Name: Lanalisi dei linfociti stravaso utilizzo di un In Vitro Modello del Sangue-Cervello umano Barriera (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Scopri l'assaggio di transmigrazione dei linfociti attraverso una barriera ematoencefalica umana in vitro. Questo metodo permette l'analisi a livello di singola cellula per studiare malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale.

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Questo studio è stato supportato dal Centro di Ricerca Collaborativa CRC TR128 "Initiating/Effector versus Regulatory Mechanisms in Multiple Sclerosis-Progress towards Tackling the Disease" (Progetto A9 a H.W. e C.C.G., progetto B1 a N.S.).

1. Colture Cellulari del cervello umano cellule endoteliali microvascolari (HBMEC) <ol><li> Rivestimento di fiaschi di coltura cellulare <ol><li> Per preparare la soluzione di fibronectina, aggiungere 10 ml di PBS in una provetta da centrifuga 15. Aggiungere 150 microlitri fibronectina e mescolare bene. </li><li> Per coprire il fondo un pallone di coltura di cellule T-25 aggiungere 2 mL della soluzione fibronectina. Incubare la beuta di coltura cellulare per almeno 3 ore a 37 ° C in incubatore. Rivestito fibronectina flaconi possono essere conservati per 2 settimane a 37 ° C / 5% di CO 2. </li></ol></li><li> Semina e coltura cellulare di HBMEC <ol><li> soluzione fibronectina Aspirare dal fondo del pallone di coltura cellulare. Aggiungere 7,2 x 10 4 HBMEC / cm sospesi in 6 mL ECM-b medie (= ECM-b integrato con 5% di siero fetale bovino, 1% di penicillina / streptomicina, e 1% supplemento di crescita delle cellule endoteliali). Incubare a 37 ° C / 5% di CO 2. Controllare la crescita delle cellule al giorno utilizzando un microscopio. </li><li> Cambiare la media ogni 3 giorni.Raccogliere o cellule dividere, quando HBMEC raggiungere circa il 80% di confluenza. HBMEC deve essere utilizzato tra passaggio 1 e 15 per evitare la perdita delle proprietà fisiologiche. </li></ol></li><li> Harvest HBMEC. <ol><li> Preparare accutase soluzione miscelando accutase (1x) con PBS a un rapporto di 1: 1. Mantenere accutase soluzione a 37 ° C in un bagno d&#39;acqua fino ad ulteriore utilizzo. </li><li> Trasferimento ECM-b mezzo dal pallone di coltura di cellule in una provetta da centrifuga 15. Lavare HBMEC aggiungendo 5 ml di PBS al fondo del pallone di coltura cellulare. Aspirare PBS e ripetere la fase di lavaggio altre due volte. </li><li> Aggiungere 2 ml di soluzione pre-riscaldato accutase. Incubare a 37 ° C per 2 min. Successivamente, HBMEC vengono risospese saldamente toccando il pallone di coltura cellulare più volte. Cellule distacco è controllato tramite un microscopio </li><li> L&#39;ECM-b-medio precedentemente memorizzato in una provetta da 15 mL viene aggiunto nuovamente al pallone di coltura cellulare non appena HBMEC inizia a staccarsi. Risciacquare il fondo del pallone volte fino a più HBMEC sonoRISOSPESO. </li><li> Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 15. Centrifugare a 300 xg per 10 minuti a temperatura ambiente. Gettare il surnatante e risospendere le cellule in 1 ml ECM-b medie. Contare le cellule e diluire la sospensione cellulare per ottenere una concentrazione finale di 3 x 10 5 HBMEC per mL ECM-b medie. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione del Colture cellulari Inserti <ol><li> Rivestimento di inserti colture cellulari Nota importante: Evitare di toccare la membrana degli inserti colture cellulari. <ol><li> Aggiungere 100 microlitri soluzione fibronectina (vedi 1.1.1) per ciascun inserto di coltura cellulare (Figura 1A) e un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti a fondo piatto (controllo ottico bene). Incubare per almeno 3 ore a 37 ° C. Dopo soluzione di incubazione aspirare fibronectina. </li><li> Aggiungere 100 microlitri di sospensione HBMEC agli inserti di coltura cellulare e il controllo ottico bene. Aggiungere 600 microlitri ECM-b mezzo al compartimento inferiore della cellainserti coltura. Incubare per 3 - 4 giorni a 37 ° C / 5% di CO 2 fino integrità della barriera (Figura 1B) viene raggiunto, controllare la crescita cellulare mediante valutazione microscopica del HBMEC nel controllo ottico bene. Nota: non è consigliabile la crescita delle cellule al di là di quattro giorni. </li><li> Opzionale: Per simulare condizioni infiammatorie aspirare il terreno dal compartimento inferiore e sostituirla con ECM-b mezzo integrato con 500 U / ml di IFN-γ / TNF-α 24 h prima del saggio di migrazione. </li></ol></li></ol> 3. Controllo di qualità con Evans Blue nel Giorno del saggio Trasmigrazione <ol><li> Preparazione della soluzione di blu Evans <ol><li> Per preparare PBS / B27 soluzione della miscela 10 mL PBS con supplemento B27 200 microlitri utilizzando una provetta da centrifuga 15. Diluire soluzione madre blu Evans (20 mg / ml di PBS) 1: 1000 con PBS / B27. </li></ol></li><li> Evans saggio di permeabilità blu <ol><li> Aspirare il terreno dal vano inferiore, seguita da vano superioredi un inserto di coltura cellulare contenente un confluenti HBMEC monostrato. Aggiungere 100 ml di Evans soluzione blu per l&#39;inserto coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 600 microlitri di PBS / B27 al vano inferiore e incubare per 60 min a 37 ° C / 5% di CO 2. Rimuovere con attenzione l&#39;inserto di coltura cellulare con pinze. </li></ol></li><li> misurazione blu Evans <ol><li> Rimuovere PBS / B27 dal compartimento inferiore e trasferire 100 microlitri ciascuno a due pozzetti di una polistirolo nero 96 pozzetti a fondo piatto. Inserire piatto in un lettore di piastre Tecan Pro Infinite M200 e determinare z-posizione ottimale. </li><li> Misura eccitazione di Evans blue utilizzando rispettive impostazioni (ad esempio: eccitazione: 620 nm, emissione: 680 nm, banda di eccitazione: 9 nm, emissione di banda: 20 nm, valorizzazione 175x, 25 lampeggia, tempo di integrazione: 20 ms). </li><li> Per determinare funzioni di barriera HBMEC confronta le acquisiti dati con una curva standard raffigurante Evans blu permeazione attraverso HBMEC a tempi diversi dopo semecellule ing (Figura 1B, destra). </li></ol></li></ol> 4. Migrazione Assay <ol><li> Preparazione delle cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC). <ol><li> Aggiungere 10 ml RPMI in una provetta da centrifuga da 15 ml e aggiungere 200 microlitri B27 supplemento. Contare le cellule PBMC e centrifugare a 300 xg per 5 min. Risospendere PBMC ad una concentrazione finale di 5 x 10 6 cellule / ml RPMI / B27. </li></ol></li><li> Set-up del test di migrazione <ol><li> Aspirare mezzo dal compartimento inferiore, seguita da scompartimento superiore di inserti colture cellulari contenenti confluenti HBMEC monostrati (Figura 1A). Per donatore aggiungere 100 microlitri di sospensione PBMC ciascun agli inserti coltura cellulare ed anche ad un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti a (controllo in vitro). </li><li> Aggiungere 600 microlitri RPMI / B27 al vano inferiore degli inserti colture cellulari e 500 microlitri al PBMC del controllo in vitro e incubare 6 ore a 37 ° C / 5% di CO 2. </li&gt; </ol></li><li> La raccolta delle migrata PBMC <ol><li> Estrarre l&#39;inserto coltura cellulare utilizzando una pinza e risciacquare con cura il fondo con 400 microlitri di PBS senza toccare la membrana. Scartare dell&#39;inserto coltura cellulare. </li><li> Aggiungere 20 ml fluorosfere conteggio del flusso (circa 1.000 perline / mL) al vano inferiore della coltura cellulare inserire nonché al controllo in vitro e mescolare bene. Trasferire 1 ml di sospensione risultante PBMC di citometria a flusso tubi. </li></ol></li></ol> 5. Citometria a Flusso <ol><li> preparazione del campione <ol><li> Centrifuga PBMC a 300 xg per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo aggiungendo anticorpi fluorocromo coniugato a 100 microlitri citometria a flusso tampone (PBS / 1% BSA / 2 mM EDTA) per campione. Per i risultati presentati di seguito 1 ml CD4-FITC, 1 μLCD3-PerCP / Cy5.5, 1 ml CD56-PC7, 1 ml CD8-A700, e 1 ml CD16-A750 sono stati utilizzati per campione. </li><li> Risospendere PBMC in 100 microlitri della soluzione di anticorpi e incubare per 30 min a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 250 microlitri di citometria a flusso di buffer e centrifugare a 300 xg per 5 min. </li></ol></li><li> acquisizione del campione <ol><li> Risospendere PBMC nella quantità richiesta (variabile a seconda del citometro a flusso utilizzato) della citometria a flusso tampone. </li><li> Acquisire macchiato PBMC usando un citometro a flusso con una sonda attiva tra 525 e 700 nm per rivelare fluorosfere conteggio flusso (eccitazione 488 nm, emissione 525 - 700 nm). (Le seguenti operazioni sono un esempio, se si utilizza un flusso Gallio citometro operato con software Kaluza G:. (1) Avviare il computer (2) Quando il sistema operativo è completamente caricato, avviare il citofluorimetro premendo il tasto &quot;citometro a pulsante&quot; . (3) Caricare il rispettivo protocollo di acquisizione premendo il tasto &quot;protocollo aperto&quot;. (4) Scegliere il protocollo richiesto e selezionare &quot;aperto&quot;. (5) Duplicate il protocollo per ogni campione cliccando con il dirittopulsante del mouse sul protocollo visibile nel carosello virtuale e un clic sinistro sul campo &quot;duplicato&quot;. (6) Etichettare ogni campione nella lista di campioni. (7) Trasferire i campioni alle posizioni indicate della giostra e avviare l&#39;acquisizione.) </li></ol></li><li> L&#39;analisi dei campioni <ol><li> Aprire il flusso risultante citometria dati utilizzando il relativo software. Determinare il numero di sottopopolazioni di interesse per trasmigrata PBMC così come le cellule in vitro da pozzetti di controllo e il flusso fluorosfere conteggio utilizzando il rispettivo software di analisi. (Un esempio della strategia di gating è dato nella parte risultati (Figura 1 C: Per analizzare la trasmigrazione di sottoinsiemi cellule NK, selezionare prima linfociti in un canale laterale scatter (SSC) rispetto a canale forward scatter plot (FSC) linfociti sono. poi visualizzati in una CD3 contro trama CD56 e CD56 + CD3 -. Le cellule NK sono selezionati per distinguere tra sottogruppi NK-cellule, le cellule NK vengono visualizzati inun CD56 contro CD16 e CD56 CD16 trama brillante dim / - così come CD56 CD16 dim + cellule NK vengono selezionate. Inoltre, fluorosfere conteggio flusso sono scelti da un terreno FSC rispetto SSC e successivamente visualizzato in una trama di un canale con emissione tra 525 e 700 nm in funzione del tempo per determinare il loro numero.) </li><li> Per calcolare il numero totale di cellule di ciascun campione, normalizzare il numero di cellule rilevata utilizzando fluorosfere conteggio flusso: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55390/55390eq1.jpg" /></li><li> Determinare la percentuale di cellule migrate come rapporto tra cellule migrate totali e cellule totali nel controllo in vitro. </li></ol></li></ol>

L'autore (o gli autori) ha dichiarato i seguenti potenziali conflitti di interesse in relazione alla ricerca, alla paternità e/o alla pubblicazione di questo articolo: A.S.-M. e U.B. non hanno divulgazioni finanziarie. T. S.-H. ha ricevuto le spese di viaggio e di conferenza da Biogen. N.S. ha ricevuto onorari di relatore e comitato consultivo da Biogen e Novartis Pharma, nonché le spese di viaggio da Biogen. H.W. ha ricevuto un compenso per aver fatto parte di comitati consultivi scientifici/comitati direttivi di Bayer Healthcare, Biogen, Merck Serono, Novartis e Sanofi-Genzyme. Ha inoltre ricevuto onorari e supporto per il viaggio da Bayer Vital GmbH, Bayer Schering AG, Biogen, CSL Behring, Fresenius Medical Care, Glaxo Smith Kline, GW Pharmaceuticals, Lundbeck, Merck Serono, Omniamed, Novartis e Sanofi-Genzyme. Ha ricevuto un compenso come consulente da Biogen, Merck Serono, Novartis e Sanofi-Genzyme. H.W. ha ricevuto supporto per la ricerca da Bayer Vital, Biogen, Genzyme, Merck Serono, Novartis, Sanofi-Aventis Germania e Sanofi US. C.C.G. ha ricevuto onorari e spese di viaggio per la partecipazione alle riunioni da Genzyme, Novartis Pharma GmbH e Bayer Health Care.

Qui vi presentiamo una tecnica per indagare la trasmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica umana. In vitro analisi della migrazione dei linfociti al sistema nervoso centrale è importante per studiare i processi fondamentali di linfociti stravaso, potenziali alterazioni correlati alla malattia, e nuovi approcci terapeutici. Diverse modifiche del modello di barriera emato-encefalica sono possibili. Ad esempio, le cellule del compartimento superiore potrebbero ...

migrazione dei linfociti dal sangue nei tessuti è cruciale per la sorveglianza immunitaria. Una sequenza di interazioni molecolari specifici assicura portale di stravaso specifico in piccolo intestino, pelle, linfonodi, il sistema nervoso centrale (SNC), e altri tessuti 1. Alterazioni nella migrazione dei linfociti sono coinvolti nella fisiopatologia di diverse malattie larghe diffusione 2. Migrazione nel CNS immuno-privilegiato è strettamente regolato e di conseguenza alterazioni di questo processo sono coinvolti nelle patologie del SNC sono collegati come encefalomielite 3, neuromielite ottica, ictus, e la sclerosi multipla (MS) 2, 4, 5, 6, 7. Pertanto, è importante studiare linfociti stravaso di capire meglio la malattia fisiopatologia e di sviluppare strumenti per un<html> melioration di malattia onere 8, 9, 10, 11, 12. Linfociti migrano nel SNC tramite percorsi distinti. Stravaso attraverso venule postcapillari nello spazio subaracnoideo attraverso la barriera sangue fluido cerebrospinale all&#39;interno del plesso coroide e attraverso la barriera emato-encefalica sono stati descritti 1, 13, 14, 15. Migrazione attraverso la barriera ematoencefalica è condotta dall&#39;interazione di linfociti con cellule endoteliali 14. Contrariamente alle cellule endoteliali in periferia, cellule endoteliali del SNC esprimono elevate quantità di molecole di giunzione strette, così strettamente limitando la quantità di cellule e proteine ​​in grado di attraversare la barriera emato-encefalicalass = &quot;xref&quot;&gt; 16. l&#39;infiammazione in allentamento delle giunzioni strette e induce l&#39;espressione di molecole di adesione; quindi, aumentando la migrazione dei linfociti nel SNC 1, 17, 18. Lo stravaso attraverso la barriera emato-encefalica è un processo a più fasi. Linfociti cordicella per le cellule endoteliali e quindi rotolare lungo l&#39;endotelio in un processo principalmente mediato da selectine 1, 15. Successivamente, le interazioni tra chemochine secrete dall&#39;endotelio ed i rispettivi recettori per chemochine espressi sui linfociti inducono cambiamenti conformazionali di integrine, promuovendo così ferma adesione alle cellule endoteliali 1. Infine, linfociti sia strisciare lungo la barriera endoteliale contro il flusso di sangue prima trasmigranti nello spazio perivascolare, o stallo immediatamente e direttamente trasmigrate al sito della ditta adesione 1, 19, 20. Tutte queste fasi di linfociti stravaso possono essere analizzate in vitro con tecniche distinti 21. Time-lapse microscopia video viene utilizzato per studiare il tethering iniziale e rotolamento 15. Saggi di adesione forniscono informazioni dettagliate su arresto ditta per endoteliali barriere 22. Saggi trasmigrazione come dimostrato qui consentono l&#39;analisi della trasmigrazione immuno-cella 21, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29. Utilizzando l&#39;umano in vitro di sangue modello encefalica, potremmo recentemente dimostrare che una più alta migrcapacità Atory di CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK rispetto al loro CD56 dim CD16 + controparti è riflessa da una predominanza di questo sottogruppo di cellule NK nel vano intratecale 21. Così, il nostro apparato sperimentale sembra essere adatto per simulare la situazione in vivo.

<table><tbody><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>14190-094</td><td>senza CaCl2 o MgCl2</td></tr><tr><td>Fibronectina 1 mg/mL</td><td>Sigma</td><td>F1141-5MG</td><td>da pallone per</td></tr><tr><td>coltura cellulare T-25</td> al plasma bovino <td>Greiner BioOne</td><td>690160</td><td></td></tr><tr><td>HBMEC</td><td>ScienCell</td><td>1000</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Pelobiotech</td><td>PB-H-6023</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma</td><td>A6964-100ML</td><td></td></tr><tr><td>ECM-b</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Integratore per la crescita delle cellule endoteliali</td><td>ScienCell</td><td>1001-b</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3472</td><td>trasparente, diametro 6,5 mm, 3,0 e micro; m dimensione dei pori</td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Evans blue</td><td>Sigma</td><td>E2129-10G</td><td>soluzione madre: 1 g/50 mL PBS</td></tr><tr><td>B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>50x concentrato</td></tr><tr><td>Infinite M200Pro</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto nera a 96 pozzetti</td><td>Greiner BioOne</td><td>675086</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 48 pozzetti</td><td>Corning</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>61870-010</td><td></td></tr><tr><td>Fluorosfere per il conteggio del flusso</td><td>Beckman Coulter</td><td>7547053</td><td></td></tr><tr><td>Na-EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Citometro a flusso a 10 colori</td><td>Gallios Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kaluza 1.5a</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TNF-&alfa;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>IFN-&gamma;</td><td>Peprotech</td><td>300-02</td><td></td></tr><tr><td>CD3-PerCP/Cy5.5</td><td>Biolegend</td><td>300430</td><td>clone UCHT1</td></tr><tr><td>CD56-PC7</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21692</td><td>clone N901</td></tr><tr><td>CD16-A750</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66330</td><td>clone 3G8</td></tr><tr><td>CD4-FITC</td><td>Biolegend</td><td>300506</td><td>clone RPA-T4</td></tr><tr><td>CD8-A700</td><td>Beckman Coulter</td><td>A66332</td><td>clone B9.11</td></tr></tbody></table>

l&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; in vitro</em&gt; modello del sangue-cervello umano barriera

Analysis of Lymphocyte Extravasation Using an In Vitro Model of the Human Blood-brain Barrier

Linfociti stravaso nel sistema nervoso centrale (CNS) è fondamentale per la sorveglianza immunitaria. alterazioni correlati alla malattia di linfociti stravaso possono provocare alterazioni fisiopatologiche nel SNC. Così, l&#39;indagine della migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale è importante per capire le malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e di sviluppare nuovi approcci di terapia. Qui vi presentiamo un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana per studiare linfociti stravaso. cellule endoteliali microvascolari cerebrali umano (HBMEC) sono confluently coltivate su un tereftalato di polietilene poroso Transwell inserire per imitare l&#39;endotelio della barriera emato-encefalica. funzione di barriera è convalidato dal zonula occludere immunoistochimica, transendoteliale resistenza elettrica (TEER) misurazioni così come l&#39;analisi di Evans blue permeazione. Questo modello permette di indagine della diapedesi delle sottopopolazioni linfocitarie rari come CD56 CD16 luminoso dim / - cellule NK. Furthermminerale, gli effetti di altre cellule, citochine e chemochine, alterazioni legati alla malattia e distinti regimi di trattamento sulla capacità migratoria dei linfociti può essere studiato. Infine, l&#39;impatto degli stimoli infiammatori oltre a diversi regimi di trattamento sulla barriera endoteliale possono essere analizzati.

Risultati rappresentativi mostrano trasmigrazione di cellule NK e sottoinsiemi di cellule T usando il sangue-cervello modello barriera umana (Figura 1A) sono mostrate. L&#39;integrità del monostrato HBMEC stato convalidato dalla colorazione della molecola giunzioni strette ZO-1, misurazioni transendoteliale resistenza elettrica (Teer), ed Evans blu permeazione (Figura 1B). Dopo 3 - 4 giorni cultura HBMEC espresso molecola giunzioni strette ZO-1 (...

Qui, descriviamo un modello di barriera emato-encefalica umana che consente di studiare la trasmigrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale in vitro.

L&#39;analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello del Sangue-Cervello umano Barriera

Lymphocyte extravasation into the central nervous system (CNS) is critical for immune surveillance. Disease-related alterations of lymphocyte ...

L'obiettivo generale di questo saggio di trasmodulazione è studiare l'extravasazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale in vitro. Questo metodo può contribuire ad approfondire la comprensione delle malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale e allo sviluppo di nuovi approcci terapeutici. Alcuni vantaggi di questa tecnica sono la sua facile accessibilità e la possibilità di analizzare popolazioni rare di linfociti a livello di singola cellula.Questo metodo può fornire informazioni sul transmigrazione dei linfociti attraverso la barriera emato-encefalica e può essere applicato allo studio del transmigrazione attraverso la barriera emato-liquorale. Inoltre, è possibile eseguire un'analisi della permeazione del blu di Evans per valutare l'integrità del modello di barriera emato-encefalica. Iniziare ricoprendo il fondo di un flacone da coltura cellulare T-25 con due millilitri di soluzione di fibronectina appena preparata, seguita da un'incubazione di almeno tre ore in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.Al termine dell'incubazione, sostituire la soluzione di fibronectina con 7,2 × 10⁴ cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane, o HBMEC, in sei millilitri di mezzo ECM-b completo, e reinserire la fiasca nell'incubatore. Quando le HBMEC raggiungono una confluenza dell'80%, trasferire il sopranatante in un tubo conico da 15 millilitri e lavare le cellule aderenti tre volte con cinque millilitri di PBS. Dopo il terzo lavaggio, aggiungere due millilitri di soluzione di Accutase preriscaldata alle cellule per due minuti a 37 gradi Celsius.Quindi battere delicatamente il pallone più volte, verificando il distacco delle cellule mediante microscopia a luce. Quando le cellule iniziano a staccarsi dal fondo del pallone, utilizzare il soprannatante raccolto per risciacquare ripetutamente il pallone finché la maggior parte delle HBMEC non viene risospesa. Successivamente, trasferire la sospensione cellulare in un tubo conico da 15 millilitri per la centrifugazione e risospendere il pellet in un millilitro di mezzo ECM-b fresco per il conteggio.Per preparare gli inserti per colture cellulari per un saggio di transmigrazione, aggiungere innanzitutto 100 microlitri di soluzione di fibronectina a ciascun inserto e a un pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto. Dopo tre ore a 37 gradi Celsius, sostituire la soluzione di fibronectina con 100 microlitri di HBMEC e aggiungere 600 microlitri di mezzo ECM-b fresco nei compartimenti inferiori degli inserti per colture cellulari. Successivamente, reinserire le piastre nell'incubatore per colture cellulari per tre o quattro giorni.Per verificare se è stata raggiunta l'integrità della barriera, aspirare il mezzo dai compartimenti inferiore e superiore di un inserto per coltura cellulare e aggiungere 100 microlitri di soluzione di blu di Evans appena preparata all'interno dell'inserto. Aggiungere 600 microlitri di PBS integrato con B27 al compartimento inferiore e reinserire la piastra nell'incubatore. Dopo un'ora, utilizzare pinzette per rimuovere con attenzione l'inserto e trasferire 100 microlitri di PBS con B27 dal compartimento inferiore in due pozzetti separati di una piastra nera in polistirolo, piatta, da 96 pozzetti.Quindi caricare la piastra in un lettore microplacca multimodale e determinare la posizione z ottimale. Per valutare la funzione di barriera delle HBMEC, misurare l'eccitazione della soluzione di blu di Evans utilizzando le impostazioni appropriate e confrontare i dati ottenuti con una curva standard che rappresenta la permeazione del blu di Evans attraverso le HBMEC in diversi punti temporali dopo la semina. Dopo aver confermato la formazione del monocstrato cellulare, risospendere il campione di cellule mononucleate del sangue periferico, o PBMC, a una concentrazione di cinque volte 10 alla sesta cellule per millilitro in mezzo RPMI integrato con B27.Successivamente, aspirare il mezzo dai compartimenti inferiore e superiore del numero appropriato di inserti per coltura cellulare contenenti monocapotti confluenti di HBMEC, e aggiungere 100 microlitri di PBMC per donatore negli inserti per coltura cellulare e in un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti per ogni controllo in vitro. Aggiungere 600 microlitri di RPMI più B27 nei compartimenti inferiori degli inserti per coltura cellulare e 500 microlitri nei pozzetti di controllo in vitro, quindi rimettere le piastre nell’incubatore per colture cellulari per sei ore. Al termine dell'incubazione, utilizzare pinzette per rimuovere gli inserti per coltura cellulare, risciacquando accuratamente le parti inferiori con 400 microlitri di PBS senza toccare le membrane.Quindi mescolare accuratamente 20 microlitri di Flow-Count Fluorospheres con le cellule nelle pozzette sperimentali e di controllo in vitro, e trasferire un millilitro delle sospensioni di PBMC risultanti nei rispettivi tubi per citometria a flusso. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione, quindi aggiungere agli ogni campione 100 microlitri di anticorpi coniugati a fluorocromo, secondo l'interesse, in tampone per citometria a flusso. Dopo 30 minuti a quattro gradi Celsius, lavare le cellule con 250 microlitri di tampone fresco per citometria a flusso e risospendere i pellet nel volume appropriato di tampone per citometria a flusso per l'analisi.Dopo aver acquisito tutti i dati, aprire il software appropriato per l'analisi della citometria a flusso. Per analizzare la traslocazione del sottoinsieme di cellule NK, selezionare innanzitutto i linfociti in un grafico a dispersione di scattering laterale rispetto a quello anteriore, quindi visualizzare le cellule in un grafico a punti CD3 rispetto a CD56. Successivamente, selezionare le cellule NK positive per CD56 e negative per CD3.Per distinguere tra i sottoinsiemi di cellule NK transmigrate, visualizzare le cellule in un grafico CD56 contro CD16 e selezionare le popolazioni CD56bright, CD16dim o negative e CD56dim, CD16-positive. Successivamente, selezionare le Flow-Count Fluorospheres da un grafico di scattering anteriore contro scattering laterale. Per determinare il numero di microsfere, visualizzare i dati selezionati in un grafico di un canale che copre una lunghezza d'onda di emissione compresa tra 525 e 700 nanometri rispetto al tempo.Infine, determinare la percentuale di cellule NK migrate come rapporto tra il numero totale di cellule migrate e il numero totale di cellule nel controllo in vitro. Dopo tre o quattro giorni di coltura, le HBMEC esprimono la molecola delle giunzioni strette Zonula occludens-1 e crescono in monociti che mostrano resistenza elettrica transendoteliale e ridotta permeazione del colorante blu di Evans. La stimolazione del monocito di cellule endoteliali con interferone gamma e TNF alfa per 24 ore prima di un saggio di transmigrazione di PBMC interi determina un aumento della migrazione di tutte le popolazioni di linfociti analizzate.È interessante notare che le cellule NK CD56bright, CD16dim o negative mostrano una capacità migratoria maggiore rispetto alle cellule NK CD56dim, CD16-positive, sia attraverso HBMEC non stimolate che attivate da citochine. Sebbene l'aumento relativo della traversata attraverso un monocito cellulare infiammato sia complessivamente più elevato per le cellule CD56dim, questo fenomeno rispecchia le osservazioni in vivo secondo cui le cellule NK CD56bright, CD16dim-negative sono arricchite nel compartimento intratecale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata entro 10 ore.Il pretrattamento del sistema di tras-migrazione in vitro con interferone gamma e TNF alfa consente lo studio della migrazione dei linfociti in condizioni infiammatorie. Il nostro protocollo può essere modificato applicando forze di taglio o mediante co-coltura con altre cellule della barriera emato-encefalica, come gli astrociti, al fine di ottenere un modello più accurato per la tras-migrazione dei linfociti nel sistema nervoso centrale. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come indagare la tras-migrazione linfocitaria utilizzando un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana.

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Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo video mostra una procedura per valutare l'interruzione della barriera emato-encefalica in un modello murino EAE. Coloranti fluorescenti di diverse dimensioni vengono iniettati per via retro-orbitale e circolano attraverso i vasi sanguigni del cervello. Il colorante più piccolo fuoriesce attraverso le fessure nel tessuto cerebrale, mentre il colorante più grande entra solo se l'interruzione è grave, correlata all'entità del danno alla barriera.

Determinazione dell'interruzione della barriera emato-encefalica utilizzando coloranti fluorescenti in un modello murino EAE

Questo video mostra un'indagine sperimentale sulla trasmigrazione dei linfociti attraverso un modello di endotelio della barriera emato-encefalica (BBB). Un monostrato di cellule endoteliali microvascolari cerebrali umane (HBMEC) viene generato in vitro e al monostrato vengono aggiunte cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) contenenti linfociti. Le cellule vengono quindi incubate per consentire la trasmigrazione dei linfociti e le cellule migrate vengono quantificate utilizzando la...

Studio della trasmigrazione dei linfociti attraverso un monostrato di cellule endoteliali microvascolari

Istituzione di modelli umani della barriera emato-encefalica (BBB) ​​può beneficiare la ricerca sulle condizioni del cervello connesse con il fallimento BBB. Descriviamo qui una tecnica migliorata per la preparazione di un modello BBB contatto, che consente coculturing di astrociti e cellule endoteliali cervello sui lati opposti di una membrana porosa.

Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Qui, descriviamo un modello murino in vitro della barriera emato-encefalica che fa uso della spettroscopia delle cellule di impedenza, con particolare attenzione alle conseguenze sull'integrità e la permeabilità delle cellule endoteliali in seguito all'interazione con le cellule T attivate.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello della barriera emato-encefalica Utilizzando spettroscopia di impedenza: un focus sui T Cell-endoteliale cellulare Interazione

Presentiamo un saggio di fluorescenza per dimostrare che Lucifero Giallo (LY) è un marcatore robusto per determinare l'apparente permeabilità paracellulare dei monostrati cellulari hCMEC/ D3, un modello in vitro della barriera emato-encefalica umana. Abbiamo usato questo saggio per determinare la cinetica di una formazione di monostrato confluente nelle cellule hCMEC/D3 coltivate.

Lucifero Giallo - Un Robusto Indicatore di Permeabilità Paracellulare in un Modello Cellulare della Barriera Sangue-Cervello Umano

Qui presentiamo un protocollo che descrive l'impostazione di un cellulo in BBB (barriera ematoencefalica)-cultura di poliestere membrana porosa Minibrain inserire il sistema al fine di valutare il trasporto di biomolecole o agenti infettivi attraverso un Bee umano e loro impatto fisiologico sulle cellule cerebrali adiacenti.

Un modello di interfaccia sangue-cervello umano per studiare barriera attraversamenti di agenti patogeni o farmaci e loro interazioni con il cervello

Qui, presentiamo protocolli per studiare danno dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale in vivo. Ci rivolgiamo in particolare come determinare la permeabilità della barriera emato - encefalica e attività della gelatinasi coinvolti nella migrazione dei leucociti attraverso la limitans glia.

Visualizzazione di danno delle barriere endoteliali e gliali dell'unità neurovascolare durante l'encefalomielite Autoimmune Sperimentale In Vivo

Questo manoscritto presenta un protocollo per indurre l'encefalomielite autoimmune sperimentale attiva (EAE) nei topi. Viene inoltre presentato un metodo per l'isolamento e la caratterizzazione dei linfociti infiltrati nel sistema nervoso centrale (CNS) per mostrare come i linfociti siano coinvolti nello sviluppo della malattia autoimmune del SNC.

Analisi citometrica del flusso dell'infiltrazione di linfociti nel sistema nervoso centrale durante l'encefalomielite autoimmune sperimentale

Qui, descriviamo un protocollo, il metodo di coltura cellulare endoteliale estesa (EECM), che consente la differenziazione delle cellule staminali pluripotenti in cellule simili alle cellule endoteliali microvascolari del cervello (BMEC). Queste cellule mostrano l'espressione della molecola di adesione delle cellule endoteliali e sono quindi un modello di barriera emato-encefalica umana adatto a studiare le interazioni delle cellule immunitarie in vitro.

Differenziazione delle cellule staminali pluripotenti indotte umane in cellule simili a cellule microvascolari simili a cellule endoteliali microvascolari del cervello con un fenotipo immunitario maturo

Questo rapporto fornisce protocolli per l'assemblaggio, la coltura cellulare e i saggi sulla piattaforma μSiM per la costruzione di modelli di barriera emato-encefalica.

Utilizzo della piattaforma tissutale barriera MicroSiM (μSiM) per la modellazione della barriera emato-encefalica

È stato sviluppato un metodo per visualizzare lo stravaso di colorante dovuto alla rottura della barriera emato-encefalica (BEE) somministrando due coloranti fluorescenti ai topi in momenti diversi. L'uso del glicerolo come crioprotettore ha facilitato l'immunoistochimica sullo stesso campione.

Valutazione della rottura della barriera emato-encefalica in un modello murino di lesione cerebrale traumatica lieve

Scopri l'assaggio di transmigrazione dei linfociti attraverso una barriera ematoencefalica umana in vitro. Questo metodo permette l'analisi a livello di singola cellula per studiare malattie infiammatorie del sistema nervoso centrale.

L'analisi dei linfociti stravaso utilizzo di un

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