Name: Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine Struttura e dinamica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Scopri la spettrometria di massa con scambio idrogeno-deuterio per studiare la dinamica strutturale delle proteine ordinate e intrinsecamente disordinate. Questo metodo consente di monitorare le reazioni su scala temporale dei millisecondi.

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Ringraziamo il Dr. Markus Zweckstetter per aver fornito il file di coordinate pdb per l'ensemble tau 'nativo' previsto dal suo lavoro NMR, con strumenti di analisi forniti dal Dr. Adnan Sljoka. Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal programma di sovvenzioni ENGAGE del Natural Science and Engineering Research Council of Canada (NSERC).

NOTA: Si prega di consultare tutte le schede di sicurezza pertinenti (MSDS) prima dell&#39;uso. Fumi prodotti da ablazione laser di poli (metilmetacrilato) (PMMA) possono essere tossici. Assicurarsi che l&#39;incisore laser è collegato ad un sistema di ventilazione di lavoro. Utilizzare tutte le pratiche di sicurezza adeguate durante la costruzione del dispositivo microfluidico compreso l&#39;uso di controlli tecnici (cappa, apposito contenitore) e dispositivi di protezione individuale (occhiali, maschera, guanti, camici, pantaloni lunghe, scarpe chiuse). E &#39;estremamente importante utilizzare liquida ad alta prestazione (HPLC) reagenti puri quando possibile, con tutti gli esseri ACS grado o superiore a diminuire contaminanti interferenti durante l&#39;analisi. 1. Preparazione del dispositivo a microfluidi <ol><li> La costruzione del Microfluidic piattaforma PMMA <ol><li> Ottenere un blocco PMMA standard (8.9 x 3.8 x 0.6 cm) e laser ablazione un canale di ingresso per l&#39;introduzione dei reagenti, un proteolisi camera, e un canale di uscita utilizzando un incisore laser 17, 18. NOTA: Etch camera proteolisi in una forma ovale allungata (30 x 5 x 0,05 mm). Il canale di ingresso ed uscita deve estendersi fino alla fine del blocco PMMA ed essere non più grande di 75 micron di larghezza e profondità per ospitare un capillare 30 ga. </li><li> Tagliare a 30 ga inossidabile metallo capillare in due pezzi di circa 10 cm ciascuna con un utensile rotante con un disco di taglio spessa 1/64&quot; . Usa carta vetrata per lisciare le estremità dei capillari (questo può essere facilitato da una visualizzazione sotto microscopio ottico). </li><li> Sciogliere i capillari nella poli acidato (metil metacrilato) blocco utilizzando un saldatore. Il canale di ingresso sarà collegato a pompe a siringa automatizzate, e il canale di uscita sarà utilizzato per accoppiare nella MS. </li></ol></li><li> La costruzione del Mixer Kinetic a flusso continuo tempo risolto <ol><li> Ottenere un fusocapillare di silice vetro (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm e inserirla in un 28 ga inossidabile metallo capillare di circa 15 cm. A seconda del tempo di reazione richiesto, usare un capillare metallico più esterno o uno con un ID più grande. NOTA: Determinazione del &#39;vero&#39; diametro interno del capillare metallo è essenziale per ottenere tempi di reazione accurati. Questo può essere fatto fissando il capillare metallico ad un HPLC, scorre solvente però il capillare, e registrando la contropressione. Una contropressione di calcolo diametro interno può essere fatto, e il vero diametro interno del capillare metallico determinato. Questo può essere calcolato utilizzando il software Molecular Weight Calculator (per Windows versione 6.49). </li><li> Produrre una tacca 2 mm mediante regolazioni dell&#39;incisore laser a bassa potenza su un&#39;estremità del capillare vetro interno e sigillare la fine del capillare vetro interno (figura 2). In alternativa, rendere la tacca usando un capillare di vetro ceramicafresa y o una smerigliatrice rotante con una lama di taglio fine. </li><li> Formazione la capillare di vetro interno con l&#39;estremità del capillare metallico (questo può essere facilitato mediante osservazione al microscopio ottico). </li><li> Collegare questo mixer cinetica ad un&#39;estremità del tee miscelazione (Figura 2). </li><li> Collegare un capillare fusa di vetro di silice (ID: 75 um, OD: 150 pm) di circa 40 cm dalla estremità opposta del miscelatore cinetica sul tee miscelazione. Questo è utilizzato per fornire l&#39;acido (acido acetico al 5%, pH 2,4) per spegnere la reazione. NOTA: reagenti vengono forniti al dispositivo con siringhe a tenuta di gas attraverso politetrafluoroetilene (PTFE) tubo utilizzando pompe di infusione automatizzati. </li></ol></li><li> Attivazione pepsina <ol><li> Pesare 20 mg di pepsina dalla mucosa gastrica suina o sospenderlo in 1 ml di tampone di accoppiamento (fosfato di sodio 0,1 M, NaCl 0,15 M, pH 6,0). </li><li> Pesare 50 mg di N -hydroxysuccinimide (NHS) attivati agarosio, aggiungere alla re-sproteasi uspended e ruotare delicatamente notte a 4 ° C. </li><li> Spin down a 1.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina. </li><li> Aspirare la proteasi non legato. </li><li> Incubare l&#39;agarosio in 1 ml di tampone di bloccaggio (1 M Tris-HCl, pH 6,0) e ruotare delicatamente a temperatura ambiente per 1 h. </li><li> Spin down a 1.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente per raccogliere la resina. </li><li> Aspirare il tampone di bloccaggio. </li><li> Incubare la pepsina-agarosio con acido acetico 1 ml di 5%, pH 2,4 per 5 min. </li><li> Spin down a 1.000 xg per 2 minuti per raccogliere la resina. </li><li> Aspirare il surnatante. </li><li> Ripetere i punti 1.3.8 - 1.3.10 per un totale di tre lavaggi. </li><li> Conservare le perline in 1 ml di acido acetico a 4 ° C per un uso a lungo termine. </li></ol></li><li> Assemblea dispositivo <ol><li> Riempire la camera proteolisi con la sospensione di perline attivate pepsina-agarosio in acido acetico al 5% utilizzando una spatola sterile. </li><li> Posizionare il platfor microfluidica PMMAm tra due blocchi di PMMA bianco come copertura per sigillare il dispositivo, rivestito in gomma di silicone per creare una tenuta ermetica liquido. </li><li> Utilizzare piastre metalliche di fissaggio a pressione a tenuta del dispositivo. NOTA: La pinza è stata personalizzata per adattarsi alla piattaforma microfluidica ed è composto da due piastre di misura 10,1 cm x 7,4 cm x 1,2 cm. </li><li> Flusso di acido acetico 5%, pH 2,4 ad una velocità di 10 ml / min. Flusso 50 mM tampone di acetato di ammonio (pH 6.9) se la linea proteina ad una velocità di 1 ml / min. NOTA: E &#39;estremamente importante che l&#39;acido acetico viene continuamente fluisce attraverso il dispositivo durante l&#39;intera dell&#39;esperimento. Garantire che non vi siano perdite e che il fluido sta uscendo solo dal canale di uscita, che servirà come sorgente ESI. </li><li> Accoppiare il dispositivo alla estremità anteriore di una quadrupolo tempo di volo (Q-TOF) spettrometro di massa modificata utilizzando una fase isolata regolabile per ottenere condizioni ottimali elettrospray. NOTA: un interruttore di bypassviene introdotto in modo da simulare la presenza di una sorgente ESI commerciale. 17 </li></ol></li></ol> 2. ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Scambio risolta nel tempo <ol><li> Acquisizione di pepsina e proteine ​​Solo Spectra NOTA: acquisizione ESI-MS viene effettuata in modalità ioni positivi con una tensione di 4500-5000, 60-V potenziale declustering e 250 V potenziale focalizzazione. Gli spettri vengono acquisiti su una gamma di 350-1,500 m / z con una velocità di scansione di 1 s -1. <ol><li> Acquisire un solo spettro di pepsina. Eventuali picchi che compaiono in questo spettro sono sottratti una volta si aggiunge la proteina. </li><li> Introdurre 50-100 pM tau / proteine fosfo-tau (purificare e preparare come descritto in precedenza 13, 19) ad una velocità di 1 ml / min in cui il tampone di acetato di ammonio 50 mM è stato precedentemente scorre. </li><li> Acquisire una proteina solo spettro. </li></ol></li><li> acquisizione oPunti F Tempo <ol><li> Mentre la proteina / fosfo-tau 100 pM tau fluisce a 1 ml / min, introdurre D 2 O ad una velocità di 3 ml / min attraverso un connettore a T e lasciare reagire nel mixer cinetica. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti prima dell&#39;acquisizione dello spettro. NOTA: Dopo lo scambio, la reazione di marcatura viene raffreddata dal flusso di acido acetico pH acido 2,4 a 10 ml / min e la digestione della proteina marcata si verifica nella camera proteolitica. </li><li> Al fine di aumentare il tempo di etichettatura, manualmente tirare all&#39;indietro la posizione del capillare di vetro interna per ottenere tempi di miscelazione di 42 ms a 8 s. Consenti per il sistema di equilibrare per almeno 10 minuti tra ogni pull-back. </li></ol></li></ol> 3. I dati e l&#39;analisi statistica <ol><li> Identificare Peptidi e calcolando la percentuale di Deuterio Scambio <ol><li> Eseguire MS analisi utilizzando il software mMass, versione 5.5.0 20 </sup&gt;. </li><li> Identificare i peptidi che utilizzano il server di proteomica ExPASy FindPept e confermare collisione indotta dissociazione (CID) quando richiesto 21. NOTA: Qui, il deuterio assorbimento incorporazione è stata misurata utilizzando un software di FORTRAN in-house sviluppato per l&#39;analisi isotopica di distribuzione 22, 23. </li><li> Calcolare la tariffa intrinseche teorici basati sulla sequenza primaria utilizzando lo strumento web SFERA 22, 24. </li><li> Montare i dati utilizzando un&#39;unica regressione non lineare esponenziale e normalizzare utilizzando una grafica e software statistico (ad esempio, SigmaPlot). NOTA: Il rapporto k int / k obs produce l&#39;Protection Factor (PF), una misura semi-quantitativa del grado che una regione particolare è strutturata all&#39;interno dell&#39;insieme conformazionale. </li></ol></li></ol>

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Non abbiamo nulla da rivelare.

Mentre i metodi di biologia strutturali come la cristallografia a raggi X e NMR sono vantaggiosi perché forniscono strutture estremamente dettagliate di proteine, queste immagini sono spesso statica. La caratterizzazione di specie transienti e domini debolmente strutturati continua ad essere sfuggente quando è stato studiato da questi metodi convenzionali. Pertanto, al fine di acquisire conoscenze dinamici su questi tipi di sistemi è importante lavorare su scale temporali rapidi. Abbiamo applicato con successo Trési-HDX...

Negli ultimi decenni, i progressi sono stati fatti significativi nello sviluppo di tecniche analitiche progettato per misurare la struttura della proteina e dinamiche 1, 2, 3, 4. Mentre cristallografia a raggi X rimane lo strumento principale per determinare la struttura proteica, sono necessarie alte concentrazioni di proteine ​​ed è necessaria una vasta ottimizzazione per produrre cristalli di qualità diffrazione. Proteine che sono difficili da cristallizzare, come le proteine associate alla membrana e intrinsecamente disordinati sono classicamente studiate mediante scambio idrogeno-deuterio (HDX) NMR 5. Tuttavia, negli ultimi decenni, l&#39;accoppiamento di ionizzazione elettrospray spettrometria di massa (ESI-MS) per HDX si è rapidamente guadagnato popolarità 6, 7. La spettrometria di massa offre una soluzionea molte delle restrizioni poste dalla cristallografia a raggi X e NMR. In particolare, MS è altamente sensibile (nM a concentrazioni uM richiesto), e non v&#39;è praticamente alcun limite alle dimensioni della proteina. Inoltre, l&#39;elevato duty cycle di analisi MS prevede la possibilità di studiare proteine ​​quanto sottoposti fatturato enzimatica, misfolding, complessazione e altri processi biologicamente rilevanti. Questi processi avvengono molto sul millisecondo in scala seconda volta e richiedono una rapida miscelazione dei reagenti prima dell&#39;analisi. Lo sviluppo di time-resolved ionizzazione elettrospray (Trési) da Wilson e Konermann nel 2003 reazioni permesso di essere monitorato in tempo reale da pseudo-ESI-MS. Loro configurazione incorporato un mixer capillare con un volume di camera di reazione regolazione continua 8. Il dispositivo è costituito da due capillari concentrici, con il capillare interna, chiusa e una tacca tagliata in un lato per consentire la miscelazione all&#39;interno della stretta inter-capillarey spazio dalla tacca all&#39;estremità del capillare interna (tipicamente 2 mm). Quando viene applicato agli esperimenti HDX, il capillare interna porta la proteina di interesse, il capillare esterno porta l&#39;etichettatura D 2 O soluzione, che poi subisce miscelazione con la proteina prima di entrare nella camera di reazione regolabile consentendo etichettatura HDX prima trasferimento diretto in ESI fonte. Brevemente, HDX deduce backbone idrogeni ammidici sottoposti a scambio con atomi di deuterio in soluzione 9, 10. Lo scambio è base-catalizzata a pH fisiologico, con acido-catalisi diventare prevalente a pH inferiore a circa 2,6. Il tasso di cambio si basa su quattro fattori principali: pH, temperatura, accessibilità solvente e legame idrogeno intramolecolare. Mentre i primi due fattori sono mantenute costanti durante tutto l&#39;esperimento, il tasso di cambio, in particolare a posizioni ammidici peptide backbone, è soprattutto dependent sulla struttura proteica 11. Strettamente piegato regioni con ampie reti legame idrogeno stabili in alfa-eliche e beta-sheets porterà fino deuterio a tassi sostanzialmente più lenti rispetto agli anelli e regioni disordinati (e talvolta per nulla) 12. Questo permette l&#39;analisi di proteine globale, dove perturbazioni nella struttura (per es., Su aggregazione o legame al substrato) portano a differenti deuterio assorbimento (Figura 1). Il mixer capillare cinetica può essere incorporato in una piattaforma microfluidica contenente una camera proteolitica per la localizzazione del captazione deuterio. Tale camera proteolitica viene mantenuta a pH basso per spegnere efficacemente la reazione di scambio, e richiede una proteasi acida immobilizzato per digerire le proteine in peptidi localizzate (Figura 2). Come monitorare i backbone al millisecondo a scale di seconda volta è particolarmente importante per laCaratterizzazione delle variazioni conformazionali all&#39;interno difficile caratterizzare regioni loop, globulo fuso e proteine intrinsecamente disordinati (IDP) 13, 14. In alternativa, Trési-HDX può anche essere utilizzato per caratterizzare proteine che attualmente non hanno una struttura atomica risolti attraverso i metodi della cristallografia a raggi X e NMR, utilizzando lo scambio di deuterio accoppiato all&#39;algoritmo COREX (DX-COREX) approccio 15, 16. Questo protocollo dettagliate si applica Trési-HDX per studiare tau, un IDP, sia nella sua forma nativa, così come è stato patogeno hyperphosphorylated. Mentre tau nativo è uno degli sfollati più ben studiati, poco si sa circa la sua controparte amyloidogenic 13.

<table><tbody><tr><td>Plastica professionale</td> <td>in poli(metilmetacrilato) o PMMA</td><td>SACR.250CCP</td><td>8,9 cm x 3,8 cm x 0,6 cm</td></tr><tr><td>Capillare in vetro di silice fusa</td><td>Polymicro Technologies</td><td>106815-0018</td><td>ID: 75 &; m, OD: 150 &micro; m</td></tr><tr><td>Capillari metallici</td><td>McMaster-Carr</td><td>28 ga - 89875K97 30 ga&nbsp; - 89875K99</td><td></td></tr><tr><td>Tubo fluorurato etilene propilene (FEP) IDEX</td><td></td><td>1477 1548</td><td>ID: 0.007", OD: 1/16" ID: 0,020", diametro esterno: 1/16"</td></tr><tr><td>Tagliatubi in polimero standard</td><td>IDEX</td><td>A-327</td><td>per 1/16" e 1/8" Tubo OD</td></tr> Micro <tr><td>Static Mixing Tee</td><td>IDEX</td><td>M-540</td><td>per 1/16" Tubo OD</td></tr><tr><td>o</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>T in acciaio inossidabile, 0,25&nbsp; mm Bore</td><td>Valco Instruments Co., Inc. (VICI)</td><td>ZT1C</td><td>per 1/16" Tubo OD</td></tr><tr><td>PEEK Tee per 1/16" Tubo OD</td><td>IDEX</td><td>P-727</td><td></td></tr><tr><td>10-32 Femmina a femmina Luer</td><td>IDEX</td><td>P-659</td><td></td></tr><tr><td>10-32 PEEK Dado a doppia ala</td><td>IDEX</td><td>F-300</td><td></td></tr><tr><td>Ghiera per 1/16" Tubi OD</td><td>IDEX</td><td>F-142</td><td></td></tr><tr><td>Serie 100 Utensile rotante</td><td>Dremel</td><td>F013010001</td><td></td></tr><tr><td>Dischi da taglio</td><td>Jobmate</td><td></td><td>1/64" di spessore</td></tr><tr><td>Stereomaster Zoom digitale Microscopio</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-411</td><td></td></tr><tr><td>Saldatore</td><td>Mastercraft</td><td>58-6301-2</td><td></td></tr><tr><td>Laser universale</td> <td>VersaLaser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Siringhe</td><td>Hamilton</td><td>81220</td><td>500&nbsp; &micro; Capacità L</td></tr><tr><td>Pompe Siringa</td><td>Harvard Apparato</td><td>70-4501</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NHS-Activated Agarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>26196</td><td></td></tr><tr><td>Pepsina da mucosa gastrica suina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6887-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Ossido di deuterio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-10X0.6ML</td><td></td></tr><tr><td>Acido acetico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Acqua di grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di ammonio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7330-500G</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Software/Online Tools</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDraw X3</td><td>Corel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcolatore</td><td></td> del peso molecolare <td>Versione 6.49</td><td>Strumento MS open source</td></tr><tr><td>mMass</td><td></td><td>Versione 5.5.0</td><td>Strumento MS open source</td></tr><tr><td>ExPASy FindPept</td><td>Istituto svizzero di bioinformatica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SigmaPlot</td><td>Systat Software</td><td>versione 11.0</td><td></td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>Schr&ouml; dinger</td><td>Versione 1.5.0.4</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>QStar Elite Hybrid Q-TOF Mass Spectrometer</td><td>AB SCIEX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio spettrometria di massa per lo studio delle proteine ​​struttura e dinamica

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

proteine ​​intrinsecamente disordinate (IDP) sono stati a lungo una sfida per biologi strutturali a causa della loro mancanza di elementi di struttura secondaria stabili. Idrogeno-Deuterio Exchange (HDX) misurata su scale temporali rapidi è particolarmente adatto per rilevare strutture e reti legame idrogeno che vengono brevemente popolate, permettendo la caratterizzazione dei conformeri transitori in gruppi nativi. Accoppiamento di HDX per spettrometria di massa offre diversi vantaggi, tra cui l&#39;alta sensibilità, basso consumo di campione e sono limiti alla dimensione proteina. Questa tecnica ha avanzato notevolmente negli ultimi decenni, tra cui la possibilità di monitorare i tempi di etichettatura HDX sulla scala temporale millisecondo. Inoltre, incorporando il workflow HDX su una piattaforma microfluidica alloggiante un microreattore proteasi acida, siamo in grado di localizzare le proprietà dinamiche a livello peptide. In questo studio, tempo risolto elettrospray ionizzazione Spettrometria di Massa (Trési-MS) accoppiato a HDX was utilizzato per fornire un quadro dettagliato della struttura residua nella proteina tau, così come i cambiamenti conformazionali indotte su iperfosforilazione.

profili di digestione-tau fosfo nativa e erano simili, ottenendo rispettivamente una copertura sequenza di 77,1 e 71,7%. valori deuterio assorbimento di ciascun peptide è stata determinata inserendo le distribuzioni isotopiche osservati con le distribuzioni teoriche generate utilizzando un software FORTRAN sviluppato in casa. Le migliori distribuzioni di montaggio sono mostrati (Figura 3a) insieme ai valori di assorbimento di deuterio associati. profili cinetici di capta...

flessibilità conformazionale gioca un ruolo critico nella funzione delle proteine. Qui, si descrive l&#39;utilizzo di spettrometria di massa elettrospray ionizzazione tempo risolto accoppiato a scambio idrogeno-deuterio per sondare i rapidi cambiamenti strutturali che guidano funzione di proteine ​​ordinate e disordinate.

Scambio risolta in tempo ionizzazione elettrospray idrogeno-deuterio Spettrometria di Massa per lo studio delle proteine ​​Struttura e dinamica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

La flessibilit&agrave; conformazionale svolge un ruolo fondamentale nella funzione proteica e l'obiettivo generale della Spettrometria di Massa con Scambio Idrogeno-Deuterio in Tempo Reale mediante Ionizzazione a Spruzzo Elettrostatico &egrave; analizzare rapidi cambiamenti strutturali responsabili della funzione in proteine ordinate e disordinate. Questo metodo pu&ograve; contribuire a rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale, come la caratterizzazione di conformazioni proteiche transitorie, che non &egrave; accessibile alle tecniche classiche ad alta risoluzione come la cristallografia a raggi X e la risonanza magnetica nucleare. Il principale vantaggio di questa tecnica &egrave; che le reazioni possono essere monitorate su scala temporale del millisecondo, elemento cruciale per caratterizzare loop, motivi globulari e proteine intrinsecamente disordinate.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia dei disturbi neurodegenerativi, che spesso coinvolgono il malfolding o l'aggregazione di regioni proteiche intrinsecamente disordinate. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proteine con struttura settimanale, può essere applicato anche ad altri sistemi, come enzim

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Proteine ​​conformazione e la dinamica sono la chiave per comprendere il rapporto tra struttura e funzione delle proteine. Scambio idrogeno accoppiata alla spettrometria di massa ad alta risoluzione è un metodo versatile per studiare le dinamiche conformazionali di proteine ​​e caratterizzazione della proteina-ligando e proteina-proteina interazioni, comprese le interfacce di contatto ed effetti allosterici.

Analizzando la dinamica delle proteine ​​che utilizzano l&#39;idrogeno Scambio Spettrometria di Massa

Qui, presentiamo protocolli dettagliati per la spettrometria di massa a scambio di idrogeno/deuterio ammide allo stato solido (ssHDX-MS) e la spettrometria di massa per marcatura fotolitica allo stato solido (ssPL-MS) per proteine in polveri solide. I metodi forniscono informazioni ad alta risoluzione sulla conformazione delle proteine e sulle interazioni nello stato solido amorfo, che possono essere utili nella progettazione della formulazione.

Mass spettrometrica Approcci alla struttura studio e interazioni proteina in liofilizzati Polveri

L'architettura dei complessi della proteina è essenziale per la loro funzione. Combinando varie tecniche di spettrometrihe di massa ha dimostrato potente per studiare il loro assemblaggio. Forniamo i protocolli per reticolazione chimica e spettrometria di massa nativa e mostrare come queste tecniche complementari consentono a delucidare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina.

Che unisce la reticolazione chimica e spettrometria di massa dei complessi della proteina intatta per studiare l'architettura delle assemblee multi-unità secondaria della proteina

Spettrometria di massa (MS) è emersa come un importante strumento per lo studio della struttura e dinamica di assembly macromolecolari. Qui, possiamo integrare approcci basati su MS per interrogare la formazione dei complessi della proteina e grippaggio del ligand.

Analisi di architetture di proteine e complessi proteina-ligando mediante spettrometria di massa strutturale integrativa

Le sintetasi lanthipeptide catalizzano reazioni multistep durante la biosintesi dei prodotti naturali peptidici. Qui descriviamo un flusso di lavoro continuo, dal basso verso l'alto, di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) che può essere utilizzato per studiare la dinamica conformazionale delle sintetasi lantaipeptide, così come altri enzimi simili coinvolti nella biosintesi del prodotto naturale peptidico.

Una piattaforma di spettrometria di massa a scambio idrogeno-deuterio (HDX-MS) per lo studio degli enzimi biosintetici peptidici

Qui viene presentato un protocollo per un approccio di scambio idrogeno/deuterio (HDX) basato sull'elettroforesi capillare accoppiato con la spettrometria di massa top-down. Questo approccio caratterizza la differenza nelle strutture di ordine superiore tra diverse specie proteiche, comprese le proteine in diversi stati e diverse proteoforme, conducendo simultaneamente HDX differenziale e separazione elettroforetica.

Scambio idrogeno/deuterio basato sull'elettroforesi capillare per la caratterizzazione conformazionale di proteine con spettrometria di massa top-down

La spettroscopia di retrodiffusione neutronica offre un accesso non distruttivo e privo di etichette alla dinamica ps-ns delle proteine e della loro acqua di idratazione. Il flusso di lavoro è presentato con due studi sulle proteine amiloidi: sulla dinamica tempo-risolta del lisozima durante l'aggregazione e sulla dinamica dell'acqua di idratazione della tau sulla formazione delle fibre.

Spettroscopia neutronica ad alta risoluzione per studiare la dinamica picosecondi-nanosecondi delle proteine e dell'acqua di idratazione

L'insieme strutturale dell'alfa-sinucleina monomerica influenza la sua funzione fisiologica e le proprietà fisico-chimiche. Il presente protocollo descrive come eseguire la spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo e le successive analisi dei dati per determinare le informazioni conformazionali sul monomero di questa proteina intrinsecamente disordinata in condizioni fisiologiche.

Spettrometria di massa a scambio idrogeno/deuterio al millisecondo per lo studio della dinamica strutturale dell'alfa-sinucleina in condizioni fisiologiche

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un'etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Scopri la spettrometria di massa con scambio idrogeno-deuterio per studiare la dinamica strutturale delle proteine ordinate e intrinsecamente disordinate. Questo metodo consente di monitorare le reazioni su scala temporale dei millisecondi.

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