Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

La flessibilità conformazionale gioca un ruolo fondamentale nella funzione delle proteine e l'obiettivo generale della spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio a ionizzazione ElectroSpray risolta nel tempo è quello di sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano la funzione nelle proteine ordinate e disordinate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale, come la craterizzazione delle conferme di proteine transitorie, che non è un minimo per le classiche tecniche ad alta risoluzione come l'elettrocistografia e la risonanza magnetica. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le reazioni possono essere monitorate su una scala temporale di millisecondi, che è importante per caratterizzare le creste ad anello, i Moltinglobyals e le proteine intrinsecamente disordinate.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia delle malattie neurodegenerative. Poiché spesso comportano il ripiegamento errato o l'aggregazione di regioni proteiche intrinsecamente disordinate. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proteine strutturate settimanalmente, può essere applicato anche ad altri sistemi, come gli enzimi sottoposti a turnover catalitico, o la caratterizzazione di interazioni tra proteine, proteine e proteine, ligan.

Per iniziare questa procedura, laser una lastra attraverso un canale di ingresso per l'introduzione dei reagenti, una camera di prodialisi e un canale di uscita, su un blocco PMM8 standard, utilizzando un incisore laser. Successivamente, tagliare un capillare metallico in acciaio inossidabile calibro 30 in due pezzi da 10 centimetri utilizzando un utensile rotante per il disco da taglio spesso 164 pollici. Utilizzare carta vetrata per levigare l'estremità dei capillari, che può essere facilitata osservandola al microscopio ottico.

Ora, sciogli quei capillari nel blocco PMM8 inciso usando un ferro da stiro. Per costruire un miscelatore cinetico a flusso continuo, risolto nel tempo, inserire un capillare in vetro cilica fuso da 40 centimetri in un capillare metallico in acciaio di 28 gauge di circa 15 centimetri. Quindi, produrre una tacca di due millimetri, utilizzando le impostazioni dell'incisore laser a bassa potenza su un'estremità del capillare interno in vetro e sigillare questa estremità del capillare interno in vetro.

Questo è un passaggio critico che garantisce una miscelazione ortogonale ed efficiente della proteina, che esce attraverso la tacca che un deterriore comune. Lo spazio intercapillare di due millimetri tra la tacca e l'estremità del capillare è la miscela e il volume. Collegare raccordi e manicotti di dimensioni adeguate e incorporare un connettore a T, che verrà utilizzato per fornire il deterium.

Quindi, allineare il capillare interno in vetro con l'estremità del capillare metallico che può essere facilitato dall'osservazione al microscopio ottico. Contrassegna questa posizione come zero millimetri. Collegare questo miscelatore cinetico a un'estremità della miscela T.Quindi collegare un capillare di vetro di silice fusa di 40 centimetri all'estremità opposta del miscelatore cinetico sulla T di miscelazione.Per l'attivazione della pepsina, sospendere 20 milligrammi di pepsina dalla mucosa gassosa di Porsena in un millilitro di tampone di accoppiamento.

Aggiungere 50 milligrammi di velocità agro attivate dal NHS ai protiens risospesi e ruotare delicatamente durante la notte, a quattro gradi Celsius. Il giorno seguente, centrifugare la miscela a mille volte G per due minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina. Quindi aspirare i protiyes non legati.

Successivamente, incubare gli agros in un millilitro di tampone bloccante e ruotare delicatamente a temperatura ambiente per un'ora. Dopo aver raccolto la resina e aspirato il tampone bloccante, incubare gli agguros di pepsina con un millilitro di acido acedico al cinque percento per cinque minuti. Centrifugare la miscela a 1.000 volte G, per due minuti a temperatura ambiente, per raccogliere la resina, quindi aspirare il super natent.

Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti, per un totale di tre lavaggi, conservare le perle in un millilitro di acido acedico a quattro gradi Celsius per un uso a lungo termine. Per assemblare il dispositivo, riempire una camera di protialisi con un impasto di perle di pepsina agguros attivate in acido acedico al cinque percento utilizzando una spatola sterile. Posiziona la piattaforma micro falitica in PMMA tra due blocchi di PMMA vuoti come copertura per sigillare il dispositivo, rivestita con gomma siliconica per creare una tenuta stagna.

Utilizzare piastre di bloccaggio metalliche per sigillare a pressione il dispositivo. Quindi fissare la T di miscelazione, all'ingresso del dispositivo utilizzando raccordi appropriati. Ora scorre il cinque per cento di acido acedico pensato alla linea acida ad una velocità di dieci microlitri al minuto.

Quindi far scorrere 50 millimetri di tampone acido amonia attraverso la linea proteica a una velocità di un microlitro al minuto. Accoppiare il dispositivo all'estremità anteriore di uno spettrometro di massa a tempo di volo quadropo modificato, o Qtof, utilizzando uno stadio isolato regolabile per ottenere condizioni di elettrospruzzo ottimali. Dopo aver impostato le condizioni ESI-MS, acquisire uno spettro di sola pepsina.

Successivamente, introdurre da 50 a 100 micromoli di tau, o proteina fosfo-tau a una velocità di un microlitro al minuto, dove scorreva precedentemente il tampone acitato di aminio da 50 millimetri. Dopo aver lasciato che il sistema si equilibri per almeno 10 minuti, prima dell'acquisizione, acquisire lo spettro della sola proteina. Mentre la proteina Tao, o fosfo tao, scorre, introdurre l'ossido di duterio a una velocità di tre microlitri al minuto, attraverso il connettore a T, e lasciarlo reagire nel miscelatore cinetico.

Per aumentare il tempo di etichettatura, tirare manualmente indietro la posizione del capillare interno in vetro per ottenere tempi di miscelazione da 42 millisecondi a otto secondi, consentendo al sistema di equilibrarsi per almeno 10 secondi tra ogni ritiro. Questa animazione illustra il flusso di lavoro per un esperimento tipico. La proteina esce attraverso la tacca e si mescola con il duterio in arrivo.

Gli idrogeni M8 della spina dorsale vengono scambiati durante il tempo di reazione assegnato, che può essere variato tirando indietro il capillare proteico. La reazione viene quindi spenta e quindi digerita su una piattaforma microfluidica contenente un ago ESI di uscita. Lo spettro risultante contiene proteine digerite.

La percentuale di assorbimento del deuterio viene calcolata per i singoli peptidi e quindi mappata sulla struttura proteica 3D. I profili di digestione del nativo e della fosfo-tau erano simili, producendo una copertura di sequenza del 77,1 e del 71,7 percento, rispettivamente, le distribuzioni isotopiche più adatte e i valori di assorbimento del deuterio associati per quattro peptidi semplici sono mostrati qui. Il grafico cinetico osservato della percentuale di assorbimento del deuterio, rispetto al tempo, per ciascun peptide viene utilizzato per estrarre il tasso sperimentale osservato.

I profili quali casuali calcolati vengono mostrati per il confronto e vengono utilizzati per estrarre il grado intrinseco teorico. Come previsto, non sono stati osservati fattori di protezione nell'intervallo, normalmente associati agli elementi della struttura secondaria, confermando che la tau nativa mostra un debole legame idrogeno interno. Una protezione significativa si osserva ai terminali N e C, nel dominio centrale e nelle regioni pronate dall'aggregazione.

Nella tau iperfosfo-correlata, è stato osservato un aumento generale dell'assorbimento del deuterio attraverso la proteina. Ci sono aumenti significativi ai terminali N e C e nella regione dell'esapeptide due. I fattori del grado di protezione sono colorati come uno schema arcobaleno, come mostrato qui.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in poche ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante utilizzare regioni di grado HPC o superiore per ridurre al minimo i contaminanti in quanto possono interferire con l'analisi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la marcatura covalente, il cross linking chimico, la modellazione computazionale e i docustudi al fine di abbinare strutture proteiche tridimensionali o confermare aree di interazione proteina proteina e proteina legina.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della biologia strutturale, per esplorare proteine e domini intrinsecamente disordinati, più comuni nelle malattie nuerodegenerative. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare la ionizzazione elettrospray risolta nel tempo, lo scambio di idrogeno e deuterio, la spettrometria di massa, per lo studio della struttura e della dinamica delle proteine.