Analizzando cellulare superficie di adesione ritocca in risposta alla tensione meccanica utilizzando biglie magnetiche

L'obiettivo generale di questo esperimento è esplorare i percorsi biochimici che vengono attivati in risposta alla tensione meccanica, utilizzando microsfere magnetiche rivestite con ligandi e applicando forzatamente tensione ai recettori di adesione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande nel campo della trasduzione meccanica, come ad esempio in che modo la tensione meccanica derivante dall'ambiente extracellulare orienti le cellule verso la differenziazione o come la compliance del tessuto influenzi la loro trasformazione. Il principale vantaggio di questa tecnica è che un gran numero di cellule può essere stimolato per l'analisi chimica applicando tensione, tramite le microsfere, a un sottogruppo specifico di recettori di adesione.

Per iniziare, risospendere accuratamente le perle superparamagnetiche attivate con tosile nell'ampolla originale mediante vortex per almeno 30 secondi. Aliquotare 40 microlitri delle perle superparamagnetiche risospese in un tubo da microcentrifuga da 1,5 millilitro contenente un millilitro di fosfato di sodio 0,1 molare a pH 7,4. Successivamente, posizionare il tubo su un supporto per separazione magnetica per separare le perle magnetiche dalla soluzione.

Eliminare il soprannatante e rimuovere il tubo dal supporto di separazione magnetica. Ri-sospendere le perle in un millilitro di tampone fosfato di sodio 0,1 molare a pH 7,4. Dopo aver lavato le perle due volte, ri-sospendere le perle in un millilitro dello stesso tampone.

Quindi, combinare 100 microgrammi di fibronectina bovina o di qualsiasi altro ligando del recettore di adesione cellulare con le perle e vortexare. Ripetere questo passaggio sostituendo il ligando con BSA, poli-D-lisina o apotransferrina per i controlli negativi. Incubare le perle con la soluzione contenente il ligando per 12-24 ore a 37 gradi Celsius su un rotatore.

Se compaiono aggregati di perline dopo che la reazione è avvenuta, sottoporre a sonicazione per non più di 10-20 secondi. Successivamente, isolare le perline utilizzando un supporto per separazione magnetica ed aspirare la soluzione rimanente. Quindi aggiungere un millilitro di soluzione di PBS integrata con il 0,2% di albumina sierica bovina.

Incubare per un'ora su un rotatore a 37 gradi Celsius. Utilizzando un magnete, lavare le perle con un millilitro di soluzione PBS integrata con il 0,2% di albumina sierica bovina, due volte. Prima di risospendere in un millilitro dello stesso tampone.

Sonicare le perle se compaiono aggregati, per non più di 20-30 secondi. Procedere con i saggi cellulari oppure conservare le perle a quattro gradi Celsius per un massimo di un mese. Coltivare cellule aderenti su una piastra da 60 millilitri in un mezzo di crescita appropriato fino al raggiungimento dell'80% di confluenza.

Dopo aver centrifugato le perle rivestite con il ligando, risospendere il pellet in un millilitro di soluzione PBS integrata con il 0,2% di albumina sierica bovina. Aggiungere 100 microlitri della soluzione di perle rivestite con il ligando a cinque millilitri di mezzo di coltura tiepido ed eseguire un vortex. Successivamente, aspirare il mezzo in una piastra di coltura da 60 millilitri e aggiungere cinque millilitri di mezzo di crescita caldo integrato con le perle.

Incubare la sospensione per 20 minuti in condizioni di coltura cellulare per consentire ai microsfera di sedimentare e aderire alle cellule. È fondamentale non superare i 20 minuti, poiché le microsfere potrebbero essere internalizzate per fagocitosi. Successivamente, osservare le microsfere al microscopio ottico utilizzando un obiettivo 10X o 20X.

Verificare l'adesione delle perle agitando leggermente la piastra per distinguere tra perle attaccate e perle in sospensione. Posizionare un magnete rotondo al neodimio da 38 millimetri sulla faccia superiore del coperchio di una normale piastra da coltura da 60 millimetri e mantenerlo in posizione utilizzando due magneti più piccoli al neodimio da 13 millimetri posizionati sulla faccia inferiore del coperchio. Incubare le cellule sottoposte a trazione per i punti temporali desiderati e nelle condizioni di coltura cellulare previste.

Sostituire il coperchio normale della piastra con un coperchio contenente il magnete. Poiché i magneti sono molto potenti, manipolarli con cura. Dopo il trattamento, posizionare la piastra sul ghiaccio ed aspirare con attenzione tutto il mezzo dalla piastra.

Aggiungere 300 microlitri di buffer per la lisi cellulare e incubare per 10 minuti su ghiaccio. Successivamente, raccogliere il lisato utilizzando una spatola per cellule e trasferirlo in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro preraffreddata. Pellettare le perle magnetiche utilizzando il supporto per separazione magnetica e trasferire il lisato cellulare totale in una nuova provetta microcentrifuga da 1,5 millilitro preraffreddata.

Prelevare un'aliquote di 15 microlitri dal lisato cellulare totale ottenuto dopo la separazione con perle per l'analisi tramite western blot. Lavare le perle tre volte con un millilitro di tampone di lisi freddo. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di tampone campione al pellet di perle.

Dopo aver mescolato la sospensione mediante vortex, far bollire a 95 gradi Celsius per cinque minuti utilizzando un blocco riscaldante secco. Questa frazione contiene i complessi di adesione isolati. Procedere all'analisi biochimica o conservare la frazione a meno 20 gradi Celsius.

Questa figura mostra la purificazione dei complessi di adesione. L'immunoblotting per GAPDH viene utilizzato come controllo di caricamento per il lisato totale delle cellule e per verificare la purezza dei complessi di adesione. È stata utilizzata un'esposizione prolungata per confermare l'assenza di segnale citoplasmatico nella frazione purificata dei complessi di adesione.

Per studiare i processi di meccanotrasduzione che si verificano nel tempo nei complessi di adesione in risposta alla tensione meccanica, sono stati utilizzati microsfera rivestite di fibronectina. Dopo la separazione magnetica della frazione di complessi di adesione, il lisato e la frazione di complessi di adesione sono stati analizzati mediante immunoblotting. Sono stati eseguiti immunoblot per il controllo di caricamento e per proteine candidate note per essere reclutate o fosforilate nei complessi di adesione in risposta alla tensione meccanica.

Sebbene la tensione non abbia influenzato il reclutamento della Paxillina nei complessi di adesione, la sua fosforilazione sulla tirosina 31 è risultata aumentata in risposta alla tensione meccanica sia nel lisato totale delle cellule che nella frazione dei complessi di adesione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come applicare forze tensionali alle proteine della superficie di adesione utilizzando microsfere magnetiche. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore se effettuata correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di maneggiare con cautela i magneti potenti. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire studi biochimici come immunoblotting, saggi di polimerizzazione dell'actina o saggi enzimatici per rispondere ad ulteriori domande, ad esempio se l'attività chinasica è regolata dalla tensione. Questa tecnica potrebbe aiutare i ricercatori nel campo della biologia cellulare a esplorare vie di segnalazione sensibili al campo magnetico all'interno delle cellule.