Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

L'obiettivo generale di questa strategia sperimentale è quello di risolvere i distinti assemblaggi funzionali in cui una proteina può essere coinvolta attraverso l'elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu, il frazionamento di complessi proteici purificati per affinità e il profilo di correlazione della spettrometria di massa. Questo metodo può aiutare ad aggiungere informazioni organizzative alle liste di proteine generate da esperimenti di spettrometria massiva di purificazione per affinità. I principali vantaggi di questa procedura sono che è semplice da eseguire, ha una buona risoluzione e richiede poco più lavoro rispetto ai CMSM su gel convenzionali.

Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione di complessi proteici da 200 a 500 milioni di cellule che esprimono livelli endogeni di una proteina marcata con FLAG. Dopo aver scongelato il pellet cellulare, come descritto nel protocollo di testo, aggiungere cinque millilitri di tampone di lisi ghiacciato contenente DTT e inibitori della proteasi alla sospensione cellulare e agitare per mescolare. Incubare la sospensione con ghiaccio per 10 minuti.

Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore a freddo. Limare le cellule con 20-30 colpi, utilizzando il pestello stretto fino a quando non c'è viscosità evidente, quindi trasferire l'omogeneizzato in provette da microcentrifuga fredde. Dopo aver centrifugato le provette, trasferire il lisato chiarificato in una provetta fredda pulita, lasciando circa 50 microlitri di lisato.

Conservare un'aliquota di 35 microlitri di lisato per misurare la concentrazione proteica e monitorare la purificazione. Quindi, rimuovere il tampone dalle perline precedentemente preparate. Risospendere le perle con un millilitro di lisato, quindi mescolare con il resto del lisato.

Incubare la miscela su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per una o due ore. Raccogli le perline sul lato del tubo con un magnete. Raccogli un'aliquota di 30 microlitri di surnatante e scarta il resto.

Risospendere le microsfere in 0,5 millilitri di tampone IPP150 pipettando da quattro a sei volte. Quindi, trasferire la sospensione in un tubo freddo da 1,5 millilitri. Successivamente, lavare le perle tre volte con 0,5 millilitri di tampone nativo di eluizione FLAG.

Con l'ultimo lavaggio, trasferire le perline in un nuovo tubo freddo. Rimuovere accuratamente il tampone. Risospendere le perle in 100 microlitri di peptide 3X5 da 200 microgrammi per millilitro in tampone di eluizione nativo.

Quindi, incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti con una leggera rotazione. Raccogli le perline con il magnete e trasferisci il surnatante in un nuovo tubo freddo. Ripetere questo passaggio due volte prima di estrarre tutti gli eluati.

Concentrare l'eluato fino a 25 microlitri in un'unità filtrante centrifuga mediante centrifugazione a 10.000 volte G a quattro gradi Celsius. Preparare il campione aggiungendo all'eluato concentrato da 25 microlitri un tampone nativo di caricamento del campione 4X e un additivo per campioni 0,5% G-250. Caricare il campione e i marcatori di peso molecolare nativi, lasciando un pozzetto vuoto tra di loro.

Quindi, caricare da 10 a 20 microlitri di tampone di caricamento del campione nativo 1X in tutti i pozzetti vuoti. Riempire accuratamente la camera catodica con 200 millilitri di tampone catodico blu scuro PAGE nativo 1X, in modo da non disturbare i campioni. Riempire la camera dell'anodo con 550 millilitri di tampone anodico nativo 1X PAGE.

Far funzionare il gel a 150 volt per 30 minuti. Dopo aver interrotto la seduta, rimuovere il tampone catodico blu scuro con una pipetta sierologica e sostituirlo con 1X tampone catodico azzurro. Dopo aver continuato la corsa per 60 minuti, aprire la cassetta del gel e gettare una delle piastre della cassetta.

Il gel rimane attaccato all'altra piastra della cassetta. Mettere il gel in un vassoio contenente una soluzione fissativa sufficiente a coprirlo e incubare per 30 minuti agitando delicatamente. Quindi, rimuovere la soluzione fissativa e sostituirla con acqua prima di scansionare il gel.

Per prepararsi alla spettrometria di massa, posizionare prima una piastra a fondo conico da 96 pozzetti sopra un'altra piastra da 96 pozzetti per raccogliere i rifiuti. Forare il fondo dei pozzetti della piastra a 96 pozzetti a fondo conico con un ago calibro 21. Quindi, aggiungere 200 microlitri di acetonitrile al 50%, acido formico allo 0,25% ai pozzetti della piastra forata.

Incubare la pila di piastre in uno shaker per 10 minuti. Quindi, centrifugare la piastra a 500 volte G per un minuto, in modo che il liquido scorra attraverso i fori nella piastra di raccolta dei rifiuti. Dopo aver ripetuto due volte le fasi di lavaggio, riempire i pozzetti della piastra forata a 96 pozzetti con 150 microlitri di bicarbonato di ammonio da 50 millimolari.

Quindi, posiziona il gel su una superficie pulita. Dividere la corsia contenente il campione in 48 sezioni identiche. Taglia ogni fetta in due o tre pezzi più piccoli, tranne le ultime cinque fette nella parte superiore del gel.

Posizionare ogni fetta in sequenza in un pozzetto della piastra a 96 pozzetti lavata con l'estremità forata. Aggiungere 50 microlitri di acetonitrile in ogni pozzetto e incubare la piastra agitando per 30-60 minuti. Dopo aver rimosso il liquido mediante centrifugazione, aggiungere 200 microlitri di TSEB da due millimetri e 50 millimolari di bicarbonato di ammonio in ogni pozzetto.

Incubare la piastra agitando per 30 minuti a temperatura ambiente prima di rimuovere il liquido mediante centrifugazione come prima. Disidratare i pezzi di gel aggiungendo 200 microlitri di acetonitrile puro e incubare agitando a temperatura ambiente per 20 minuti fino a quando i pezzi di gel non saranno bianchi e opachi. Dopo aver rimosso l'acetonitrile, aggiungere 150 microlitri di tripsina in bicarbonato di ammonio freddo in ogni pozzetto.

Incubare la piastra agitando a 37 gradi Celsius per due ore. Quindi, posizionare una piastra inferiore conica pulita sotto la piastra contenente il gel, assicurandosi del corretto orientamento delle piastre. Quindi, raccogliere il liquido contenente i peptidi mediante centrifugazione a 200 volte G per un minuto.

Posizionare la piastra contenente i peptidi in un evaporatore centrifugo e far evaporare il liquido mentre si esegue il passaggio successivo. Aggiungere 150 microlitri di acetonitrile al 50%, acido formico allo 0,25% ai pezzi di gel. Incubare agitando a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

Raccogliere il liquido nella piastra parzialmente asciutta mediante centrifugazione a 200 volte G per un minuto. Continuare a far evaporare la piastra contenente i peptidi mentre si esegue il passaggio successivo. Trasferire le soluzioni peptidiche nella piastra di filtrazione centrifuga lavata.

Posizionare una piastra inferiore conica pulita sotto di essa per raccogliere i peptidi e centrifugare la pila di piastre come prima. Far evaporare il liquido nella piastra di fondo conica fino a quando i pozzetti non sono completamente asciutti. Una volta asciutta, la piastra può essere coperta con un coperchio in silicone e conservata a meno 20 gradi Celsius fino all'esecuzione della spettrometria di massa e dell'analisi dei dati come descritto nel protocollo di testo.

I risultati rappresentativi del clustering gerarchico dei profili di migrazione blu nativi di PAGE di Mta2 e delle proteine copurificanti sono mostrati qui come un dendrogramma e una mappa di calore che rappresenta le intensità proteiche. Il profilo di migrazione di Mta2 mostra due picchi indicativi di due complessi distinti. Alcune subunità NuRD mostrano un modello simile con la massima abbondanza nell'assemblaggio a basso peso molecolare.

Al contrario, altre subunità NuRD sono più abbondanti nell'assemblaggio di NuRD a peso molecolare più elevato. D'altra parte, l'interagente Mta2, Cdk2ap1, è presente solo nell'assemblaggio NuRD a peso molecolare più elevato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni e mezzo.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di tenere tutti i campioni e i reagenti sul ghiaccio per evitare la dissociazione dei complessi proteici. Questa procedura può essere applicata a qualsiasi proteina di interesse, a condizione che possa essere osservata dal mezzo di affinità mediante eluizione competitiva in condizioni native. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la co-immunoprecipitazione inversa o sequenziale per convalidare i sottocomplessi identificati.