Ricostituzione dei nucleosomi con differenzialmente marcati con isotopi sorelle istoni

L'obiettivo generale di questo protocollo biochimico è quello di generare nucleosomi con istoni fratelli marcati in modo differenziato con isotopi. Da utilizzare nella mappatura simultanea delle reazioni di modifica post-traduzionale su entrambi gli istoni fratelli. L'obiettivo generale di questo protocollo biochimico è quello di generare nucleosomi con istoni fratelli marcati in modo differenziato con isotopi da utilizzare nella mappatura simultanea delle modifiche post-traduzionali su entrambi gli istoni fratelli.

Questo metodo, in combinazione con tecniche ad alta risoluzione per mappare le modifiche post-traduzionali, come nella spettroscopia di massa, affronta domande chiave nella biologia della cromatina, come quali meccanismi contribuiscono alla formazione di un nucleosoma simmetricamente modificato? Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere facilmente stabilita in un laboratorio biochimico perché combina protocolli standard di ricostituzione nucleosomica con metodologie comuni di purificazione delle proteine. Due pool di istone H3 saranno utilizzate per la ricostituzione dell'ottammaro.

Azoto 15 marcato H3 che contiene un tag di poliistidina all'estremità amminica, e carbonio 13 marcato H3 che contiene un tag di affinità per la streptavidina all'estremità amminica. Iniziare questa procedura sciogliendo le aliquote istoniche liofilizzate, compresi i due tipi di istone H3 nel tampone di dispiegamento. A ciascuna provetta che contiene circa cinque milligrammi di istoni, aggiungere un millilitro di tampone di dispiegamento e mescolare mediante pipettaggio, ma senza vortici.

Tenere i tubi sul ghiaccio per 30 minuti per consentire il completo dispiegamento. Successivamente, misurare l'assorbanza a 280 nanometri per determinare l'esatta concentrazione di ciascun istone. Mescola gli istoni centrali in rapporti molari uguali, tenendo presente di includere il 50% di ciascuna delle due pool di istoni H3.

Utilizzare il tampone di dispiegamento per regolare la concentrazione proteica finale a circa un milligrammo per millilitro. Trasferire la miscela in una membrana di dialisi cutoff da sei kilodalton. E dializzare contro uno o due litri di tampone di ripiegamento raffreddato a quattro gradi Celsius.

Il giorno successivo, raccogliere il materiale dializzato e rimuovere eventuali precipitati mediante centrifugazione in microfuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius alla massima velocità. Dopo aver determinato la concentrazione dell'ottamero, utilizzare un'unità di filtro centrifugo cutoff da 10 kilodalton per concentrare l'ottamero a un volume finale di circa due millilitri. Dovrebbe essere ottenuta una concentrazione di ottamero compresa tra 50 e 100 micromolari.

Prepararsi per la filtrazione su gel collegando la colonna di filtrazione su gel a un sistema FPLC. Equilibrare con due volumi di colonna, o CV di 0,22 micrometri di tampone di ripiegamento filtrato e degassato. Iniettare il materiale concentrato a una velocità di flusso di un millilitro al minuto e raccogliere frazioni da uno a 1,5 millilitri.

Per iniziare questa procedura, raggruppare le frazioni pertinenti contenenti ottameri puri e determinare la concentrazione come descritto in precedenza. Collegare una colonna da un millilitro di acido nitrilotriacetico di nichel o nichel NTA al sistema FPLC. E equilibrare con 10 CV di tampone di ripiegamento filtrato e degassato da 0,22 micrometri a una portata di un millilitro al minuto.

Passare l'ottamero purificato attraverso l'NTA di nichel utilizzando una portata di un millilitro al minuto. Raccogli il flusso. Eluire con 10 CV di tampone di ripiegamento contenente 250 millimolari di imidazolo utilizzando una velocità di flusso di un millilitro al minuto.

Raccogliere l'eluizione NTA di nichel. La purificazione a base di streptavidina dovrebbe idealmente essere eseguita in una cella frigorifera. Equilibrare una colonna di affinità da un millilitro di una streptavidina commerciale con tampone di ripiegamento da 10 CV contenente 250 millimolari di imidazolo utilizzando una configurazione a flusso di gravità batch.

Passare l'eluizione di nichel NTA attraverso la colonna di affinità della streptavidina. Raccogli il flusso. Eluire con 10 CV di tampone di ripiegamento contenente 2,5 millimolari di destiobiotina.

Raccogli l'eluizione. Dopo aver misurato la concentrazione di ottamero nell'eluizione, aggiungere 10 volte meno proteasi TEV e lasciare che la reazione proceda per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, trasferire la miscela in una membrana di dialisi cutoff da 50 kilodalton e dializzare contro il tampone di ripiegamento per una notte a quattro gradi Celsius.

Concentrare l'octamero asimmetrico purificato utilizzando un'unità di filtro centrifugo cutoff da 10 kilodalton a un volume di uno o due millilitri. La concentrazione di ottamero prevista è compresa tra 20 e 50 micromolari. La ricostituzione dei nucleosomi richiede che il DNA contenga una sequenza di posizionamento dei nucleosomi.

Regolare la concentrazione di sale del DNA a due molari di cloruro di sodio utilizzando una soluzione madre di cloruro di sodio a cinque molari. Mescolare il DNA con l'ottamero e il tampone di ripiegamento utilizzando il rapporto ottimale tra ottamero e DNA determinato da un test su piccola scala. Aggiungere l'ottamero per ultimo per evitare qualsiasi possibilità di mescolare l'ottamero e il DNA a una concentrazione salina inferiore a due molari.

Trasferire la miscela in una membrana per dialisi cutoff da sei kilodalton e dializzare con un litro di tampone di ripiegamento a destra a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, ridurre gradualmente la concentrazione di sale del tampone per dialisi. Conservare il campione in ciascun tampone di cloruro di sodio per almeno tre ore.

Quindi, trasferire la membrana di dialisi in un becher con un litro di tampone di dosaggio e continuare la dialisi durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, prelevare il campione dializzato. Rimuovere il precipitato formatosi dalla centrifugazione in microfuga per cinque minuti a quattro gradi Celsius alla massima velocità.

Concentrare il campione utilizzando un'unità di filtro centrifugo cutoff da 30 kilodalton fino a un volume finale di circa 300 microlitri. Misurare la concentrazione di DNA a 260 nanometri. La concentrazione finale dovrebbe essere compresa tra 10 e 20 micromolari.

Conservare il campione a quattro gradi Celsius per un massimo di diverse settimane. Un profilo di eluizione di filtrazione su gel della miscela di istone ripiegata mostra che gli ottameri istonici eluiscono a circa 70 millilitri. Un gel della pagina SDS mostra la stechiometria istonica corretta.

Il pool ottamerica ricostituito contenente i tre tipi di ottameri è sottoposto a uno schema di purificazione di affinità tandem. L'isolamento delle specie asimmetriche è verificato dalla presenza del tag di affinità. I tag di affinità vengono successivamente rimossi con la proteasi TEV.

Una ricostituzione nucleosomiale su piccola scala utilizzando diversi rapporti molari tra DNA e ottamero ha dimostrato che un rapporto di uno a uno era ottimale. È stata eseguita una ricostituzione nucleosomiale su larga scala utilizzando il rapporto molare tra DNA e ottamero ottimizzato ed è stata osservata la corretta stechiometria dei quattro istoni principali. La spettroscopia NMR di nucleosomi marcati con isotopi differenziali ha confermato la presenza di istoni H3 marcati con azoto 15 e carbonio 13 marcati

In questo esempio applicativo, i nucleosomi marcati in modo differenziale con isotopi e fosforilati asimmetricamente sull'anello C 10 dell'istone H3 sono stati fatti reagire con GCN5 acetiltransferasi. E l'acetilazione dell'istone H3 lisina 14 su entrambe le copie H3 è stata seguita in tempo reale dalla spettroscopia NMR. L'analisi ha rivelato che l'anello C 10 della fosforilazione dell'istone H3 stimola l'acetilazione dell'istone H3 lisina 14 da parte di GCN5 in cis rispetto a in trans.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in cinque giorni se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come ricostituire nucleosomi contenenti istoni fratelli con caratteristiche diverse.