Un rapido protocollo automatizzato per Fibra muscolare Analisi Popolazione nel ratto muscolari sezioni trasversali utilizzando una catena pesante della miosina immunoistochimica

L'obiettivo generale di questo metodo è guidare in modo rapido e affidabile la quantificazione delle fibre muscolari in muscoli interi di ratto in maniera automatica e indipendente dall'utente, utilizzando una piattaforma open-source. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo neuromuscolare riguardo ai difetti legati all'invecchiamento, alle malattie o ai traumi sui muscoli scheletrici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere utilizzata per analizzare in modo affidabile le popolazioni di fibre muscolari e per generare immagini di alta qualità di sezioni trasversali muscolari.

Dopo un'adeguata scongelazione, sciacquare attentamente i campioni in PBS integrato con Triton X, o PBST, per un lavaggio di 10 minuti e uno di cinque minuti. Dopo il secondo lavaggio, lasciare asciugare all'aria le sezioni per due minuti. Successivamente, utilizzare una penna idrofoba per delimitare singolarmente le sezioni trasversali.

Dopo ulteriori 15 minuti di essiccazione all'aria, bloccare qualsiasi legame non specifico con PBST integrato con siero di capra per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, lavare i vetrini e aggiungere la miscela appropriata di anticorpi primari a ciascun campione per una colorazione di un'ora a temperatura ambiente, protetta dalla luce. Al termine dell'incubazione, risciacquare i vetrini con un lavaggio in PBST di 10 minuti e uno di cinque minuti.

Quindi, etichettare le sezioni muscolari con il cocktail appropriato di anticorpi secondari per un'ora, proteggendo dalla luce. Dopo aver lavato le vetture due volte in PBST, come mostrato, asciugare le vetture e quindi colorare i nuclei con un kit di colorazione nucleare DAPI seguendo le istruzioni del produttore. Rimuovere l'eccesso di DAPI con un lavaggio di un minuto in PBST, seguito da una breve asciugatura all'aria.

Quindi, coprire i campioni con mezzo di montaggio fluorescente e coprioggetti, e conservare i vetrini a quattro gradi Celsius al riparo dalla luce. Entro 24-48 ore dalla colorazione, caricare i vetrini nello scanner per vetrini e aprire un nuovo progetto nel software del programma. Per l'anteprima del vetrino, selezionare il canale DAPI e l'obiettivo 2,5x, e mettere manualmente a fuoco sul primo campione.

Delimitare ogni sezione trasversale da includere per il processo dettagliato di acquisizione e impostare i tempi di esposizione per ogni canale. Avviare ora l'acquisizione automatica delle immagini, verificando la corretta acquisizione del primo campo visivo, per evitare acquisizioni errate nelle fasi iniziali del processo automatizzato. Al termine dell'acquisizione delle immagini, controllare manualmente che l'autofocus delle sezioni trasversali sia corretto e che le singole fibre siano chiaramente distinguibili.

È fondamentale verificare e correggere manualmente l'autofocus per ogni immagine, se necessario. Il processo automatizzato di quantificazione delle fibre muscolari richiede immagini di alta qualità per ottenere risultati ottimali. Successivamente, per ogni sezione trasversale da includere nelle analisi finali, esportare ogni canale tranne DAPI separatamente come file JPEG, denominare i file e ordinarli nelle cartelle opportunamente nominate in base ai canali esposti.

Prima di iniziare il processo di quantificazione delle fibre muscolari, esaminare ogni immagine con un software di editing delle immagini appropriato per verificare un contrasto sufficiente tra le fibre colorate e lo sfondo. Successivamente, in ImageJ, utilizzare il comando Plugin>Macro>Modifica per visualizzare il codice sorgente della macro e modificare la directory della cartella per ogni canale nel codice sorgente della macro. A questo punto, utilizzare il comando Esegui per avviare la macro.

Tutte le immagini nella cartella verranno caricate nel macro e quantificate in ordine consecutivo. Al termine della quantificazione, esportare i risultati nel software di foglio di calcolo appropriato e identificare i valori relativi alle fibre lente, intermedie e veloci positivamente contate. Il numero totale di fibre potrà quindi essere calcolato.

La colorazione immunofluorescente delle fibre muscolari è rapida e presenta scarsa cross-reattività; le immagini risultanti mostrano un elevato contrasto tra le fibre colorate e il tessuto circostante, nonché una netta distinzione tra i diversi tipi di fibre. L'analisi automatica consente di rilevare le popolazioni relative delle fibre muscolari con un'accuratezza di più o meno 4% rispetto all'analisi manuale, con conteggi assoluti complessivi superiori rispetto all'analisi manuale. I conteggi relativi, tuttavia, rimangono simili, entro un intervallo di più o meno 4%.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare questo metodo per automatizzare la quantificazione delle fibre muscolari. Non dimenticare che lavorare con DAPI può essere pericoloso. Pertanto, indossa l'equipaggiamento protettivo appropriato durante l'esecuzione della colorazione.