Controllabile Espressione Ion Canale attraverso inducibile trasfezione transiente

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire un modo conveniente per controllare l'espressione dei canali ionici in sistemi eterologhi, evitando lunghe complicazioni della coltura cellulare. Fornendo così un modo per controllare le condizioni tra gli esperimenti e generare risultati più replicabili. Questo metodo può aiutare a facilitare la ricerca nel campo dei canali ionici.

Come caratterizzare le proprietà dei canali in farmacologia. Poiché i metodi attuali sono complessi o mostrano un'espressione proteica incoerente. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo raggiungere livelli di espressione controllati di un'ampia varietà di proteine su misura per esperimenti individuali in un tempo relativamente breve.

Per iniziare questa procedura, trasferire le celle TREX 293 in una piastra a 12 pozzetti preparata con 0,9 millilitri di DMEM completo per pozzetto per generare una confluenza del 50%. E incubare le cellule durante la notte a 37 gradi Celsius in un incubatore a CO2. Successivamente, preparare una miscela di trasfezione composta da DMEM, il gene di interesse, mostrato qui, TRPV1, un plasmide inerte, e il reagente di trasfezione lipidica.

Per gli esperimenti elettrofisiologici, includere EGFP nel plasmide di espressione dei mammiferi nel cocktail di trasfezione al fine di visualizzare le cellule che subiscono con successo la trasfezione. Incubare la miscela di trasfezione a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, trasfettare le cellule pipettando la miscela di trasfezione goccia a goccia sulle cellule piatte nella piastra a 12 pozzetti.

Scuotere energicamente la piastra per garantire una dispersione omogenea del DNA e del reagente di trasfezione. Successivamente, incubare le cellule trasfettate per una notte a 27 gradi Celsius. La mattina successiva, se si esegue l'elettrofisiologia, confermare che le cellule sono state trasfettate con successo osservando il segnale fluorescente di EGFP sotto una lampada UV.

Se si esegue l'elettrofisiologia, trasferire le celle dalla piastra a 12 pozzetti ai vetrini coprioggetti rivestiti in PDL in 500 microlitri di DMEM completo. Se si esegue l'imaging del calcio, individuare circa 20.000 cellule in camere di imaging del calcio rivestite con PDL. In questa procedura, preparare una soluzione madre di doxiciclina a un milligrammo per millilitro in acqua distillata doppia.

Proteggere la soluzione madre dalla luce a quattro gradi Celsius per un massimo di tre settimane. Per la conservazione a lungo termine, mantenere la soluzione madre di doxiciclina a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Successivamente, preparare una soluzione fresca di doxiciclina in DMEM completo.

E scaldalo a 37 gradi Celsius. Per le registrazioni elettrofisiologiche, pipettare 500 microlitri di soluzione di doxiciclina a due microgrammi per millilitro in ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di doxiciclina a un microgrammo per millilitro. Per l'imaging del calcio, aggiungere 100 microlitri di soluzione di doxiciclina a tre microgrammi per millilitro a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione finale di doxiciclina a un microgrammo per millilitro.

Incubare il campione per il tempo desiderato per l'induzione a 37 gradi Celsius e al cinque percento di CO2. Per calibrare l'espressione proteica attraverso l'imaging del calcio, preparare la soluzione di Ringer e riscaldarla a 37 gradi Celsius. Per aiutare a disperdere gli esteri AM, un indicatore ionico fluroescente, come Fura-2 in soluzioni acquose, prepara una soluzione di F-127 non ionico in DMSO.

Riscaldare la soluzione a 27 gradi Celsius fino a quando l'F-127 non ionico non si è sciolto. Quindi conservare la soluzione non ionica di F-127 a temperatura ambiente e riscaldarla nuovamente a 37 gradi Celsius prima dell'uso. Successivamente, preparare una soluzione di carico Fura-2 AM dalla soluzione di Ringer, integrata con due o tre micromolari di Fura-2 AM, 02 milligrammi per millilitro di F-127 non ionico e 10 millimolari di D-glucosio.

Quindi aspirare il terreno dalle celle nelle camere e sostituirlo con la soluzione di caricamento Fura-2 AM. Incubare le cellule per 60 minuti a temperatura ambiente al buio. Successivamente, aspirare la soluzione Fura-2 AM.

E lavare le cellule con Ringer's e una soluzione di D-glucosio da 10 millimolari per rimuovere il colorante cellulare in eccesso. Lasciare 200 microlitri di Ringer e 10 millimolari di soluzione di D-glucosio in ciascuno. E incubarlo per 30 minuti a temperatura ambiente al buio.

Dopo 30 minuti, posizionare la camera sul tavolino sopra il nasello del microscopio e fissarla con il supporto. Quindi calcolare e preparare una concentrazione di lavoro dell'agonista specifico TRPV1 capsaisina in base alla concentrazione finale desiderata. Quindi, accendi la lampada, la fotocamera e il microscopio e seleziona il filtro Fura-2 per rilevare l'emissione a una lunghezza d'onda di 510 nanometri.

Regolare l'ingrandimento desiderato e mettere a fuoco le cellule nel campo selezionato manipolando questi parametri utilizzando le manopole del microscopio. Al buio, sottrarre la luce di sfondo e impostare il tempo di esposizione. Impostare il campionamento dell'immagine alla velocità desiderata.

Quindi, inizia registrando la risposta alla fluorescenza delle celle caricate con Fura-2 eccitandole a lunghezze d'onda di 340 nanometri e 380 nanometri. Il rapporto tra 340 e 380 segnali è un indicatore della concentrazione intracellulare di calcio e quindi anche dell'attività di TRPV1. Successivamente, aggiungere due capsaicina micromolare in 200 microlitri della soluzione di Ringer per creare una concentrazione saturante finale di una capsaicina micromolare al fine di valutare il livello di espressione di TRPV1 e analizzare la risposta di TRPV1.

Per determinare il tempo di induzione ideale per la registrazione a canale singolo, preparare prima il bagno e le soluzioni per pipette. Quindi preparare alcune pipette di vetro, lucidate a fuoco a una resistenza da 10 a 12 megaohm. Eseguire il patch clamp dell'intera cellula creando un sigillo sulla membrana della cellula bersaglio.

Successivamente, impostare il potenziale di mantenimento su 40 millivolt negativi. E rompere la membrana applicando una pressione negativa. Successivamente, utilizzando il micromanipolatore, sollevare la pipetta con il cerotto di mebrana lontano dalla cellula.

Quindi posizionare il sistema di profusione direttamente accanto alla pipetta contenente il cerotto a membrana. Abbassa il filtro Bessel e il guadagno di uscita rispettivamente da due a cinque killahurtz e 10 ampere. Successivamente, abbondante le concentrazioni saturanti di agonista sul cerotto della membrana.

Quindi analizza il numero di patch a canale singolo registrate con successo rispetto al tempo di induzione applicato alle cellule e regola il tempo di induzione in base ai risultati desiderati. Qui sono mostrate le immagini pseudo colorate delle cellule TREX 293 che esprimono transitoriamente RTRPV1, prima e dopo l'applicazione della capsaicina. Ed ecco le variazioni corrispondenti dei livelli intracellulari di calcio nel tempo nelle cellule TREX 293 trattate e trasfettate.

Ogni grafico rappresenta una media di 50 celle. Il tasso di successo del patch a canale singolo nelle registrazioni TRPV1 dipende dal tempo di induzione. Ecco le tracce attuali di patch da cellule TREX 293 che esprimono transitoriamente RTRPV1 dopo due ore e quattro ore di induzione.

E questo grafico descrive il numero di canali in un patch dopo il tempo di induzione indicato. Questa tecnica, può darci l'analisi di una proteina con espressione controllata entro 12 ore dalla trasfezione se viene eseguita correttamente. Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di standardizzare le concentrazioni di trasfezione e il tempo di induzione per le diverse proteine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come produrre un sistema di espressione controllabile in modo efficiente in termini di tempo per lo ione di tua scelta.