedura (punti 3.1.6 - 3.1.7) per tutti i file di immagini che devono essere quantificati. Copiare tutti quantificazioni ROI nel foglio di calcolo. NOTA: Qui, i risultati possono essere ordinati per gruppo, punto di tempo, ecc e analizzati statisticamente. Utilizzare i conteggi totali di segnali bioluminescenza nella ROI per le analisi statistiche. </li></ol></li><li> Near-Infrared (NIR) analisi delle nanoparticelle fluorescenti <ol><li> Utilizzando i controlli nel software, regolare la soglia dell&#39;immagine. NOTA: Ciò non ha alcun impatto sul risultato quantitativo. </li><li> confrontare visivamente le immagini catturate a Ex / Em 675/720 e Ex / Em 640/700 per valutare la specificità del segnale. </li><li> Utilizzare le immagini catturate a Ex / Em 675/720 per l&#39;analisi quantitativa (massima eccitazione: 680 nm). Definire ROI, per le quali può essere utilizzato lo strumento di auto-ROI. Regolare la soglia di auto-ROI e utilizzarlo per tutte le immagini. Quantificare l&#39;efficienza totale radiante a ROI (vedi punto 3.1). </li></ol></li><li> Near-Infrared (NIR) analisi della sonda proteasi sensibili <ol><li> Utilizzando controlli software, regolare la soglia dell&#39;immagine. NOTA: Ciò non ha alcun impatto sul risultato quantitativo. Eseguire unmixing spettrale della auto-fluorescenza. Lo strumento unmixing è implementato in Living immagine. L&#39;auto-unmixing utilizza l&#39;Ex / Em 640/700 come specifico e 675/720 come l&#39;immagine auto-fluorescente. </li><li> Selezionare l&#39;immagine non miscelato e definire le ROI, come descritto sopra. Utilizzare l&#39;efficienza radiante totale nel ROI per le analisi quantitative e statistiche. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il presente video mostra le tecniche di bioluminescenza e fluorescenza nel vicino infrarosso imaging in vivo di EAE in topi SJL / J. Abbiamo dimostrato che l&#39;imaging bioluminescenza utilizzando una sonda infiammazione sensibile mostra principalmente neurite ottica, e la quantificazione concorda con la valutazione clinica di EAE gravità e gli effetti del farmaco. Tuttavia, il metodo di imaging bioluminescenza non era in grado di rilevare l&#39;infiammazione del midollo spinale lombare, che è un sito primario...

La sclerosi multipla è causata dall'attacco autoimmune mediato e dalla distruzione della guaina mielinica nel cervello e nel midollo spinale1. Con un'incidenza complessiva di circa 3,6 casi per 100.000 persone all'anno nelle donne e di circa 2,0 negli uomini, la SM è la seconda causa più comune di disabilità neurologica nei giovani adulti, dopo le lesioni traumatiche2,3. La patologia della malattia è causata da fattori genetici e ambientali4, ma non è ancora completamente compresa. I linfociti T autoreattivi entrano nel sistema nervoso centrale e innescano una cascata infiammatoria che provoca infiltrati focali nella sostanza bianca del cervello, del midollo spinale e del nervo ottico. Nella maggior parte dei casi, questi infiltrati sono inizialmente reversibili, ma la persistenza aumenta con il numero di recidive. Sono stati sviluppati numerosi modelli di roditori per studiare la patologia della malattia. L'EAE recidivante-remittente nei topi SJL/J e l'EAE primario-progressivo nei topi C57BL6 sono i modelli più popolari.
I punteggi EAE clinici, che descrivono l'entità dei deficit della funzione motoria, e il peso corporeo sono i gold standard per valutare la gravità dell'EAE. Questi segni clinici concordano con l'entità dell'infiltrazione delle cellule immunitarie e della distruzione della mielina nel midollo spinale e predicono moderatamente l'efficacia del trattamento farmacologico nell'uomo5. Tuttavia, questi segni riflettono principalmente la distruzione dei tratti di fibre ventrali nel midollo spinale. Attualmente, non esiste un metodo facile, non invasivo, affidabile e riproducibile per valutare l'infiltrazione cerebrale in vivo e la neurite ottica nei topi vivi. 
L'imaging in vivo concorda con i principi 3 "R" di Russel e Burch (1959), che rivendicano una Replacement, Reduction, and Refinement of animal experiments6, perché l'imaging aumenta le letture di un animale in diversi punti temporali e consente una riduzione dei numeri complessivi. Attualmente, l'infiammazione o lo stato della mielina sono principalmente valutati ex vivo tramite immunoistochimica, analisi FACS o diversi metodi di biologia molecolare 7, che richiedono l'eutanasia di topi in momenti specifici. 
Sono state sviluppate numerose sonde per sistemi di imaging in vivo per valutare l'infiammazione della pelle, delle articolazioni e del sistema vascolare. Le tecniche si basano sull'attivazione di substrati fluorescenti bioluminescenti o nel vicino infrarosso da parte delle perossidasi tissutali, tra cui la mieloperossidasi (MPO), le metalloproteinasi della matrice (MMP)8 e le catepsine9 o cicloossigenasi2. Queste sonde sono state convalidate principalmente in modelli di artrite o aterosclerosi9,10. Una sonda sensibile alla catepsina è stata utilizzata anche per l'imaging tomografico molecolare a fluorescenza di EAE11. Le MMP, in particolare MMP2 e MMP9, contribuiscono all'interruzione della BBB mediata dalla proteasi nell'EAE e sono sovraregolate nei siti di infiltrazione delle cellule immunitarie12, suggerendo che queste sonde possono essere utili per l'imaging EAE. Lo stesso vale per le sonde a base di perossidasi o catepsina. Tecnicamente, l'imaging dell'infiammazione nel cervello o nel midollo spinale è sostanzialmente più impegnativo perché il cranio o la colonna vertebrale assorbono segnali bioluminescenti e nel vicino infrarosso. 
Oltre agli indicatori di infiammazione, sono state descritte sostanze chimiche fluorescenti, che si legano specificamente alla mielina e possono consentire la quantificazione della mielinizzazione13. È stato scoperto che una sonda fluorescente nel vicino infrarosso, lo ioduro di 3,3'-dietiltiatricarbocianina (DBT), si lega specificamente alle fibre mielinizzate ed è stato convalidato come strumento quantitativo in modelli murini di difetti di mielinizzazione primaria e in demielinizzazione evocata da cuprizone14. Nell'EAE, il segnale DBT era piuttosto aumentato, riflettendo l'infiammazione delle fibre mieliniche5. 
Un ulteriore segno distintivo di EAE e MS è la degradazione della BBB, con conseguente aumento della permeabilità vascolare e stravaso di cellule del sangue, fluido extracellulare e macromolecole nel parenchima del SNC. Questo può portare a edema, infiammazione, danno agli oligodendrociti e, infine, demielinizzazione15,16. Pertanto, la visualizzazione della perdita di BBB utilizzando sonde fluorescenti, come l'album<ina sierica bovina marcata con fluorocromo class='xref'>5, che normalmente si distribuiscono molto lentamente dal sangue al tessuto, può essere utile per valutare l'EAE.
Nel presente studio, abbiamo valutato l'utilità di diverse sonde in EAE e mostriamo la procedura per la tecnica bioluminescente più affidabile e robusta. Inoltre, discutiamo i pro e i contro delle sonde nel vicino infrarosso per l'attività MMP e l'integrità della BBB.

<table><tbody><tr><td>AngioSpark-680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10149</td><td>Sonda di imaging, nanoparticelle pegilate, utile per l'imaging dell'integrità della barriera ematoencefalica</td></tr><tr><td>MMP-sense 680</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>NEV10126</td><td>Sonda di imaging, attivabile dalle metalloproteinasi della matrice, utile per l'imaging dell'infiammazione</td></tr><tr><td>XenoLight RediJect Inflammation Probe</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td>760535</td><td>Sonda di imaging, attivabile dalle ossidasi, utile per l'imaging dell'infiammazione</td></tr><tr><td>PLP139-151/CFA emulsione&nbsp;</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>Kit di induzione EAE</td></tr><tr><td>Tossina pertosse</td><td>Hooke Labs, St Lawrence, MA</td><td>EK-0123</td><td>Kit di induzione EAE</td></tr><tr><td>IVIS Lumina Spectrum</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, USA</td><td></td><td>Sistema di imaging a bioluminescenza e infrarossi</td></tr><tr><td>Software LivingImage 4.5</td><td>Perkin Elmer, Inc., Waltham, Stati Uniti</td><td>CLS136334</td><td>Software di analisi IVIS</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Abbott Labs, Illinois, Stati Uniti</td><td>26675-46-7</td><td>Anestetico</td></tr></tbody></table>

bioluminescenza e vicino infrarosso imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello eae della sclerosi multipla nei topi

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in SJL / J topi è un modello per la sclerosi multipla recidivante-remittente (RRMS). punteggi EAE clinici che descrivono i deficit delle funzioni motorie sono letture di base della infiammazione immuno-mediata del midollo spinale. Tuttavia, i punteggi e il peso corporeo non permettono una valutazione in vivo di infiammazione del cervello e neurite ottica. Quest&#39;ultima è una manifestazione precoce e frequente in circa 2/3 dei pazienti con SM. Qui vi mostriamo i metodi per bioluminescenza e vicino infrarosso immagini dal vivo per valutare EAE evocato neurite ottica, infiammazione del cervello, e la barriera emato-encefalica interruzione (BBB) nei topi che vivono con un sistema di imaging in vivo in. Un substrato bioluminescente attivato da ossidasi soprattutto ha mostrato neurite ottica. Il segnale era specifico e ha permesso la visualizzazione degli effetti di farmaci e gli andamenti temporali di malattia, che in parallelo i punteggi clinici. nanoparticelle fluorescenti pegilato che sono rimasti all&#39;interno del vasculature per lunghi periodi di tempo sono stati utilizzati per valutare l&#39;integrità BBB. Vicino infrarosso di imaging rivelato una perdita BBB al picco della malattia. Il segnale era più forte intorno agli occhi. Un substrato vicino infrarosso per metalloproteinasi della matrice è stato utilizzato per valutare l&#39;infiammazione EAE-evocato. Auto-fluorescenza interferiva con il segnale, che richiede unmixing spettrale per la quantificazione. Nel complesso, imaging bioluminescenza è un metodo affidabile per valutare neurite ottica e farmaci effetti EAE-associata e era superiore alle tecniche vicino infrarosso in termini di specificità del segnale, robustezza, facilità di quantificazione, e costo.

Andamento temporale della bioluminescenza di neurite ottica Il segnale della sonda bioluminescenza infiammazione era il più forte attorno agli occhi e si è verificato esclusivamente in topi EAE con neurite ottica. Un segnale si è verificato nel né i topi non EAE né i topi non iniettati con la sonda infiammazione. Il segnale è scomparso quando i topi recuperato. Quindi, il segnale è specifico per neurite ottica...

Mostriamo una tecnica per bioluminescenza vivo in vivo e vicino infrarosso per immagini di neurite ottica ed encefalite nel modello di encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) per la sclerosi multipla in topi SJL / J.

Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di imaging è visualizzare e quantificare la neurite ottica e l'infiammazione cerebrale nel modello EAE della sclerosi multipla in topi vivi. Il metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della neuroimmunologia, come i nuovi meccanismi che influenzano l'andamento dell'EAE e della sclerosi multipla. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la neurite ottica e l'infiammazione cerebrale indotte dall'EAE possono essere osservate e quantificate in topi vivi durante l'intero decorso della malattia.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia perché possiamo osservare l'effetto dei farmaci, che non si rivelano dai punteggi EAE. In questo procedimento, sciogliere la PTX a due microgrammi per millilitro in PBS 1x e mescolare bene. Quindi iniettare 100 microlitri di PLP/CFA nei topi per via sottocutanea due volte alla base della coda durante una breve anestesia con isoflurano.Non iniettare nella parte posteriore del collo, poiché eventuali reazioni immunitarie cutanee nella zona superiore della schiena o del collo disturberebbero l'immagine della testa e del midollo spinale. Da uno a due ore dopo l'immunizzazione, iniettare 100 microlitri di PTX nei topi per via intraperitoneale. Quindi, 24 ore dopo l'immunizzazione, iniettare nuovamente nei topi 100 microlitri di PTX.Per i topi di controllo, iniettare 100 microlitri di CFA senza PLP due volte alla base della coda. Dal settimo giorno successivo alla immunizzazione, valutare i sintomi clinici quotidianamente secondo i sistemi di punteggio standard. Quando i topi raggiungono un punteggio superiore a uno, il che avverrà intorno al giorno 10-12 dopo l'immunizzazione, effettuare la prima acquisizione di immagini all'esordio della malattia.Quindi eseguire la seconda acquisizione d'immagini al culmine della malattia, che si verifica circa uno o due giorni dopo lo sviluppo dei sintomi iniziali e dura da uno a tre giorni. Successivamente, i topi si riprenderanno completamente entro sette-10 giorni. Le acquisizioni d'immagini effettuate negli intervalli possono ancora mostrare perdite vascolari, ma gli indicatori di infiammazione dovrebbero risultare negativi.Per eseguire l'imaging in vivo, mantenere i topi sotto anestesia con isoflurano al 2%-2,5% durante tutte le procedure di imaging. Posizionare due topi l'uno accanto all'altro nell'apparato, con le spine dorsali superiori dei topi al centro. Successivamente, schermare il sito di immunizzazione con un panno nero.Aprire il software per l'acquisizione delle immagini e inizializzare la fotocamera. Successivamente, acquisire un'immagine di base per valutare il corretto posizionamento dei topi. In seguito, utilizzare la messa a fuoco B con una distanza di 6,5 centimetri dalla fotocamera per acquisire tutte le immagini.In seguito, mescolare il reagente chemiluminescente pronto all'uso a 40 milligrammi per millilitro prima di riempire la siringa. Quindi, iniettare 100 microlitri del reagente nei topi per via intraperitoneale e acquisire le immagini di bioluminescenza a cinque, dieci e quindici minuti dall'iniezione. In questo procedimento, aprire il software di analisi della bioluminescenza.Nella barra del menu superiore, fare clic sull'icona del browser dei file. Andare alla directory della cartella dell'esperimento e aprire i file, quindi configurare le colonne visualizzando le descrizioni relative all'esperimento. Per il controllo di qualità, fare clic su un file di un topo non responsivo senza sintomi di EAE, oppure su un topo naïve per verificare la specificità dei segnali di EAE.Come ulteriore controllo della specificità del segnale, verificare l'immagine di base prima dell'iniezione della sonda per ogni topo, che dovrebbe risultare negativa. Per selezionare un'immagine, fare clic sul primo file del primo topo EAE e controllare l'intensità e la localizzazione della bioluminescenza. Verificare tutte le immagini una per una.Per la quantificazione, utilizzare l'immagine con il segnale più intenso per ogni topo. Per regolare ed esportare l'immagine, fare doppio clic sul primo file da quantificare. In una nuova finestra che si apre, sotto il pulsante Opzioni, personalizzare le etichette da visualizzare su ogni schermo.Nella palette degli strumenti a destra, andare su Regolazione immagine. Per impostazione predefinita, le intensità minima e massima sono impostate su automatico e visualizzate in pseudocolore arcobaleno. Selezionare Manuale per modificare le impostazioni, se necessario.Successivamente, fare clic su Esporta immagine, selezionare PNG, la directory e un nome per l'immagine. Per la quantificazione delle regioni di interesse, andare sullo strumento ROI nella barra degli strumenti. Selezionare il metodo ROI e il numero di ROI.Nella finestra dell'area di interesse (ROI) all'interno della finestra dell'immagine, regolare le dimensioni e la posizione della ROI. Utilizzare soglie di ROI identiche per tutte le immagini quando si utilizza lo strumento ROI automatico. Utilizzare aree identiche per tutte le immagini se le dimensioni e le posizioni delle ROI sono definite manualmente.In seguito, fare clic su Misura ROI. Personalizzare le colonne con i dettagli sperimentali in una nuova finestra a comparsa e salvarle. Quando pronto, selezionare tutto, copiare e incollare la tabella in un foglio di calcolo.Successivamente, esportare l'immagine come PNG con le ROI posizionate. Quindi, salvare e chiudere il file dell'immagine. Di seguito sono riportati gli esempi di due topi SJL/J sottoposti a imaging al giorno 10 e 14 dopo l'induzione di EAE.Il segnale bioluminescente intorno agli occhi era massimo al giorno 10 ed è scomparso quando i topi hanno iniziato a riprendersi. Gli istogrammi mostrano la quantificazione dei segnali bioluminescenti ai giorni 10 e 14, mentre i punteggi clinici di EAE sono mostrati qui. In questa figura, le immagini bioluminescenti di cinque topi per gruppo mostrano l'effetto del farmaco, nel quale la neurite ottica è risultata ridotta nei topi trattati con R-flurbiprofene.La quantificazione dei conteggi bioluminescenti totali nelle aree di interesse (ROI) ha confermato l'efficacia significativa del trattamento. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in due o tre ore, a seconda del numero di topi da sottoporre a imaging. Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di utilizzare topi bianchi e di osservare attentamente l'andamento clinico della EAE.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come l'analisi FACS o l'immunohistochimica per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sull'infiltrazione di cellule immunitarie nel midollo spinale. Dopo aver visionato il video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come valutare la neurite ottica e l'infiammazione cerebrale nel modello EAE della sclerosi multipla mediante imaging bioluminescente.

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Questo video mostra una procedura per valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica in un modello murino EAE. Coloranti fluorescenti di diverse dimensioni vengono iniettati per via retro-orbitale e circolano attraverso i vasi sanguigni del cervello. Il colorante più piccolo fuoriesce attraverso le fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante più grande entra solo se l'interruzione è grave, correlata all'entità del danno alla barriera.

Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

In questo video, un modello murino di sclerosi multipla viene stabilito utilizzando l'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE). Al topo viene iniettata un'emulsione contenente un peptide neuronale e un adiuvante, innescando una risposta immunitaria che attiva le cellule T autoreattive. Questo è seguito da un'iniezione di tossina della pertosse (PTX) per aumentare la permeabilità della barriera emato-encefalica, consentendo alle cellule T autoreattive di infiltrarsi nel cervello. Questa...

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino

Fonte: Breid, S., et. al. Imaging a bioluminescenza della neuroinfiammazione in topi transgenici dopo inoculazione periferica di fibrille di alfa-sinucleina. J. Vis. Exp. (2017)Questo video dimostra l'imaging a bioluminescenza della neuroinfiammazione nei topi transgenici, mostrando le reazioni luciferasi-luciferina negli astrociti attivati. Il protocollo consente la quantificazione non invasiva dell'attivazione astrocitica, aiutando gli studi sull'infiammazione del SNC e sull'efficacia...

Imaging a bioluminescenza della neuroinfiammazione in un topo transgenico

Source: Schmitz, K., et al., Bioluminescenza e imaging nel vicino infrarosso della neurite ottica e dell'infiammazione cerebrale nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi. J. Vis. Exp. (2017).Questo video dimostra il metodo per visualizzare e monitorare l'encefalomielite autoimmune sperimentale o l'infiammazione indotta da EAE nel nervo ottico utilizzando Imaging a bioluminescenza. Include il posizionamento del mouse, l'iniezione del reagente e l'acquisizione di immagini sequenziali per...

Imaging a bioluminescenza in un modello murino EAE

Descriviamo un metodo per impiantare e mantenere finestre di vetro sopra il midollo spinale esposto di topi adulti per studiare l'encefalomielite autoimmune sperimentale. Queste finestre forniscono un accesso ottico cronico al midollo spinale per il monitoraggio della dinamica cellulare a livello subcellulare in animali vivi utilizzando la microscopia a due fotoni.

Impianto di finestre in vetro del midollo spinale in topi adulti con encefalomielite autoimmune sperimentale

Questo manoscritto descrive i metodi per l'induzione e il punteggio del modello sperimentale di encefalomielite autoimmune (EAE), insieme alla valutazione della distribuzione delle cellule immunitarie e dei livelli di citochine mRNA nei linfonodi, nella milza, nel sangue e nel midollo spinale utilizzando la citometria a flusso e la PCR quantitativa, rispettivamente, in varie fasi della malattia.

Induzione di encefalomielite autoimmune sperimentale nei topi e valutazione della distribuzione delle malattie-dipendente delle cellule immunitarie in vari tessuti

Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

Questo protocollo descrive come ad alta definizione tecniche di imaging come la tomografia ottica di coerenza di dominio spettrale e scansione laser oftalmoscopia può essere utilizzata in piccoli roditori, utilizzando un sistema di piattaforma di imaging oftalmico, per ottenere informazioni su lo spessore retinico e microglial cellula distribuzione, rispettivamente.

In Vivo Imaging dei topi Reporter Cx3cr1gfp/gfp con tomografia a coerenza ottica Spectral-domain e scansione Laser oftalmoscopia

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Il presente protocollo descrive l'induzione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale in un modello murino utilizzando glicoproteina oligodendrocitaria mielinica e monitorando il processo della malattia utilizzando un sistema di punteggio clinico. I sintomi sperimentali correlati all'encefalomielite autoimmune vengono analizzati utilizzando l'analisi della tomografia microcomputerizzata del femore di topo e il test in campo aperto per valutare il processo della malattia in modo completo.

Induzione e diversi indicatori di valutazione dell'encefalomielite autoimmune sperimentale

L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) funge da modello animale di sclerosi multipla. Questo articolo descrive un approccio per valutare l'infiammazione del midollo spinale, la demielinizzazione e la lesione assonale nell'EAE. Inoltre, viene presentato un metodo per quantificare i livelli di luce solubile dei neurofilamenti nel siero dei topi, facilitando la valutazione del danno assonale nei topi vivi.

Punteggio dell'infiammazione del sistema nervoso centrale, della demielinizzazione e della lesione assonale nell'encefalomielite autoimmune sperimentale

Scopri tecniche di imaging in vivo per visualizzare neurite ottica e infiammazione cerebrale nel modello EAE di sclerosi multipla nei topi SJL/J. La bioluminescenza e il vicino infrarosso permettono di monitorare la progressione della malattia e valutare l'efficacia terapeutica in tempo reale.

Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi (Video) | JoVE Journal

Bioluminescenza e vicino infrarosso Imaging di neurite ottica e cervello infiammazione nel modello EAE della sclerosi multipla nei topi

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