Quantificazione delle endosomi e dei motivi di lisosomi nei neuroni coltivati utilizzando sonde fluorescenti
22 maggio 2017
L'indagine sul traffico di membrana è fondamentale per la comprensione delle funzioni neuronali. Qui introduciamo un metodo per quantificare la motilità della vescicola nei neuroni. Questo è un metodo conveniente che può essere adattato alla quantificazione del traffico di membrana nel sistema nervoso.
L'obiettivo generale di questa analisi di imaging è osservare la motilità delle vescicole nei neuroni e quantificarla facilmente. Questo approccio consente di analizzare il traffico di membrana nei neuroni in modo semplice ed efficace in termini di tempo. Per iniziare questa procedura, trasferire l'utero in una nuova capsula di Petri con etanolo al 70%.
Quindi, trasferisci l'utero in un'altra piastra di Petri con HBSS. Quindi rimuovere i feti dall'utero utilizzando una pinza da dissezione sterilizzata e forbici chirurgiche. Dopodiché, mettili in una nuova capsula di Petri con HBSS.
Sotto uno stereomicroscopio rimuovere la pelle e il cranio ed estrarre il cervello usando la pinza da dissezione sterilizzata. Quindi, trasferiscili in un'altra capsula di Petri con HBSS. Rimuovere le meningi utilizzando una pinza da dissezione sterilizzata.
Quindi taglia le regioni extra. Quindi, trasferisci le cortecce in una nuova piastra di Petri con HBSS. Raccogli tutte le cortecce usando un contagocce usa e getta o una pipetta da 25 millilitri e mettile in una provetta da 15 millilitri.
Successivamente, rimuovere l'HBSS mediante pipettaggio. Quindi, aggiungere tre millilitri di soluzione di enzima corticale cerebrale al tubo contenente le cortecce. Metti la provetta a bagnomaria e incubala a 37 gradi Celsius per cinque minuti.
Dopodiché, aggiungere altri tre millilitri di soluzione di enzima corticale cerebrale nella provetta contenente le cortecce e incubarle a 37 gradi Celsius in un bagno d'acqua per altri cinque minuti. Dopo cinque minuti rimuovere la soluzione di enzima corticale cerebrale e aggiungere cinque millilitri di DMEM contenente il 10% di siero fetale bovino. Dissociare le cortecce pipettando delicatamente su e giù utilizzando una pipetta da cinque millilitri con puntale sterile P1000.
Quindi pipettare nuovamente le cortecce utilizzando una pipetta da cinque millilitri con punta P200. Metti un filtro cellulare in nylon da 40 micrometri su un tubo da 50 millilitri e filtra la sospensione per rimuovere i detriti. Successivamente, centrifugare la sospensione a 420 volte g per cinque minuti a temperatura ambiente, quindi rimuovere il mezzo DMEM.
Successivamente, aggiungere cinque millilitri di terreno di coltura corticale cerebrale e risospendere delicatamente il pellet cellulare. Quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro e regolare la concentrazione cellulare utilizzando il terreno di coltura corticale cerebrale. Successivamente, piastra tre volte 10 ai sei neuroni corticali in due millilitri di sospensione cellulare per ogni piatto di vetro codificato da 35 millilitri.
In questa procedura, mescolare quattro microgrammi di plasmide con 200 microlitri di terreno privo di siero. In una provetta separata, diluire otto microlitri di reagente di trasfezione in 200 microlitri di terreno privo di siero. Quindi, incubare la soluzione per cinque minuti a temperatura ambiente.
Dopo cinque minuti, mescolare la soluzione plasmidica e la soluzione reattiva di trasfezione e incubare la miscela per 20 minuti a temperatura ambiente. Successivamente, aggiungere il composto ai piatti con fondo in vetro codificato. Incubare i neuroni a 37 gradi Celsius per 30 minuti.
Successivamente, sostituire il terreno con due millilitri di terreno di coltura corticale cerebrale e incubare i neuroni a 37 gradi Celsius per uno o due giorni. Per l'imaging, utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di una telecamera CCD con obiettivi 40X. Mantieni la temperatura a 37 gradi Celsius utilizzando un sistema di incubazione.
Acquisisci immagini neuronali a un fotogramma ogni cinque secondi per un periodo di 100 secondi controllato dal software di acquisizione delle immagini. Per analizzare le immagini, aprire tutte le immagini sequenziali nel software ImageJ con tracciamento manuale. Per combinare le immagini sequenziali, scegliere Immagine, quindi Pile, quindi Immagini da impilare e quindi fare clic su OK. Successivamente, scegli Plugin, quindi Tracciamento manuale.
Verrà visualizzata una finestra di tracciamento. Fare clic sulla casella di controllo Mostra parametri e definire i parametri di tracciamento nella sezione Parametri. Quindi fare clic su Aggiungi traccia per iniziare una nuova traccia.
Dopo aver determinato le vescicole di interesse, fare clic sul centro dei segnali nelle immagini sequenziali per registrare le coordinate xy. Ripetere questa procedura per raccogliere le coordinate xy delle vescicole da tutte le immagini sequenziali, ogni immagine avanza automaticamente all'immagine successiva dopo aver selezionato il punto di riferimento. Questa immagine mostra la motilità delle vescicole contenenti LAMP-EGFP nei dendriti dei neuroni corticali di topo dopo due giorni di trasfezione, iniziata a quattro DIV.
Il riquadro mostra l'immagine time-lapse delle vescicole positive LAMP-EGFP. La punta della freccia rossa indica una vescicola in movimento e la punta della freccia blu indica una vescicola a riposo. Le punte delle frecce arancioni indicano segnali fluorescenti più alti.
Ecco la posizione dell'asse X dipendente dal tempo delle vescicole positive LAMP-EGFP. La vescicola nel cerchio rosso, etichettata b, si muove e la vescicola nel cerchio blu, etichettata a, riposa. Questo grafico a barre indica la distanza totale del movimento LAMP-EGFP.
E questo grafico a barre indica la distanza media di motilità di una LAMP-EGFP contenente vescicole.
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Panoramica
Questo studio presenta un metodo per quantificare la motilità delle vescicole nei neuroni, fondamentale per comprendere le funzioni neuronali. L'approccio consente un'analisi semplice del traffico di membrane nel sistema nervoso.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Biologia cellulare
- Trasporto di membrane
Sfondo
- Il traffico delle membrane è fondamentale per la funzione neuronale.
- La motilità delle vescicole svolge un ruolo chiave in questo processo.
- Comprendere questi meccanismi può fornire informazioni sulla salute neuronale.
- I metodi attuali per la quantificazione del movimento delle vescicole sono spesso complessi.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo pratico per quantificare la motilità delle vescicole.
- Facilitare l'analisi del traffico delle membrane nei neuroni.
- Migliorare la comprensione delle funzioni neuronali attraverso metodologie avanzate.
Metodi Utilizzati
- Analisi dell'immagine per osservare la motilità delle vescicole.
- Trasferimento dei campioni biologici nei mezzi appropriati per l'analisi.
- Utilizzo di strumenti sterilizzati per la manipolazione dei campioni.
- Procedure rapide per la quantificazione.
Risultati principali
- Il metodo consente una facile quantificazione della motilità delle vescicole.
- Fornisce un approccio semplice per analizzare il traffico delle membrane.
- I risultati possono contribuire a una migliore comprensione delle funzioni neuronali.
- Applicazioni potenziali in varie aree della ricerca in neuroscienze.
Conclusioni
- Questo metodo semplifica lo studio della motilità delle vescicole nei neuroni.
- Può essere adattato per diverse applicazioni nelle neuroscienze.
- Ulteriori ricerche possono basarsi su questo approccio per esplorare la salute neuronale.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione della motilità delle vescicole fornisce informazioni fondamentali sui meccanismi del traffico di membrana che influenzano la salute neuronale e i fenotipi delle malattie. Questo metodo consente una validazione precoce del bersaglio, collegando la dinamica subcellulare a risultati funzionali nei modelli di neurodegenerazione. L'approccio supporta una valutazione predittiva affidabile nella selezione preclinica, fornendo letture quantitative e riproducibili del trasporto vescicolare in sistemi neuronali rilevanti per la malattia.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche misurando la motilità di endosomi e lisosomi come indicatori funzionali della salute neuronale.
- Valore operativo: Supporta la riduzione del rischio biologico mediante la quantificazione standardizzata del movimento delle vescicole in modelli cellulari rilevanti per la malattia.
- Valore predittivo: Facilita la selezione del portafoglio correlando i difetti di motilità con percorsi meccanicistici nei disturbi neuronali.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce misurazioni quantitative della distanza e della velocità di movimento per lo screening di composti in neuriti e soma.
- Valore operativo: Garantisce la riproducibilità del saggio mediante tracciamento basato su ImageJ con parametri definiti e acquisizione temporizzata di immagini.
- Scalabilità: Compatibile con diversi tipi cellulari, inclusi fibroblasti e cellule endoteliali, consentendo un riutilizzo su piattaforme differenti.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Si allinea alle strategie traslazionali di biomarcatori collegando la dinamica delle vescicole alla sopravvivenza neuronale e alla funzione sinaptica.
- Valore operativo: Favorisce la continuità dalla scoperta alla validazione preclinica attraverso letture di motilità costanti in diversi modelli.
- Controllo del rischio: Guida decisioni di avanzamento proporzionate al rischio identificando composti in grado di correggere i difetti di trasporto.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nei flussi di lavoro della fase iniziale di scoperta fornendo dati quantitativi sulla motilità che informano sull'interazione con il bersaglio e sulla modulazione del percorso nei sistemi neuronali.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi quantificando il movimento delle vescicole come lettura funzionale dell'integrità del traffico di membrana.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso protocolli standardizzati di acquisizione e tracciamento per l'analisi delle vescicole dipendente dal tempo.
- Analisi: Genera parametri di motilità, come la distanza percorsa e il movimento medio, che consentono analisi comparative tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica mettendo in relazione i difetti del trasporto vescicolare con i meccanismi delle malattie neurodegenerative.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma di imaging riutilizzabile, applicabile a diverse linee cellulari neuronali e non neuronali.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva riducendo l'ambiguità nei collegamenti meccanicistici tra difetti del traffico e fenotipi neuronali.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità grazie ad analisi basate su plug-in e parametri di tracciamento definiti.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione fornendo dati oggettivi e quantitativi sull'interazione con il bersaglio nei percorsi di motilità delle vescicole.
- Impatto sul portafoglio: Consente una priorizzazione adeguata al rischio identificando composti che modulano la dinamica endosoma-lisosoma nei modelli di malattia.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella coltura di neuroni, nella trasfezione e nella microscopia a fluorescenza per un'etichettatura e un'acquisizione accurate delle vescicole.
- Richiede l'utilizzo della piattaforma ImageJ con il plugin Manual Tracking e capacità di elaborazione sequenziale delle immagini.
- Necessita della standardizzazione dell'efficienza di trasfezione, degli intervalli di acquisizione e dei parametri di tracciamento tra diversi esperimenti.
- L'adattamento a diverse linee cellulari potrebbe richiedere un'ottimizzazione dell'espressione dei marcatori e delle misurazioni della motilità di base.
- I limiti pratici includono la dipendenza dall'efficienza di trasfezione e il potenziale effetto fototossico durante acquisizioni prolungate in time-lapse.
