Creazione di tessuto cardiaco che mostra l'integrazione meccanica degli spheroidi usando la biopittura 3D
2 luglio 2017
Questo protocollo descrive la bioprinting 3D del tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali. Le zone cardiache 3D bioprinted espongono l'integrazione meccanica dei sferoidi dei componenti e sono altamente promettenti nella rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli 3D di malattie cardiache.
Lo scopo di questo video è dimostrare la biostampa 3D di tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali, utilizzando solo cellule. In primo luogo, i cardiomiociti, le cellule endoteliali e i fibroblasti vengono isolati, contati e mescolati ai rapporti cellulari desiderati. Vengono quindi distribuiti utilizzando una pipetta multicanale e ai singoli pozzetti in piastre da 96 pozzetti con attacco ultra basso.
Le cellule nelle piastre a 96 pozzetti vengono incubate per tre giorni, dopo tre giorni, formano sferoidi che battono spontaneamente. La microscopia confocale rivela l'espressione di connessioni in 43, che è marcata in modo fluorescente in verde nei cardiomiociti positivi alla troponina T, che sono marcati in modo fluorescente in rosso all'interno degli sferoidi. Le piastre da 96 pozzetti contenenti gli sferoidi vengono quindi caricate nella bio-stampante 3D.
La bio-stampante 3D inizia trasferendo la piastra a 96 pozzetti in una posizione proprio accanto all'array di aghi utilizzando una piattaforma mobile. La bio-stampante 3D ispeziona quindi tutti gli sferoidi nella piastra a 96 pozzetti per ottenere dati rilevanti su ciascun sferoide, come il suo diametro e la sua forma. Questa è una vista ravvicinata del processo di bioprinting 3D.
Lo sferoide viene prelevato dalla piastra a 96 pozzetti a sinistra da un ugello utilizzando l'aspirazione a vuoto e posizionato in una posizione specifica in una serie di aghi a destra. Questo processo viene ripetuto fino al completamento del processo di bioprinting 3D. Fino a quando tutti gli sferoidi e la piastra a 96 pozzetti non saranno stati biostampati, la biostampante 3D conserverà la piastra a 96 pozzetti esistente e caricherà una nuova piastra, utilizzando la piattaforma mobile.
Questo è un video timelapse che mostra una vista aerea della biostampa 3D di un cerotto nove per nove a una velocità di 100 volte, gli aghi nella matrice di aghi sono disposti in una formazione di gruppo e gli sferoidi vengono caricati su ciascun ago dall'alto. Dopo tre giorni in condizioni sterili, il cerotto cardiaco della biostampante 3D viene rimosso con molta attenzione dall'array di aghi facendo scorrere delicatamente verso l'alto il pezzo di plastica dura nell'array di aghi sotto il cerotto. Lubrificazione con soluzione salina tamponata con fosfato o PBS, può essere applicata agli aghi durante questa fase, se necessario, per una rimozione più fluida e facile.
Il cerotto cardiaco biostampato in 3D è molto fragile, subito dopo la rimozione dall'array di aghi, quindi è necessario prestare la dovuta attenzione per non danneggiarlo. Il cerotto cardiaco biostampato in 3D viene quindi trasferito in una piastra di coltura tissutale da 35 millimetri contenente terreni cellulari appropriati. Immediatamente dopo la rimozione dall'array di aghi, si nota che il cerotto sta già battendo, con i fori dell'ago che cambiano di dimensioni ad ogni battito.
Il cerotto cardiaco biostampato in 3D viene lasciato maturare, durante il quale i vuoti di tessuto causati dall'array di aghi vengono riempiti dal tessuto circostante. Il cerotto cardiaco 3D bioprinting continua a battere spontaneamente. In conclusione, è possibile biostampare in 3D il tessuto cardiaco senza l'uso di biomateriali.
I cerotti cardiaci biostampati in 3D mostrano l'integrazione meccanica dei componenti spheroids. 3D la biostampa del tessuto cardiaco ha promettenti applicazioni cliniche e la rigenerazione del tessuto cardiaco e dispone di modelli 3D del tessuto cardiaco, la replicazione in farmacologia predittiva e tossicologia e lo sviluppo di terapie dirette da cellule e genomi.
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Panoramica
Questo protocollo descrive la biostampa 3D di tessuto cardiaco utilizzando esclusivamente cellule, senza biomateriali. Le patch cardiache risultanti dimostrano un'integrazione meccanica e mostrano potenzialità per la rigenerazione del tessuto cardiaco e come modelli per le malattie cardiache.
Componenti Chiave dello Studio
Settore Scientifico
- Biostampa 3D
- Ingegneria dei Tessuti Cardiaci
- Medicina Rigenerativa
Sfondo
- La rigenerazione del tessuto cardiaco è fondamentale per il trattamento delle malattie cardiache.
- I metodi tradizionali si basano spesso su biomateriali, che possono limitare l'integrazione.
- L'uso esclusivo di cellule può migliorare la funzionalità dei tessuti biostampati.
- Comprendere le interazioni cellulari è essenziale per un ingegneria tissutale di successo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per la biostampa 3D di tessuti cardiaci senza l'uso di biomateriali.
- Valutare l'integrazione meccanica delle patch cardiache biostampate.
- Creare un modello per lo studio delle malattie cardiache.
Metodi Utilizzati
- Isolamento e conteggio di cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti.
- Mescolamento delle cellule in rapporti desiderati e distribuzione in piastre a 96 pozzetti con attacco ultra-basso.
- Incubazione delle cellule per formare sferoidi che battono spontaneamente.
- Microscopia confocale per valutare l'espressione e l'integrazione cellulare.
Risultati principali
- Gli sferoidi formati da cellule miste hanno mostrato un battito spontaneo.
- La microscopia confocale ha confermato l'espressione delle proteine chiave nei cardiomiociti.
- La biostampante 3D ha integrato con successo gli sferoidi in patch cardiache.
- È stata dimostrata l'integrazione meccanica delle patch.
Conclusioni
- La biostampa 3D senza biomateriali è fattibile ed efficace.
- L'approccio mostra potenzialità per la rigenerazione del tessuto cardiaco.
- Questo metodo può rappresentare un modello utile per la ricerca sulle malattie cardiache.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo metodo consente la biostampa 3D di tessuto cardiaco funzionale senza l'uso di biomateriali, offrendo un approccio scalabile per generare ritocchi di tessuto meccanicamente integrati per la modellizzazione preclinica delle malattie e la medicina rigenerativa. Utilizzando esclusivamente cellule, riduce la variabilità derivante da scaffold esogeni e aumenta la rilevanza fisiologica nei test di risposta ai farmaci e di tossicità. I ritocchi risultanti, che battono spontaneamente, supportano la validazione precoce degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nei processi di scoperta cardiovascolare.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione dell'Obiettivo
- Valore scientifico: Consente l'analisi delle interazioni multicellulari nella formazione e funzione del tessuto cardiaco.
- Valore operativo: Fornisce una piattaforma riproducibile per valutare gli effetti di composti su reti integrate di cardiomiociti, cellule endoteliali e fibroblasti.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Genera sferoidi cardiaci contrattili che si fondono in patch meccanicamente integrati, consentendo letture funzionali della contrattilità.
- Valore operativo: Favorisce la standardizzazione dell'architettura del tessuto attraverso il posizionamento preciso dei sferoidi mediante biostampa, migliorando la riproducibilità del saggio.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Crea modelli tridimensionali di tessuto cardiaco pertinenti alle malattie per lo studio della patofisiologia e della risposta terapeutica.
- Valore operativo: Permette la maturazione di patch biostampate in coltura, supportando la valutazione longitudinale dell'integrazione e della stabilità del tessuto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il flusso di lavoro colloca la generazione di sferoidi e la biostampa come un ponte tra la fase iniziale di scoperta e la validazione preclinica, consentendo la creazione di tessuti cardiaci complessi per la successiva valutazione funzionale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi sulle interazioni tra cellule e sull'integrazione meccanica a livello tissutale in un sistema multicellulare definito.
- Screening: Fornisce ritagli cardiaci contrattili standardizzati con attività contrattile quantificabile per lo screening di composti.
- Analisi: Permette la misurazione del battito spontaneo e dell'integrazione strutturale mediante imaging e letture funzionali.
- Ricerca traslazionale: Offre un percorso continuo dalla formazione di sferoidi a ritagli tissutali maturi, modellando il rimodellamento tissutale legato allo sviluppo e alle malattie.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un processo di biostampa riutilizzabile per generare modelli di tessuto cardiaco su diversi bersagli e indicazioni.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Migliora l'affidabilità predittiva modellando la meccanica dei tessuti cardiaci e l'integrazione cellulare in modo simile al tessuto nativo.
- Valore operativo: Elimina la variabilità legata ai biomateriali, migliorando la riproducibilità tra esperimenti e sedi diverse.
- Valore strategico: Riduce il rischio di insuccessi in fasi avanzate consentendo il rilevamento precoce di effetti cardiotoxici o terapeutici in un sistema rilevante per l'essere umano.
- Impatto sul portafoglio: Supporta decisioni adeguatamente ponderate sui rischi nei programmi cardiovascolari grazie a una maggiore fedeltà del modello e alla traslabilità dei dati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'isolamento di cellule primarie, nella coltura di sferoidi e nell'uso del bioprinter 3D.
- Dipende dall'accesso a un bioprinter dotato di capacità di aspirazione a vuoto e di aghi compatibili.
- Necessita di rapporti standardizzati di miscelazione cellulare e di piastre con attacchi ultra-bassi per una formazione costante dei sferoidi.
- Comporta l'ottimizzazione del tempo di maturazione e delle condizioni del mezzo per lo sviluppo di tessuti funzionali.
- È limitato dalle attuali dimensioni delle patch bioprintate e dalla necessità di un'accurata manipolazione dopo la stampa a causa della loro fragilità.
