L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un In Vitro Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

L'obiettivo generale di questo test di trasmigrazione è quello di studiare lo stravaso dei linfociti nel sistema nervoso centrale in vitro. Questo metodo può aiutare a migliorare la nostra comprensione delle malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e nello sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Alcuni vantaggi di questa tecnica sono che è facilmente accessibile e che consente l'analisi di popolazioni di linfociti rari a livello di singola cellula.

Questo metodo può fornire informazioni sulla trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica e può essere applicato allo studio della trasmigrazione attraverso la barriera emato-cerebrospinale. Inoltre, l'analisi della permeazione blu di Evans può essere eseguita per valutare l'integrità del modello di barriera emato-encefalica. Inizia coprendo il fondo di un pallone di coltura cellulare T-25 con due millilitri di soluzione di fibronectina appena preparata per un'incubazione di almeno tre ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di fibronectina con 7,2 volte 10 al quarto di cellule endoteliali microvascolari del cervello umano, o HBMEC, in sei millilitri di terreno ECM-b completo e rimettere il pallone nell'incubatore. Quando l'HBMEC raggiunge una confluenza dell'80%, trasferire il surnatante in una provetta conica da 15 millilitri e lavare le cellule aderenti tre volte con cinque millilitri di PBS. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere due millilitri di soluzione di Accutase preriscaldata alle celle per due minuti a 37 gradi Celsius.

Quindi picchiettare con decisione più volte il pallone, confermando il distacco della cellula mediante microscopia ottica. Quando le cellule iniziano a sollevarsi dal fondo del pallone, utilizzare il surnatante raccolto per sciacquare ripetutamente il pallone fino a quando la maggior parte degli HBMEC non viene ririsolta. Quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta conica da 15 millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di terreno ECM-b fresco per il conteggio.

Per preparare gli inserti di coltura cellulare per un test di trasmigrazione, aggiungere prima 100 microlitri di soluzione di fibronectina a ciascun inserto e a un pozzetto di una piastra a fondo piatto a 96 pozzetti. Dopo tre ore a 37 gradi Celsius, sostituire la soluzione di fibronectina con 100 microlitri di HBMEC e aggiungere 600 microlitri di terreno ECM-b fresco nei compartimenti inferiori degli inserti di coltura cellulare. Quindi rimetti le piastre nell'incubatore per colture cellulari per tre o quattro giorni.

Per verificare se l'integrità della barriera è stata raggiunta, aspirare il terreno dai compartimenti inferiore e superiore di un inserto di coltura cellulare e aggiungere 100 microlitri di soluzione di blu di Evans appena preparata all'inserto. Aggiungere 600 microlitri di PBS integrato con B27 nello scomparto inferiore e rimettere la piastra nell'incubatrice. Dopo un'ora, utilizzare una pinza per rimuovere con cura l'inserto e trasferire 100 microlitri di PBS B27 dallo scomparto inferiore in due pozzetti individuali di una piastra nera in polistirolo a fondo piatto a 96 pozzetti.

Quindi caricare la piastra in un lettore di micropiastre multimodale e determinare la posizione z ottimale. Per determinare la funzione di barriera HBMEC, misurare l'eccitazione della soluzione di colorante blu di Evans utilizzando le impostazioni appropriate e confrontare i dati acquisiti con una curva standard che rappresenta la permeazione del blu di Evans attraverso l'HBMEC in diversi punti temporali dopo la semina. Dopo aver confermato la formazione del monostrato cellulare, risospendere la cellula mononucleata del sangue periferico, o PBMC, a una concentrazione di cinque volte 10-sesta cellule per millilitro in terreno RPMI integrato con B27.

Successivamente, aspirare il terreno dai compartimenti inferiore e superiore del numero appropriato di inserti di coltura cellulare contenenti i monostrati HBMEC confluenti e aggiungere 100 microlitri di PBMC per donatore agli inserti di coltura cellulare e a un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti per controllo in vitro. Aggiungere 600 microlitri di RPMI più B27 agli scomparti inferiori degli inserti per colture cellulari e 500 microlitri ai pozzetti di controllo in vitro, quindi rimettere le piastre nell'incubatore per colture cellulari per sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare una pinza per rimuovere gli inserti di coltura cellulare, sciacquando accuratamente i fondi con 400 microlitri di PBS senza toccare le membrane.

Quindi miscelare accuratamente 20 microlitri di fluorosfere a flusso con le cellule nei pozzetti di controllo sperimentali e in vitro e trasferire un millilitro delle sospensioni di PBMC risultanti nelle provette per citometria a flusso corrispondenti appropriate. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e aggiungere gli anticorpi coniugati al fluorocromo di interesse in 100 microlitri di tampone per citometria a flusso a ciascun campione. Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule con 250 microlitri di tampone fresco per citometria a flusso e risospendere i pellet nel volume appropriato di tampone per citometria a flusso per l'analisi.

Una volta acquisiti tutti i dati, aprire il software di analisi della citometria a flusso appropriato. Per analizzare la trasmigrazione del sottoinsieme di cellule NK, selezionare prima i linfociti in un grafico del canale di dispersione laterale rispetto a quello diretto e visualizzare le cellule in un diagramma a punti CD3 rispetto a CD56. Quindi selezionare le cellule NK CD56-positive e CD3-negative.

Per distinguere tra i sottoinsiemi di cellule NK trasmigrate, visualizzare le cellule in un grafico CD56 rispetto a CD16 e il gate per le cellule CD56bright, CD16dim o negative e CD56dim, CD16-positive. Quindi selezionare le fluorosfere di conteggio del flusso da un grafico a dispersione diretta rispetto a quello laterale. Per determinare il numero del microanello, visualizzare i dati selezionati in un grafico di un canale che copre una lunghezza d'onda di emissione compresa tra 525 e 700 nanometri rispetto al tempo.

Infine, determinare la percentuale di cellule NK migrate come rapporto tra il numero totale di cellule migrate e il numero totale di cellule nel controllo in vitro. Dopo tre o quattro giorni di coltura, l'HBMEC ha espresso la molecola a giunzione stretta Zonula occludens-1 e cresce in monostrati che mostrano resistenza elettrica transendoteliale e ridotta permeazione del colorante blu di Evans. La stimolazione del monostrato di cellule endoteliali con interferone gamma e TNF alfa per 24 ore prima di un test di trasmigrazione dell'intera PBMC determina un aumento della migrazione di tutte le popolazioni di linfociti analizzate.

È interessante notare che le cellule NK CD56bright, CD16dim o negative mostrano una capacità migratoria più elevata rispetto a CD56dim, NK CD16-positivo sia per HBMEC non stimolato che attivato da citochine. Sebbene l'aumento relativo della trasmigrazione attraverso un monostrato di cellule infiammate sia complessivamente maggiore per le cellule CD56dim, imitando le osservazioni in vivo secondo cui le cellule NK CD56bright e CD16dim-negative sono arricchite nel compartimento intratecale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro 10 ore.

Il pretrattamento della configurazione di trasmigrazione in vitro con interferone gamma e TNF alfa consente lo studio della migrazione dei linfociti in condizioni infiammatorie. Il nostro protocollo può essere modificato applicando forze di taglio o mediante co-coltivazione con altre cellule della barriera emato-encefalica, come gli astrociti, per fornire un modello raffinato per la trasmigrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare la trasmigrazione dei linfociti utilizzando un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana.