Name: Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: Scopri come isolare e caratterizzare i macrofagi residenti nei tessuti dal fegato infiammato in modelli di obesità indotta dalla dieta. Questo protocollo ottimizza la preparazione di sospensioni cellulari singole per studiare le malattie metaboliche croniche.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Vorremmo ringraziare il flusso Cytometry Core Facility presso The Pennsylvania State University Millennium scienza complessa.

<ol><li>Davies, L. C., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+macrophages%3A+Then+and+Now%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident macrophages: Then and Now.</a> Immunology. 144 (4), 541-548 (2015).</li>
<li>Kahn, S. E., Hull, R. L., Utzschneider, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nature. 444 (12), 840-846 (2006).</li>
<li>Van Gaal, L. F., Mertens, I. L., De Block, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+linking+obesity+with+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanisms linking obesity with cardiovascular disease.</a> Nature. 444 (12), 875-880 (2006).</li>
<li>Jung, U., Choi, M. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+Its+Metabolic+Complications%3A+The+Role+of+Adipokines+and+the+Relationship+between+Obesity%2C+Inflammation%2C+Insulin+Resistance%2C+Dyslipidemia+and+Nonalcoholic+Fatty+Liver+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Obesity and Its Metabolic Complications: The Role of Adipokines and the Relationship between Obesity, Inflammation, Insulin Resistance, Dyslipidemia and Nonalcoholic Fatty Liver Disease.</a> Int J Mol Sci. 15 (4), 6184-6223 (2014).</li>
<li>Emanuela, F., Grazia, M., Marco, D. R., Maria Paola, L., Giorgio, F., Marco, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+as+a+link+between+obesity+and+metabolic+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nutr+Metab%22%5BJournal%5D)">Inflammation as a link between obesity and metabolic syndrome.</a> Nutr Metab. 2012, 1-7 (2012).</li>
<li>Vieira-Potter, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+macrophage+modulation+in+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inflammation and macrophage modulation in adipose tissues.</a> Cell Microbiol. 16 (10), 1484-1492 (2014).</li>
<li>Chawla, A., Nguyen, K. D., Goh, Y. P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-mediated+inflammation+in+metabolic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease.</a> Nat Rev Immunol. 11 (11), 738-749 (2011).</li>
<li>Dey, A., Allen, J., Hankey-giblin, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ontogeny+and+polarization+of+macrophages+in+inflammation+%3A+blood+monocytes+versus+tissue+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Ontogeny and polarization of macrophages in inflammation : blood monocytes versus tissue macrophages.</a> Front Immunol. 5 (1), 1-15 (2015).</li>
<li>Mills, C. D., Lenz, L. L., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+at+the+fork+in+the+road+to+health+or+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophages at the fork in the road to health or disease.</a> Front Immunol. 6 (2), 1-6 (2015).</li>
<li>Italiani, P., Boraschi, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+monocytes+to+M1%2FM2+macrophages%3A+Phenotypical+vs.+functional+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">From monocytes to M1/M2 macrophages: Phenotypical vs. functional differentiation.</a> Front Immunol. 5 (8), 1-22 (2014).</li>
<li>Guilherme, A., Virbasius, J. V., Vishwajeet, P., Czech, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+dysfunctions+linking+obesity+to+insulin+resistance+and+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Adipocyte dysfunctions linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (5), 367-377 (2008).</li>
<li>Cummins, T. D., Holden, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+remodeling+of+white+adipose+tissue+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Metabolic remodeling of white adipose tissue in obesity.</a> Am J Physiol Endocrinol Metab. 307 (3), 262-277 (2014).</li>
<li>Fujisaka, S., Usui, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+for+Adipose+Tissue+M1+and+M2+Macrophages+in+Diet+Induced+Obese+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms for Adipose Tissue M1 and M2 Macrophages in Diet Induced Obese Mice.</a> Diabetes. 58 (9), 2574-2582 (2009).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotipic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotipic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J Clin Invest. 117 (1), 175-184 (2007).</li>
<li>Qureshi, K., Abrams, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+liver+disease+of+obesity+and+role+of+adipose+tissue+in+the+pathogenesis+of+nonalcoholic+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Metabolic liver disease of obesity and role of adipose tissue in the pathogenesis of nonalcoholic fatty liver disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (26), 3540-3553 (2007).</li>
<li>Bedossa, P., Paradis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+extracellular+matrix+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Liver extracellular matrix in health and disease.</a> J Pathol. 200 (4), 504-515 (2003).</li>
<li>Tilg, H., Moschen, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+inflammation+in+nonalcoholic+fatty+liver+disease%3A+The+multiple+parallel+hits+hypothesis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Evolution of inflammation in nonalcoholic fatty liver disease: The multiple parallel hits hypothesis.</a> Hepatology. 52 (5), 1836-1846 (2010).</li>
<li>Milic, S., Lulic, D., Stimac, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-alcoholic+fatty+liver+disease+and+obesity%3A+Biochemical%2C+metabolic+and+clinical+presentations%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Non-alcoholic fatty liver disease and obesity: Biochemical, metabolic and clinical presentations.</a> World J Gastroenterol. 20 (28), 9330-9337 (2014).</li>
<li>Williams, I. L., Wheatcroft, S. B., Shah, A. M., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+atherosclerosis+and+the+vascular+endothelium%3A+mechanisms+of+reduced+nitric+oxide+bioavailability+in+obese+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Obesity%22%5BJournal%5D)">Obesity, atherosclerosis and the vascular endothelium: mechanisms of reduced nitric oxide bioavailability in obese humans.</a> Int J Obesity. 26 (12), 754-764 (2002).</li>
<li>Mestas, J., Ley, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte-Endothelial+Cell+Interactions+in+the+Development+of+Atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Monocyte-Endothelial Cell Interactions in the Development of Atherosclerosis.</a> Trends Cardiovasc Med. 18 (6), 228-232 (2008).</li>
<li>Wynn, T. A., Chawla, A., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+biology+in+development%2C+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage biology in development, homeostasis and disease.</a> Nature. 496 (7446), 445-455 (2013).</li>
<li>Davies, L. C., Jenkins, S. J., Allen, J. E., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/ni/journal/v14/n10/full/ni.2705.html">Tissue-resident macrophages.</a> Nat Rev Immunol. 14 (10), 986-995 (2013).</li>
<li>Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+specific+cell+population+by+fluorescence+activated+cell+sorting+%28FACS%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS).</a> J Vis Exp. (41), e1546(2010).</li>
<li>Mann, A., Thompson, A., Robbins, N., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization%2C+Identification%2C+and+Excision+of+Murine+Adipose+Depots%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Localization, Identification, and Excision of Murine Adipose Depots.</a> J Vis Exp. (94), e52174(2014).</li>
<li>Smedsrød, B. Protocol for preparation of mouse liver Kupffer cells and liver sinusoidal endothelial cells. 1, Available from: 
 <a target="_blank" href="http://munin.uit.no/handle/10037/4575">http://munin.uit.no/handle/10037/4575</a> 1-10 (2012).</li>
<li>Butcher, M. J., Herre, M., Ley, K., Galkina, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+analysis+of+immune+cells+within+murine+aortas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry analysis of immune cells within murine aortas.</a> J Vis Exp. (53), e2848(2011).</li>
<li>Salamone, M., Saladino, S., Pampalone, M. <a target="_blank" href="http://www.aidic.it/cet/14/38/042.pdf">Tissue Dissociation and Primary Cells Isolation Using Recombinant Collagenases Class I and II.</a> Chemical Engineering Transactions. 38, Matsushita 1994 247-252 (2014).</li>
<li>Wells, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+matrix+stiffness+in+regulating+cell+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The role of matrix stiffness in regulating cell behavior.</a> Hepatology. 47 (4), 1394-1400 (2008).</li>
<li>Fain, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Free+Brown+and+White+Fat+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Isolation of Free Brown and White Fat Cells.</a> Diabetologia. 375 (1964), 555-561 (1968).</li>
<li>Seglen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Method Cell Biol. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Yu, S., Allen, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ron+Receptor+Tyrosine+Kinase+Regulates+Macrophage+Heterogeneity+and+Plays+a+Protective+Role+in+Diet-Induced+Obesity%2C+Atherosclerosis%2C+and+Hepatosteatosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">The Ron Receptor Tyrosine Kinase Regulates Macrophage Heterogeneity and Plays a Protective Role in Diet-Induced Obesity, Atherosclerosis, and Hepatosteatosis.</a> J Immunol. 197 (1), 256-265 (2016).</li>
<li>Yu, Y. R. A., O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+the+comprehensive+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+in+normal+and+inflamed+murine+non-lymphoid+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">A protocol for the comprehensive flow cytometric analysis of immune cells in normal and inflamed murine non-lymphoid tissues.</a> PLoS ONE. 11 (3), 1-23 (2016).</li>
<li>Zizzo, G., Hilliard, B. A., Monestier, M., Cohen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+clearance+of+early+apoptotic+cells+by+human+macrophages+requires+%26%2334%3BM2c%26%2334%3B+polarization+and+MerTK+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient clearance of early apoptotic cells by human macrophages requires &#34;M2c&#34; polarization and MerTK induction.</a> J Immunol. 100 (2), 130-134 (2012).</li>
<li>Jablonski, K. A., Amici, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+markers+to+delineate+murine+M1+and+M2+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Novel markers to delineate murine M1 and M2 macrophages.</a> PLoS ONE. 10 (12), 5-11 (2015).</li>
<li>Rőszer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+Mysterious+M2+Macrophage+through+Activation+Markers+and+Effector+Mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mediators+of+Inflamm%22%5BJournal%5D)">Understanding the Mysterious M2 Macrophage through Activation Markers and Effector Mechanisms.</a> Mediators of Inflamm. 2015, 1-16 (2015).</li>
<li>Cho, K. W., Morris, D. L., Lumeng, C. N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24480353">Flow Cytometry Analysis of Adipose Tissue Macrophages.</a> Methods Enzymol. 4 (164), 297-314 (2011).</li>
<li>Kim, Y. -J., Brox, T., Feiden, W., Weickert, J. Technical Note: Flow Cytometry Controls, Instrument Setup, and the Determination of Positivity. Cytometry A. 71 (1), 8-15 (2007).</li>
<li>Tung, J. W., Heydari, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+Flow+Cytometry%3A+A+Practical+Approach%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Lab+Med%22%5BJournal%5D)">Modern Flow Cytometry: A Practical Approach.</a> Clin Lab Med. 27 (3), 453-468 (2007).</li>
<li>Martinez, F. O., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+M1+and+M2+paradigm+of+macrophage+activation%3A+time+for+reassessment%5BTitle%5D)+AND+%22F1000%22%5BJournal%5D)">The M1 and M2 paradigm of macrophage activation: time for reassessment.</a> F1000. 6 (3), 13(2014).</li>
<li>Porcheray, F., Viaud, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+activation+switching%3A+An+asset+for+the+resolution+of+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage activation switching: An asset for the resolution of inflammation.</a> Clin Exp Immunol. 142 (3), 481-489 (2005).</li>
<li>Plouffe, B. D., Murthy, S. K., Lewis, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fundamentals+and+Application+of+Magnetic+Particles+in+Cell+Isolation+and+Enrichment%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">Fundamentals and Application of Magnetic Particles in Cell Isolation and Enrichment.</a> Rep Prog Phys. 1 (78), 1-6 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non hanno alcun conflitto di interessi di divulgare.

Modelli di malattia metabolica indotta da dieta che imitano co-morbidità, quali aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite e diabete di tipo 2 sono ampiamente utilizzati per comprendere meglio i meccanismi molecolari della progressione di malattia. Dipendente dalla digestione della collagenosi viene spesso utilizzata per dissociare tessuti per liberare le cellule dalla matrice extracellulare (ECM)16,27. Enzimi quali la collagenasi perturbare collagene che f...

Modelli murini sono stati ampiamente utilizzati per studiare la dinamica delle malattie umane. Adeguato isolamento delle cellule residenti del tessuto da topi in uno stato malato può fornire una piattaforma per comprendere i contributi molecolari e cellulari alla patogenesi di una malattia1. Un disordine che è di fondamentale importanza è l'obesità. L'incidenza dell'obesità continua ad aumentare in tutto il mondo in parallelo con l'insulino-resistenza e di tipo 2 mellitus del diabete, malattia cardiovascolare e steatosi epatica2,3. Eccessivo consumo di nutrienti è ulteriormente inclinato da riduzione dell'attività fisica innescando segnali alterati provenienti dal tessuto adiposo, che può alterare l'ambiente cellulare degli altri tessuti periferici quali l'aorta e fegato4. Tale perturbazione dell'omeostasi metabolica si traduce in un di infiammazione sistemica cronica di basso grado5.
Classica attivazione dei macrofagi residenti per l'aorta e fegato, nonché il loro reclutamento al tessuto adiposo bianco (WAT) ha dimostrato di non solo avviare il dysregulation di segnali metabolici, ma anche sostenere l'infiammazione6,7. L'eterogeneità fenotipica e funzionale dei macrofagi è fortemente associato con la patogenesi dell'obesità correlate a co-morbidità7. La plasticità dinamica nella polarizzazione del macrofago consente queste cellule ad esporre una gamma di fenotipi attivati che coordinano la progressione e la risoluzione di infiammazione8. Mentre i macrofagi (M1) classicamente attivati sono implicati nella propagazione dell'infiammazione, i macrofagi (M2) in alternativa attivati sono stati associati con risoluzione e tessuto riparazione9,10.
Come il corpo subisce stress metabolico, tessuto adiposo bianco si accumula in modo anomalo. Il tessuto adiposo espanso attira e trattiene le cellule infiammatorie che profondo alterano la normale funzione degli adipociti per promuovere l'insulino-resistenza, iperglicemia e diabete mellito di tipo 2 in ultima analisi, l'insulino-resistenza o iperglicemia11, 12. In parallelo, tessuto adiposo bianco rimodella in risposta a segnali infiammatori rilasciato da infiltrato classicamente attivati (M1) tessuto adiposo macrofagi (ATMs)13,14. Questo organo multi-cellulare esercita una cascata di segnali che deraglia la normale funzione di altri organi del corpo come l'aorta e fegato4.
Il fegato è un concentrato di metabolico che si adatta in risposta a stimoli provenienti da vicine dysregulated WAT15. Epatici macrofagi o cellule di Kupffer, in risposta a cambiamenti metabolici, secernono citochine infiammatorie che trasformano entrambi parenchimatica e fenotipo delle cellule non parenchimali e promuovono il rimodellamento tissutale. Accumulo di lipidi epatici, infiammazione, depositi eccessivi di matrice extracellulare, necrosi e funzione eventuale perdita segue gli insulti infiammatori contribuendo ad ampio spettro di danni al fegato associati con epatopatia steatosica non alcolica 16,17,18.
In parallelo al compromesso WAT e funzione epatica, grandi arterie si accumulano i lipidi all'interno della parete arteriosa come il corpo subisce lo stress metabolico cronico19. Accumulazione del lipido arteriosa innesca la secrezione di chemochine dalle cellule endoteliali attivate e successiva assunzione di monociti20. Una volta reclutate, monociti proliferano, differenziano, ingeriscono lipoproteine e diventano cellule della gomma piuma. Atherogenesis è avviata e sostenuta da attività pro-infiammatoria di reclutati e macrofagi lipido-carichi residente in tessuto. Soccombere ai segnali extracellulari ed intracellulari stress inoltrati in questo microambiente atherogenic, questi macrofagi quindi impegnano in una cascata di segnalazione di apoptotic. Come queste cellule schiumose muoiono, essi contribuiscono loro contenuto lipidico riempito al nucleo necrotico della lesione, che poi conduce alla rottura della placca, infarto miocardico e ictus.
Collettivamente, l'eterogeneità fenotipica del macrofago orchestra in parte l'obesità indotta da cambiamenti infiammatori osservati in tessuti dysregulated come WAT, fegato e dell'aorta8,21. Caratterizzazione di reclutati e macrofagi residenti tessuto potrebbero fornire la comprensione nei potenziali bersagli molecolari che manipolano macrofago fenotipo1. Per caratterizzare in modo efficace i macrofagi dai tessuti infiammati obesità-indotta, una sospensione di singola cellula può essere ottenuta tramite digestione enzimatica. Tali protocolli di dissociazione devono essere efficace nel sufficientemente degradante tessuto connettivo riducendo la morte delle cellule immuni e fornendo resa cellulare ottimale. La miscela di enzimi dipende dal tipo di tessuto e suo strutturale compongono. Tessuti resistenti, come l'aorta richiede più forte attività enzimatica, rispetto al fegato e WAT, per raggiungere la dissociazione dei tessuti. Dalla sospensione unicellulare, macrofagi residenti del tessuto possono essere inequivocabilmente caratterizzati o isolati per ulteriore analisi, a valle quali profiling trascrizionale.
Qui un protocollo di tessuto-specifico è descritto che utilizza la digestione della collagenosi-dipendente del tessuto e citometria a flusso policromatici efficacemente isolare e caratterizzare i macrofagi residenti in tessuto ottenuti da obesità dieta tradizionale ha indotto, aterosclerosi, semplice steatosi e steatoepatite modelli murini. Simultanea di colorazione degli indicatori della superficie delle cellule con anticorpi contro del leucocita-(CD45 e/o CD11b) e del macrofago - antigeni specifici (F4/80) è spesso utilizzato per identificare il macrofago popolazioni22. Fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) sono una strategia potente utilizzata per ordinare queste popolazioni identificate a elevata purezza. La popolazione ordinata quindi possa essere valutata per profili di gene specifico fenotipo mediante analisi molecolare a valle (ad esempio, reazione a catena della polimerasi quantitativa real time)23. Sebbene la citometria a flusso standard e flusso cytometry-base cella ordinamento sono strumenti potenti nel distinguere i macrofagi all'interno di una sospensione cellulare notevolmente eterogenei, i protocolli ex devono essere ottimizzati per garantire successo uscita. In questo studio, protocolli che efficacemente isolare e caratterizzano i macrofagi specifico tessuto vitale sono descritti; ancora più importante, questo studio fornisce approfondimenti cruciali di questioni tecniche che spesso sorgono, così come le strategie proattive e Trouble-Shooting per prevenire e/o risolverli.

<table><tbody><tr><td>26 G x 5/8 pollici Aghi</td><td>BD</td><td>305115</td><td></td></tr><tr><td>23 G x 0,75 pollici ago x 12 pollici Set per la raccolta del sangue BD</td><td></td><td>367297</td><td>Utilizzato per l'incannulamento dell'IVC sottoepatico durante la perfusione epatica</td></tr><tr><td>21 G 1 1/2 in. Aghi</td><td>BD</td><td>305156</td><td></td></tr><tr><td>siringa da 1 mL con fermi in gomma</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 10 mL BD</td><td></td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>Siringa da 1 mL</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>F4/80 PE</td><td>Biolegend</td><td>123110</td><td></td></tr><tr><td>CD11c PE/Cy7</td><td>Biolegend</td><td>117318</td><td></td></tr><tr><td>CD11b PE/Cy5</td><td>eBioscience</td><td>15-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Blocco Fc CD16/32 anti-topo&nbsp;</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Blu Pacifico</td><td>Biolegend</td><td>103126</td><td></td></tr><tr><td>PE Ratto IgG2a</td><td>Biolegend</td><td>400508</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 Criceto armeno IgG</td><td>Biolegend</td><td>400922</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5 Ratto IgG2b</td><td>Biolegend</td><td>400610</td><td></td></tr><tr><td>Ratto blu del Pacifico IgG2c</td><td>Biolegend</td><td>400717</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Eagle Medium modificato (DMEM)&nbsp;</td><td>Cellgro</td><td>15-017-CV</td><td></td></tr><tr><td>1x Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Cellgro</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; filtri per cellule m</td><td>Corning, Inc.</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Provetta per microcentrifuga da 1,7 mL</td><td>Denville</td><td>C2170</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione acquosa di paraformaldeide -16x</td><td>Microscopia elettronica Scienze</td><td>CAS #30525-89-4</td><td></td></tr><tr><td>Forbici per micro dissezione, 3,5 pollici, diritte, 23 mm, affilate&nbsp;</td><td>Stoelting</td><td>52132-10P</td><td>Utilizzato per scopi generali di dissezione</td></tr><tr><td>Micro pinze, 4 pollici, curva completa, 0,8 mm</td><td>Stoelting</td><td>52102-37P&nbsp;</td><td>Utilizzato per scopi di dissezione generale</td></tr><tr><td>Forbici per dissezione a molla &ndash; 3 mm Tagliente&nbsp;</td><td>Fine Science Tool</td><td>15000-10</td><td>Utilizzato per la dissezione dell'aorta Passaggi da 1.3.3.17 a 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Curvato 0,07 mm x 0,04&nbsp; Pinza a punta mm</td><td>Strumento per le scienze fini</td><td>11297-10</td><td>Utilizzato per la dissezione dell'aorta Passaggi da 1.3.3.17 a 1.3.3.28</td></tr><tr><td>Pinze emostatiche (curve)</td><td>Strumento per le scienze fini</td><td>13021-12</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Sale sodico Fischer</td><td>Scientific</td><td>9041-08-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per colture cellulari/Petri da 35 mm</td><td>Fischer Scientific</td><td>12-565-90</td><td></td></tr><tr><td>Piastre per Petri in polistirene (10 cm) con coperchio</td><td>Fischer Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 15 mL (polipropilene)</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Provette da centrifuga coniche da 50 mL&nbsp;( Fischer</td> <td>Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Provette in polistirene a fondo tondo da 5 mL</td><td>Fischer Scientific</td><td>14-959-5</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo (alcool etilico stock denaturato, anidrizzato)</td><td>Millipore</td><td>EX0285-1</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>Rockland</td><td>BSA-50</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo XI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Ialuronidasi Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td></td></tr><tr><td>DNAse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>1310-73-2&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>449709-10G</td><td></td></tr><tr><td>Bicchiere da 500 mL</td><td>Sigma Aldrich</td><td>02-540M</td><td></td></tr><tr><td>Morsetto emostatico da 4 cm</td><td>Stoelting</td><td>52120-40</td><td></td></tr><tr><td>Pinza dentata</td><td>Stoelting</td><td>52104-33P</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; m Filtri monouso</td><td>Systemex</td><td>04-0042-2317</td><td></td></tr><tr><td>Collagenasi Tipo IV</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>17104019</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di Ammonio Potassio (ACK)</td><td>ThermoFischer Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>A1049201</tr><tr><td>Rasoi (0,22 mm (0,009"))</td><td>VWR International</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red Macchia</td><td></td><td></td> viva/morta <td>Macchia rossa di vitalità (in Figura 1A)</td></tr></tbody></table>

isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Isolation, Characterization, and Purification of Macrophages from Tissues Affected by Obesity-related Inflammation

L'obesità favorisce uno stato infiammatorio cronico che è in gran parte mediato dai macrofagi residenti in tessuto così come macrofagi monocito-derivati. L'obesità indotta da dieta (DIO) è un modello importante nello studio del ruolo di eterogeneità dei macrofagi; Tuttavia, gli isolamenti del macrofago adeguata sono difficili da acquisire da tessuti infiammati. In questo protocollo, vengono delineati i passaggi di isolamento e le necessarie linee guida sulla risoluzione dei problemi derivate dai nostri studi per l'ottenimento di una popolazione adatta dei macrofagi residenti in tessuto da topi dopo 18 settimane di grassi (HFD) o alto-grasso/colesterolo ( Intervento di dieta HFHCD). Questo protocollo si concentra su tre hallmark tessuti studiati nell'obesità e aterosclerosi compreso il fegato, tessuto adiposo bianco (WAT) e l'aorta. Evidenziamo l'utilizzo come dualistica di flusso cytometry può raggiungere una nuova dimensione di isolamento e caratterizzazione dei macrofagi residenti in tessuto. Una sezione fondamentale del presente protocollo risolve la complessità sottostante digestioni enzimatiche tessuto-specifici e isolamento del macrofago e successiva anticorpo cellula-superficie che macchia per analisi cytometric di flusso. Questo protocollo consente di risolvere complessità esistente alla base fluorescente-attivata delle cellule ordinano (FACS) e presenta chiarimenti a queste complessità in modo da ottenere la caratterizzazione di vasta gamma da popolazioni cellulari adeguatamente ordinato. Metodi di arricchimento alternativo sono inclusi per l'ordinamento di cellule, quali il fegato denso, consentendo per la gestione di tempo e flessibilità quando si lavora con FACS. In breve, questo protocollo aiuti al ricercatore di valutare l'eterogeneità dei macrofagi da una moltitudine di tessuti infiammati in un dato studio e fornisce penetranti suggerimenti sulla risoluzione dei problemi che hanno avuto successo per la caratterizzazione e isolamento cellulare favorevole delle cellule immuni in DIO-ha mediato l'infiammazione.

Quando si utilizza dell'apolipoproteina E (ApoE KO) C57BL/6 (BL6) topi mantenuti su una dieta di alto colesterolo alto grasso (HCHFD o HCD) per 18 settimane, 1 x 104 - 2 x 104 CD45++ F4/80 macrofagi aortici possono essere isolati, quando i due campioni sono in pool. Fegati sezionati da topi KO per ApoE HFHCD-Federazione, prodotto maggiore di cellule di Kupffer5 ordinato 5 x 10 (che dipende dal tempo di ordinamento disponibile). Quando...

Questo protocollo consente un ricercatore di isolare e caratterizzare residente in tessuto hallmark macrofagi in vari tessuti infiammati estratte dai modelli indotta da dieta di disordini metabolici.

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Obesity promotes a chronic inflammatory state that is largely mediated by tissue-resident macrophages as well as monocyte-derived macrophages. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare ed caratterizzare in modo efficace i macrofagi da tessuti comunemente interessati da infiammazione indotta dalla dieta, come il fegato. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nei campi dell'immunologia e dell'infiammazione riguardo al modo in cui il fenotipo dei macrofagi residenti nei tessuti può determinare l'evoluzione delle malattie infiammatorie croniche. Il vantaggio principale di questo approccio è che la procedura ottimizza i passaggi di isolamento necessari per ottenere sospensioni cellulari singole derivate da tessuti colpiti da infiammazione cronica di basso grado mediata dall'obesità.La procedura sarà dimostrata da Joselyn Allen, una studentessa laureanda del mio laboratorio. Per isolare il fegato, posizionare innanzitutto un topo imbevuto di etanolo in posizione supina su un tavolo da dissezione in polistirolo espanso e fissare le zampe anteriori e posteriori. Successivamente, utilizzare una pinzetta con punta media per afferrare la pelle addominale vicino all'apertura dell'uretra e usare forbici da dissezione affilate per praticare una piccola incisione nella pelle sollevata.Inserire la lama

isolation-characterization-purification-macrophages-from-tissues

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un nuovo metodo per ottenere i macrofagi da colture primarie di cellule di fegato di ratto è descritto. Questo metodo utilizza la proliferazione dei macrofagi nella cultura, seguita da agitazione di palloni cultura e la purificazione di attaccamento selettivo ai piatti di plastica. Questa tecnica fornisce in modo efficiente i macrofagi del fegato, senza attrezzature complesse e competenze.

Un metodo semplice ed efficace per isolare i macrofagi da Mixed colture primarie di cellule del fegato degli adulti

Qui, dettaglio una metodologia per l'isolamento rapido delle cellule dendritiche di topo intestinali (DCS) e macrofagi. Caratterizzazione fenotipica di DC intestinali e macrofagi viene eseguita utilizzando multi-color analisi citometrica mentre magnetica arricchimento tallone seguita dalla selezione cellulare viene utilizzato per produrre le popolazioni di elevata purezza per gli studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di cellule dendritiche ei macrofagi dall&#39;intestino mouse

L'articolo descrive un semplice facilmente...

Indagine di polarizzazione dei macrofagi Utilizzando Bone Marrow macrofagi derivati

Il tessuto adiposo (AT) è un sito di attivazione delle cellule immunitarie intensa e interazione. Quasi tutte le cellule del sistema immunitario sono presenti in AT e per i rapporti sono alterati da obesità. Isolamento adeguato, quantificazione e caratterizzazione di AT popolazioni di cellule immunitarie sono fondamentali per comprendere il loro ruolo nella malattia immunometabolic.

Isolamento di tessuto adiposo cellule immunitarie

Presentiamo un protocollo semplice ed efficiente per la generazione di macrofagi umani. Buffy coats sono trattati con doppia centrifugazione in gradiente di densità e monociti isolati sono poi differenziate a macrofagi in sacchi di coltura cellulare teflonato. Questo massimizza i rendimenti macrofagi e facilita la raccolta di cellule per esperimenti successivi.

Isolamento di monociti umani con un doppio centrifugazione in gradiente e la loro differenziazione a macrofagi in coltura cellulare Borse teflonato

Descriviamo qui un semplice protocollo per isolare i macrofagi peritoneali murini. Questa procedura è seguita dall'estrazione dell'RNA per effettuare l'analisi dell'espressione genica dopo la stimolazione dei recettori Toll-like.

Isolamento di murini peritoneale macrofagi di effettuare analisi di espressione genica Al Toll-like recettori stimolazione

Questo articolo viene descritto un metodo per analizzare il contenuto delle cellule immuni del tessuto adiposo tramite isolamento delle cellule immuni dal tessuto adiposo e l'analisi successiva usando la citometria a flusso.

Caratterizzazione di cellule immunitarie nel tessuto adiposo umano mediante citometria a flusso

Vi presentiamo un protocollo per ottenere le firme di proteomica dei macrofagi umani e da applicare per determinare l'impatto di un ambiente di ossigeno basso sulla polarizzazione del macrofago.

Analisi proteomica di polarizzazione di macrofago umano in un ambiente a basso tenore di ossigeno

Questo protocollo fornisce un metodo efficiente di digestione della collagenasi per l'isolamento di adipociti vitali e cellule di frazione vascolare stromale-SVF dal grasso viscerale umano in un unico processo, compresa la metodologia per ottenere RNA di alta qualità dagli adipociti e la fenotipizzazione dei macrofagi SVF attraverso la colorazione di più marcatori legati alla membrana per l'analisi mediante citometria a flusso.

Isolamento di adipociti vitali e frazione vascolare stromale dal tessuto adiposo viscerale umano adatto per l'analisi dell'RNA e la fenotipizzazione dei macrofagi

Le dimensioni e la fragilità degli adipociti maturi hanno limitato le tecniche e gli strumenti disponibili per il loro studio e isolamento. Qui viene descritto un protocollo per l'isolamento di adipociti murini maturi, che può essere facilmente adattato a diversi depositi adiposi e diete di topi.

Isolamento e coltura di adipociti murini primari da topi magri e obesi

Scopri come isolare e caratterizzare i macrofagi residenti nei tessuti dal fegato infiammato in modelli di obesità indotta dalla dieta. Questo protocollo ottimizza la preparazione di sospensioni cellulari singole per studiare le malattie metaboliche croniche.

Isolamento, caratterizzazione e purificazione dei macrofagi dai tessuti colpiti da infiammazione obesità

Esplora altri video