Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di esplorare le vie biochimiche che vengono attivate in risposta alla tensione utilizzando microsfere magnetiche rivestite di ligando e l'applicazione forzata ai recettori di adesione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo delle transazioni meccaniche, come il modo in cui la tensione meccanica dell'elometria espressa li dirige dalla differenziazione o il modo in cui la conformità tissutale guida la loro trasformazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che molte cellule possono essere stimolate per l'analisi chimica utilizzando perline per applicare tensione su un sottoinsieme specifico di recettori di adesione.

Per iniziare, risospendere accuratamente le perle super paramagnetiche tosilattivate nella fiala originale facendo vorticare per almeno 30 secondi. Aliquotare 40 microlitri di perle superparamagnetiche risospese in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente un millilitro di fosfato di sodio molare 0,1 molare pH 7,4. Quindi, posizionare il tubo su un supporto di separazione magnetico per separare le perle magnetiche dalla soluzione.

Eliminare il surnatante e rimuovere il tubo dal supporto di separazione magnetica. Risospendere le perle in un millilitro 0,1 molare di fosfato di sodio pH 7,4. Dopo aver lavato le perle due volte, risospendere le perle in un millilitro dello stesso tampone.

Quindi, combina 100 microgrammi di fibronectina bovina o qualsiasi altro ligando del recettore di adesione cellulare alle perle e al vortice. Ripetere questo passaggio sostituendo il ligando con BSA, poli-D-lisina o apotransferrina per i controlli negativi. Incubare le perle con la soluzione contenente il legante per 12-24 ore a 37 gradi Celsius su un rotore.

Se gli aggregati di perline compaiono dopo che la reazione si è verificata, sonicare per non più di 10-20 secondi. Quindi, isolare le perle utilizzando un supporto di separazione magnetico e aspirare la soluzione rimanente. Quindi aggiungere un millilitro di una soluzione di PBS integrata con albume sierico bovino allo 0,2%.

Incubare per un'ora su un rotore a 37 gradi Celsius. Utilizzando un magnete, lavare le perle con un millilitro di soluzione PBS integrata due volte con albume sierico bovino allo 0,2%. Prima di risospenderli in un millilitro dello stesso tampone.

Sonicare le perle se compaiono aggregati per non più di 20-30 secondi. Procedere con i saggi cellulari o conservare le perle a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Coltura di cellule aderenti su una piastra di coltura tissutale da 60 millilitri in un terreno di crescita appropriato fino a raggiungere l'80% di confluenza.

Dopo aver pellettato le perle rivestite di ligando, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione di PBS integrata con albume sierico bovino allo 0,2%. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di perline rivestite di ligando a cinque millilitri di terreno di coltura caldo e vortice. Quindi, aspirare il terreno in un piatto di coltura da 60 millilitri e aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura caldo integrato con perline.

Incubare la sospensione per 20 minuti in condizioni di coltura cellulare per consentire alle perle di sedimentare e aderire alle cellule. È fondamentale non superare i 20 minuti, poiché le perle possono essere internalizzate dalla fagocitosi. Quindi, osserva le perle al microscopio ottico utilizzando un obiettivo 10X o 20X.

Verificare l'adesione delle perle scuotendo leggermente il piatto per discriminare tra le perline attaccate e quelle galleggianti. Posiziona un magnete rotondo al neodimio da 38 millimetri sulla faccia superiore di un normale coperchio per piastre di coltura da 60 millimetri e tienilo in posizione utilizzando due magneti al neodimio più piccoli da 13 millimetri posizionati sulla faccia inferiore del coperchio. Incubare le cellule sottoposte a tensione per i punti temporali e le condizioni di coltura cellulare desiderati.

Sostituisci il normale coperchio del piatto con un coperchio con il magnete. Poiché i magneti sono molto potenti, manipolali con cura. Dopo il trattamento, posizionare il piatto sul ghiaccio e aspirare con cura l'intero mezzo dal piatto.

Aggiungere 300 microlitri di tampone di lisi cellulare e incubare per 10 minuti con ghiaccio. Quindi, raccogliere il lisato utilizzando un raschietto cellulare e trasferirlo in una provetta da microcentrifuga pre-raffreddata da 1,5 millilitri. Pellettare le microsfere magnetiche utilizzando il supporto di separazione magnetica e trasferire il lisato cellulare totale in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri pre-raffreddata.

Rimuovere un'aliquota di 15 microlitri dal lisato cellulare totale ottenuto dopo la separazione delle microsfere per l'analisi del western blot. Lavare le perle tre volte con un millilitro di tampone di lisi ghiacciato. Quindi, aggiungere 50 microlitri di tampone campione al pellet di perline.

Dopo aver mescolato la sospensione mediante vortex, farla bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti utilizzando un riscaldatore a blocchi a secco. Questa frazione contiene i complessi di adesione isolati. Procedere all'analisi biochimica o conservare la frazione a meno 20 gradi Celsius.

Questa figura è mostrata per dimostrare la purificazione dei complessi di adesione. L'immunoblotting GAPDH viene utilizzato come controllo del carico del lisato cellulare totale e per verificare la purezza dei complessi di adesione. Una lunga esposizione è stata utilizzata per convalidare l'assenza di segnale citoplasmatico nella frazione del complesso di adesione purificato.

Le perle rivestite di fibronectina sono state utilizzate per studiare i processi di meccano-trasduzione che si verificano nel tempo nei complessi di adesione in risposta alla tensione. Dopo la separazione magnetica della frazione del complesso di adesione, il lisato e la frazione del complesso di adesione sono stati analizzati mediante western blot. Il controllo del carico e i candidati noti per essere reclutati o fosforilati nei complessi di adesione in risposta alla tensione meccanica sono stati sottoposti a immunoblotting.

Mentre la tensione non ha influenzato il reclutamento della paxillina nei complessi di adesione, la sua fosforilazione sulla tirosina 31 è stata aumentata in risposta alla tensione meccanica sia nel lisato cellulare totale che nella frazione del complesso di adesione. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come applicare le forze di tensione alle proteine della superficie di adesione utilizzando le perle magnetiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di essere cauti con i potenti magneti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire studi biochimici come western blot, saggio di polimerizzazione dell'actina o saggio enzimatico per rispondere a ulteriori domande, come se l'attività della chinasi sia regolata dalla tensione. Questa tecnica può aiutare i ricercatori nel campo della biologia cellulare a esplorare le vie di segnalazione sensibili ai magneti nelle cellule.