Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

L'obiettivo generale di questo protocollo biochimico è generare nucleosomi con istoni gemelli marcati isotopicamente in modo differenziale, da utilizzare per la mappatura simultanea delle reazioni di modificazione post-traduzionale su entrambi gli istoni gemelli. L'obiettivo generale di questo protocollo biochimico è generare nucleosomi con istoni gemelli marcati isotopicamente in modo differenziale per la mappatura simultanea delle modificazioni post-traduzionali su entrambi gli istoni gemelli.

Questo metodo, in combinazione con tecniche ad alta risoluzione per mappare le modifiche post-traduzionali, come nella spettrometria di massa, affronta questioni fondamentali della biologia della cromatina, ad esempio quali meccanismi contribuiscono alla formazione di nucleosomi simmetricamente modificati? Il principale vantaggio di questa tecnica è che può essere facilmente implementata in un laboratorio biochimico, poiché combina protocolli standard di ricostruzione dei nucleosomi con comuni metodologie di purificazione delle proteine. Due pool di istone H3 verranno utilizzati per la ricostruzione dell'ottamero.

H3 marcata con azoto-15 che contiene un'etichetta poliistidinica all'estremità ammino-terminale e H3 marcata con carbonio-13 che contiene un'etichetta di affinità per streptavidina all'estremità ammino-terminale. Iniziare questa procedura sciogliendo gli aliquote di istoni liofilizzati, inclusi i due tipi di istone H3, nel buffer di svolgimento. Aggiungere a ciascuna provetta contenente circa cinque milligrammi di istoni un millilitro di buffer di svolgimento e mescolare mediante pipettaggio, senza effettuare il vortex.

Mantenere i tubi sul ghiaccio per 30 minuti per consentire un completo svolgimento. Successivamente, misurare l'assorbanza a 280 nanometri per determinare la concentrazione esatta di ciascuna istona. Mescolare le istone core in rapporti molari equimolari, ricordando di includere il 50% di ciascuna delle due popolazioni di istona H3.

Utilizzare il buffer di svolgimento per aggiustare la concentrazione proteica finale a circa un milligrammo per millilitro. Trasferire la miscela in una membrana dialitica con cutoff di sei chilodalton. E dializzare contro uno o due litri di buffer di ripiegamento freddo a quattro gradi Celsius.

Il giorno seguente, raccogliere il materiale dializzato ed eliminare eventuali precipitati mediante centrifugazione in un microcentrifugo per cinque minuti a quattro gradi Celsius alla velocità massima. Dopo aver determinato la concentrazione dell'ottamero, utilizzare un dispositivo filtrante centrifugo con cutoff di 10 kilodalton per concentrare l'ottamero fino a un volume finale di circa due millilitri. Si dovrebbe ottenere una concentrazione dell'ottamero compresa tra 50 e 100 micromolare.

Prepararsi per la filtrazione su gel collegando la colonna di filtrazione su gel a un sistema FPLC. Equilibrare con due volumi della colonna, o CV, di tampone di ripiegamento filtrato a 0,22 micrometri e sgrassato. Iniettare il materiale concentrato a una velocità di flusso di un millilitro al minuto e raccogliere frazioni da uno a 1,5 millilitri.

Per iniziare questa procedura, raggruppare le frazioni pertinenti contenenti ottameri puri e determinare la concentrazione come descritto in precedenza. Collegare una colonna da un millilitro di acido nitrilotriacetico al nichel o colonna NTA al nichel al sistema FPLC ed equilibrare con 10 CV di tampone per il ripiegamento, filtrato a 0,22 micrometri e degassato, a una velocità di flusso di un millilitro al minuto.

Fare passare l'ottamero purificato attraverso la colonna al nichel NTA utilizzando un flusso di un millilitro al minuto. Raccogliere il flusso in uscita. Eluire con 10 CV di tampone di ripiegamento contenente imidazolo 250 millimolare utilizzando un flusso di un millilitro al minuto.

Raccogliere l'eluito di nickel NTA. La purificazione basata su streptavidina dovrebbe idealmente essere eseguita in una stanza fredda. Equilibrare una colonna affinitaria da un millilitro di streptavidina commerciale con 10 CV di tampone di ripiegamento contenente 250 millimolari di imidazolo, utilizzando un sistema a flusso gravitazionale in batch.

Fare passare l'eluato di nickel NTA attraverso la colonna a affinità per streptavidina. Raccogliere il flusso in uscita. Eluire con 10 CV di tampone di ripiegamento contenente 2,5 millimolari di desthiobiotina.

Raccogliere l'eluito. Dopo aver misurato la concentrazione dell'ottamero nell'eluito, aggiungere una quantità di proteasi TEV pari a un decimo e lasciare procedere la reazione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, trasferire la miscela in una membrana dialitica con cutoff di 50 kilodalton e dializzare contro il buffer di ripiegamento tutta la notte a quattro gradi Celsius.

Concentrare l'ottamero asimmetrico purificato utilizzando un dispositivo centrifugo con cutoff di 10 chilodalton fino a un volume di uno-due millilitri. La concentrazione prevista dell'ottamero è di 20-50 micromolare. La riconstituzione del nucleosoma richiede DNA contenente una sequenza di posizionamento del nucleosoma.

Regolare la concentrazione salina del DNA a due moli di cloruro di sodio utilizzando una soluzione madre di cloruro di sodio cinque molare. Mescolare il DNA con l'ottamero e il buffer di ripiegamento usando il rapporto ottimale tra ottamero e DNA determinato da un test su piccola scala. Aggiungere l'ottamero per ultimo per evitare qualsiasi possibilità di mescolare l'ottamero e il DNA a una concentrazione salina inferiore a due moli.

Trasferire la miscela in una membrana dialitica con cutoff di sei chilodalton e dializzare contro un litro di buffer di ripiegamento per tutta la notte a quattro gradi Celsius. Nel giorno successivo, ridurre la concentrazione di sale del buffer dialitico in modo graduale. Mantenere il campione in ciascun buffer di cloruro di sodio per almeno tre ore.

Successivamente, trasferire la membrana da dialisi in un becher contenente un litro di buffer per il saggio e proseguire la dialisi tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, raccogliere il campione dializzato. Rimuovere qualsiasi precipitato formato mediante centrifugazione in un microcentrifugo per cinque minuti a quattro gradi Celsius alla velocità massima.

Concentrare il campione utilizzando un filtro centrifugo con cutoff di 30 chilodalton fino a un volume finale di circa 300 microlitri. Misurare la concentrazione di DNA a 260 nanometri. La concentrazione finale dovrebbe essere compresa tra 10 e 20 micromolari.

Conservare il campione a quattro gradi Celsius per un periodo di alcune settimane. Un profilo di eluizione mediante filtrazione su gel della miscela di istoni rinaturati mostra gli ottameri di istoni che eluiscono a circa 70 millilitri. Un gel SDS-PAGE mostra la corretta stechiometria degli istoni.

Il pool ottagimerico ricostituito, contenente i tre tipi di ottameri, è sottoposto a un protocollo di purificazione con doppia affinità. L'isolamento delle specie asimmetriche viene verificato mediante la presenza del marcatore di affinità. I marcatori di affinità vengono successivamente rimossi con la proteasi TEV.

Una riconstituzione su piccola scala di nucleosomi, utilizzando diversi rapporti molari di DNA rispetto all'ottamero, ha mostrato che un rapporto uno a uno era ottimale. È stata eseguita una riconstituzione su larga scala di nucleosomi impiegando il rapporto molare ottimizzato tra DNA e ottamero, osservando la corretta stechiometria delle quattro istoni core. La spettroscopia NMR di nucleosomi marcati in modo differenziale con isotopi ha confermato la presenza di istoni H3 gemelli marcati con azoto-15 e carbonio-13.

In questo esempio applicativo, nucleosomi etichettati in modo differenziale con isotopi e fosforilati in modo asimmetrico sull'anello C 10 dell'istone H3 sono stati fatti reagire con l'acetiltransferasi GCN5. L'acetilazione della lisina 14 dell'istone H3 su entrambe le copie di H3 è stata seguita in tempo reale mediante spettroscopia NMR. L'analisi ha rivelato che la fosforilazione dell'istone H3 sull'anello C 10 stimola l'acetilazione della lisina 14 dell'istone H3 da parte di GCN5 in modo cis rispetto al modo trans.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni se effettuata correttamente. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come ricostituire nucleosomi contenenti istoni gemelli con caratteristiche diverse.