Lavaggio broncoalveolare murini di polmoni per analizzare infiammatoria infiltrazione cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di raccogliere il contenuto cellulare e acellulare del lume polmonare attraverso il lavaggio broncoalveolare per analisi ex vivo e per la valutazione dello stato di malattia in corso dell'animale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia respiratoria sui meccanismi immunitari indotti da infezioni e infiammazioni attraverso la quantificazione delle risposte cellulari e umorali innate nel polmone. I principali vantaggi di questa tecnica sono che è semplice, efficiente e altamente riproducibile e non c'è bisogno di attrezzature o strumenti speciali.

Prima di iniziare la procedura, creare un catetere inserendo un ago calibro 23 in un pezzo di tubo di plastica trasparente in polietilene calibro 21 da 0,5 centimetri e posizionare l'animale in posizione supina. Fissare gli arti del topo e disinfettare il collo con etanolo al 70%. Quindi usa un bisturi per praticare un'incisione cutanea vicino alla trachea.

Apri la pelle per esporre le ghiandole salivari e usa una pinza per separare le ghiandole e rivelare il muscolo ioide sternale. Usa la pinza per incidere il muscolo attorno alla trachea. Quando è visibile, usa la pinza per infilare una sutura di cotone sotto il tessuto tracheale.

Successivamente, utilizzare un ago calibro 26 per perforare con cura il centro della trachea tra due anelli di cartilagine e inserire il catetere prefabbricato di circa 0,5 centimetri nel lume tracheale. Stabilizzare il catetere con la sutura. Quindi, caricare una siringa da un millilitro con un millilitro di soluzione salina bilanciata sterile integrata con EDTA 100 micromolari.

Collegare la siringa carica al catetere e iniettare delicatamente il sale bilanciato e la soluzione di EDTA nel polmone. Quando tutta la soluzione salina è stata iniettata, aspirare delicatamente la soluzione mentre si massaggia il torace. È molto importante essere delicati durante l'iniezione e la riassunzione del fluido solido per massimizzare il recupero del fluido BAL e ridurre al minimo le forze di taglio.

Se il liquido solido penetra attraverso il naso, fissare nuovamente la sutura lungo il catetere. Quando tutto l'aspirato è stato raccolto, trasferire il liquido in una provetta da 15 millilitri con ghiaccio e ripetere il lavaggio altre due volte. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sette minuti se eseguita correttamente.

Dopo la terza raccolta di lavaggio broncoalveolare, centrifugare l'aspirato raggruppato e conservare il surnatante a una temperatura negativa di 80 gradi Celsius. Risospendere il pellet in 200 microlitri di tampone di lisi ACK. Dopo non più di due minuti a temperatura ambiente, diluire il tampone di lisi con un millilitro di PBS freddo e raccogliere le cellule per centrifugazione.

Risospendere il pellet nel volume appropriato di PBS per il numero di campioni da analizzare e aliquotare le cellule nel numero appropriato di pozzetti di una piastra da 96 pozzetti per l'analisi. Raccogliere le celle mediante un'altra centrifugazione e risospendere i pellet in 50 microlitri di FC Block e PBS. Dopo 10 minuti a temperatura ambiente, aggiungere 50 microlitri del cocktail di anticorpi appropriato di interesse a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 30 minuti a 4 gradi Celsius al riparo dalla luce.

Al termine dell'incubazione, centrifugare la piastra e scartare il surnatante, rimettendo in sospensione i pellet fino a un volume finale di 200 microlitri di tampone FAX per pozzetto per l'analisi citofluorimetrica. Utilizzando una strategia di gating basata sull'espressione differenziale di antigeni sulla superficie di varie popolazioni di cellule di lavaggio broncoalveolare, è possibile identificare una varietà di tipi di cellule immunitarie. Le celle e i singoletti sono gated in base alle loro proprietà di dispersione diretta e laterale.

Le cellule coloranti negative vive/morte vengono gated, seguite dall'identificazione delle cellule Cd11c High e Cd11c Low. Nella popolazione Cd11c High, i macrofagi e le cellule dendritiche possono essere identificati in base alla loro espressione rispettivamente di MHC-II e SinglecF. Nella popolazione Cd11c Low, le cellule T e le cellule B possono essere identificate in base alla loro rispettiva espressione di CD3/CD19 e MHC-II.

Nelle cellule rimanenti, eosinofili e neutrofili possono essere identificati rispettivamente dall'espressione del marcatore Cd11b o Ly-6G. Il conteggio delle perle può anche essere aggiunto per determinare il numero assoluto di cellule delle diverse popolazioni cellulari confrontando il rapporto tra gli eventi delle perle e delle cellule, ad esempio, negli animali naïve rispetto a quelli stimolati con LPS. Dopo aver raccolto il fluido BAL, è possibile eseguire altre tecniche come l'array di microsfere di citochine immunoblot ELISA per rispondere a ulteriori domande sul contenuto acellulare del fluido BAL.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare il contenuto cellulare e acellulare del lume polmonare dei topi. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il BAL in modo efficiente e riproducibile.