Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e caratterizzare efficacemente i macrofagi dai tessuti comunemente colpiti dall'infiammazione indotta dalla dieta, come il fegato. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nei campi dell'immunologia e dell'infiammazione su come il fenotipo dei macrofagi residenti nei tessuti possa dettare la progressione delle malattie infiammatorie croniche. Il vantaggio principale di questo è che la procedura ottimizza le fasi di isolamento necessarie per ottenere sospensioni di singole cellule derivate da tessuti colpiti da infiammazione cronica di basso grado mediata dall'obesità.

A dimostrare la procedura sarà Joselyn Allen, una studentessa laureata del mio laboratorio. Per isolare il fegato, posizionare prima un topo imbevuto di etanolo in posizione supina su una tavola da dissezione in polistirene espanso e fissare le zampe anteriori e posteriori. Quindi, usa una pinza a punta media per afferrare la pelle addominale vicino all'apertura dell'uretra e usa le forbici da dissezione affilate per creare una piccola incisione nella pelle sollevata.

Inserire la lama inferiore delle forbici nell'incisione tra la pelle e il peritoneo e praticare un'incisione laterale dall'inguine al mento. Tirare delicatamente indietro la pelle per esporre la cavità peritoneale intatta e la parete toracica e praticare un'incisione laterale attraverso il peritoneo. Sollevare lo sterno e incidere con cura il diaframma.

Quindi spostare gli organi gastrointestinali lateralmente e individuare la vena cava inferiore subepatica o IVC. Utilizzando una pinza emostatica, bloccare l'IVC sopraepatico per mantenere una perfusione localizzata e collegare una siringa riempita con tampone di perfusione preriscaldato a un set di raccolta e infusione di sangue da 23 gauge. Premere delicatamente lo stantuffo fino a riempire il tubo e l'ago con il tampone di perfusione e inserire l'ago parallelamente all'IVC subepatico.

Una corretta incannulazione dell'IVC assicura che il tampone di dissociazione sia distribuito localmente in tutto il fegato e nei tessuti periferici, ottimizzando la digestione dei tessuti. Utilizzare una pinza emostatica di quattro centimetri per fissare l'ago in posizione e premere delicatamente lo stantuffo per iniziare la perfusione. Se l'ago è posizionato in modo appropriato, il colore scomparirà rapidamente dal fegato e i lobi si ingrandiranno.

Tagliare prontamente la vena porta per consentire al tampone di perfusione di fluire liberamente attraverso il fegato, massaggiando di tanto in tanto delicatamente i lobi tra il pollice e l'indice per facilitare la rimozione del sangue. Quando rimangono solo cinque millilitri di tampone di perfusione, sostituire la siringa del tampone di perfusione con una siringa riempita con tampone di dissociazione preriscaldato, continuando a massaggiare delicatamente i lobi e perfondere il fegato fino a quando non è completamente digerito. Conferma una digestione riuscita premendo delicatamente il bordo smussato di un paio di pinze nel lobo laterale sinistro.

Sulla superficie dovrebbe apparire una rientranza che si riempie lentamente una volta rimossa la pinza. Quindi rimuovere l'ago e utilizzare una lama corta e diritta da un paio di forbici da dissezione per tagliare con cura i legamenti di collegamento per asportare l'intero fegato e la cistifellea. Trasferire il fegato in un piatto di 10 centimetri contenente 10 millilitri di DMEM ghiacciato e utilizzare una pinza dentata per afferrare l'IVC sopraepatico reciso.

Utilizzando una pinza a punta media, applicare un rapido movimento di carezza a ciascun lobo per rilasciare le cellule dalla capsula di Glisson e far passare il DMEM saturo attraverso un colino cellulare da 70 micrometri in un tubo conico da 50 millilitri su ghiaccio. Alte rese di cellule vitali possono essere raggiunte solo dissociando correttamente le cellule epatiche dalla capsula di Glisson. Quando tutte le cellule sono state raccolte, capovolgere la provetta per mescolare delicatamente la sospensione cellulare e pellettare le cellule mediante centrifugazione.

Trasferire il surnatante in una nuova provetta conica da 50 millilitri per altre tre centrifugazioni a bassa centrifugazione. Dopo l'ultima centrifugazione, trasferire il surnatante in una nuova provetta da 50 millilitri e centrifugare le cellule ancora una volta a una velocità maggiore. Quindi risospendere il pellet di cellule non parenchimali in tampone FACS per il conteggio e diluire le cellule epatiche alla concentrazione appropriata in base alla loro applicazione a valle in provette di polistirene a fondo tondo da cinque millilitri etichettate.

I topi alimentati con una dieta ricca di grassi o una dieta ricca di grassi e colesterolo mostrano un aumento dell'infiltrazione dei macrofagi M1 classicamente attivati nei tessuti colpiti come l'aorta. I macrofagi positivi al recettore RON che esprimono il recettore RON aortico, i macrofagi F4/80 positivi che dimostrano un fenotipo antinfiammatorio sono diminuiti nei topi alimentati con dieta ricca di grassi e colesterolo alto, mentre i macrofagi CD45 positivi F4/80 positivi CD11c positivi sono stati trovati in numero maggiore nelle aorte isolate da questi animali. Inoltre, i macrofagi che esprimono il recettore RON selezionato derivati dalle aorte digerite mostrano un'aumentata espressione del gene Arginasi 1, un marcatore macrofagico M2 ben consolidato.

Infatti, la caratterizzazione dei macrofagi residenti nel fegato rivela il fenotipo prevalente delle sottopopolazioni che esprimono il recettore RON con popolazioni di macrofagi pro-infiammatori CD11c positivi che dimostrano una ridotta espressione di geni che sono fortemente associati al fenotipo M2 ant-infiammatorio. Tendenze simili si osservano nelle popolazioni di macrofagi isolate dal tessuto adiposo bianco digerito con popolazioni di macrofagi con fenotipo pro-infiammatorio che mostrano una ridotta espressione superficiale del recettore RON. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 20-30 minuti per animale se viene eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la citometria a flusso, la selezione cellulare attivata da fluorescenza e/o la PCR quantitativa per caratterizzare ulteriormente il fenotipo dei macrofagi residenti nel tessuto derivato dal fegato isolato. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare correttamente i macrofagi residenti nei tessuti dai fegati malati. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i tuoi esperimenti.