Name: Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine correlazione Profiling (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Scopri la purificazione per affinità di complessi proteici con Blue Native PAGE e spettrometria di massa. Questo metodo semplice offre alta risoluzione per studiare interazioni proteiche in grandi popolazioni cellulari.

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Questo lavoro è stato finanziato dal Wellcome Trust (WT098051).

<ol><li>Goudreault, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PP2A+phosphatase+high+density+interaction+network+identifies+a+novel+striatin-interacting+phosphatase+and+kinase+complex+linked+to+the+cerebral+cavernous+malformation+3+%28CCM3%29+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A PP2A phosphatase high density interaction network identifies a novel striatin-interacting phosphatase and kinase complex linked to the cerebral cavernous malformation 3 (CCM3) protein.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (1), 157-171 (2009).</li>
<li>Leitner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+native+protein+structures+by+chemical+cross-linking%2C+mass+spectrometry%2C+and+bioinformatics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Probing native protein structures by chemical cross-linking, mass spectrometry, and bioinformatics.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (8), 1634-1649 (2010).</li>
<li>Rappsilber, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+beginning+of+a+beautiful+friendship%3A+cross-linking%2Fmass+spectrometry+and+modelling+of+proteins+and+multi-protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">The beginning of a beautiful friendship: cross-linking/mass spectrometry and modelling of proteins and multi-protein complexes.</a> J Struct Biol. 173 (3), 530-540 (2011).</li>
<li>Sinz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking+and+mass+spectrometry+to+map+three-dimensional+protein+structures+and+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mass+Spectrom+Rev%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking and mass spectrometry to map three-dimensional protein structures and protein-protein interactions.</a> Mass Spectrom Rev. 25 (4), 663-682 (2006).</li>
<li>Walzthoeni, T., Leitner, A., Stengel, F., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry+supported+determination+of+protein+complex+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry supported determination of protein complex structure.</a> Curr Opin Struct Biol. 23 (2), 252-260 (2013).</li>
<li>Kaake, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+in+vivo+cross-linking+mass+spectrometry+platform+to+define+protein-protein+interactions+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A new in vivo cross-linking mass spectrometry platform to define protein-protein interactions in living cells.</a> Mol Cell Proteomics. 13 (12), 3533-3543 (2014).</li>
<li>Kao, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+cross-linking+strategy+for+fast+and+accurate+identification+of+cross-linked+peptides+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development of a novel cross-linking strategy for fast and accurate identification of cross-linked peptides of protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 10 (1), (2011).</li>
<li>Hughes, M. A., Langlais, C., Cain, K., MacFarlane, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+characterisation+and+reconstitution+of+cell+death+signalling+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Isolation, characterisation and reconstitution of cell death signalling complexes.</a> Methods. 61 (2), 98-104 (2013).</li>
<li>Lim, S., Zou, Y., Friedman, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcriptional+activator+Mirk%2FDyrk1B+is+sequestered+by+p38alpha%2Fbeta+MAP+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The transcriptional activator Mirk/Dyrk1B is sequestered by p38alpha/beta MAP kinase.</a> J Biol Chem. 277 (51), 49438-49445 (2002).</li>
<li>Havugimana, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+census+of+human+soluble+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A census of human soluble protein complexes.</a> Cell. 150 (5), 1068-1081 (2012).</li>
<li>Kirkwood, K. J., Ahmad, Y., Larance, M., Lamond, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+native+protein+complexes+and+protein+isoform+variation+using+size-fractionation-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of native protein complexes and protein isoform variation using size-fractionation-based quantitative proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 12 (12), 3851-3873 (2013).</li>
<li>Kristensen, A. R., Gsponer, J., Foster, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+approach+for+measuring+temporal+changes+in+the+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A high-throughput approach for measuring temporal changes in the interactome.</a> Nat Methods. 9 (9), 907-909 (2012).</li>
<li>Liu, F., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrogating+the+architecture+of+protein+assemblies+and+protein+interaction+networks+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Interrogating the architecture of protein assemblies and protein interaction networks by cross-linking mass spectrometry.</a> Curr Opin Struct Biol. 35, 100-108 (2015).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Heide, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complexome+profiling+identifies+TMEM126B+as+a+component+of+the+mitochondrial+complex+I+assembly+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Complexome profiling identifies TMEM126B as a component of the mitochondrial complex I assembly complex.</a> Cell Metab. 16 (4), 538-549 (2012).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+953+human+proteins+from+a+mitochondrial+HEK293+fraction+by+complexome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Analysis of 953 human proteins from a mitochondrial HEK293 fraction by complexome profiling.</a> PLoS One. 8 (7), 68340(2013).</li>
<li>Wessels, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS+as+an+alternative+for+SDS-PAGE+in+blue+native+analysis+of+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS as an alternative for SDS-PAGE in blue native analysis of protein complexes.</a> Proteomics. 9 (17), 4221-4228 (2009).</li>
<li>Remmerie, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unraveling+tobacco+BY-2+protein+complexes+with+BN+PAGE%2FLC-MS%2FMS+and+clustering+methods%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Unraveling tobacco BY-2 protein complexes with BN PAGE/LC-MS/MS and clustering methods.</a> J Proteomics. 74 (8), 1201-1217 (2011).</li>
<li>Sessler, N., Krug, K., Nordheim, A., Mordmuller, B., Macek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+the+Plasmodium+falciparum+proteasome+using+Blue+Native+PAGE+and+label-free+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Amino+Acids%22%5BJournal%5D)">Analysis of the Plasmodium falciparum proteasome using Blue Native PAGE and label-free quantitative mass spectrometry.</a> Amino Acids. 43 (3), 1119-1129 (2012).</li>
<li>Bode, D., Yu, L., Tate, P., Pardo, M., Choudhary, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Two+Distinct+Nucleosome+Remodeling+and+Deacetylase+%28NuRD%29+Complex+Assemblies+in+Embryonic+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Characterization of Two Distinct Nucleosome Remodeling and Deacetylase (NuRD) Complex Assemblies in Embryonic Stem Cells.</a> Mol Cell Proteomics. 15 (3), 878-891 (2016).</li>
<li>Cox, J., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MaxQuant+enables+high+peptide+identification+rates%2C+individualized+p.p.b.-range+mass+accuracies+and+proteome-wide+protein+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p.p.b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.</a> Nat Biotechnol. 26 (12), 1367-1372 (2008).</li>
<li>Cox, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+the+MaxQuant+computational+platform+for+SILAC-based+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">A practical guide to the MaxQuant computational platform for SILAC-based quantitative proteomics.</a> Nat Protoc. 4 (5), 698-705 (2009).</li>
<li>Kim, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulatory+factor+recruits+the+nucleosome+remodeling+complex+to+wingless+integrated+%28Wnt%29+signaling+gene+promoters+in+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A novel regulatory factor recruits the nucleosome remodeling complex to wingless integrated (Wnt) signaling gene promoters in mouse embryonic stem cells.</a> J Biol Chem. 287 (49), 41103-41117 (2012).</li>
<li>Lauberth, S. M., Rauchman, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+conserved+12-amino+acid+motif+in+Sall1+recruits+the+nucleosome+remodeling+and+deacetylase+corepressor+complex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">A conserved 12-amino acid motif in Sall1 recruits the nucleosome remodeling and deacetylase corepressor complex.</a> J Biol Chem. 281 (33), 23922-23931 (2006).</li>
<li>Miller, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sall4+controls+differentiation+of+pluripotent+cells+independently+of+the+Nucleosome+Remodelling+and+Deacetylation+%28NuRD%29+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Sall4 controls differentiation of pluripotent cells independently of the Nucleosome Remodelling and Deacetylation (NuRD) complex.</a> Development. 143 (17), 3074-3084 (2016).</li>
<li>Dharmarajan, V., Lee, J. H., Patel, A., Skalnik, D. G., Cosgrove, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+WDR5+interaction+%28Win%29+motif+recognition+in+human+SET1+family+histone+methyltransferases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Structural basis for WDR5 interaction (Win) motif recognition in human SET1 family histone methyltransferases.</a> J Biol Chem. 287 (33), 27275-27289 (2012).</li>
<li>Schwanhausser, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+quantification+of+mammalian+gene+expression+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global quantification of mammalian gene expression control.</a> Nature. 473 (7347), 337-342 (2011).</li>
<li>Smits, A. H., Jansen, P. W., Poser, I., Hyman, A. A., Vermeulen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+chromatin-associated+protein+complexes+revealed+by+label-free+quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of chromatin-associated protein complexes revealed by label-free quantitative mass spectrometry-based proteomics.</a> Nucleic Acids Res. 41 (1), 28(2013).</li>
<li>Lambert, J. P., Tucholska, M., Pawson, T., Gingras, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+DNA+shearing+in+standard+affinity+purification+allows+simultaneous+identification+of+both+soluble+and+chromatin-bound+interaction+partners%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Incorporating DNA shearing in standard affinity purification allows simultaneous identification of both soluble and chromatin-bound interaction partners.</a> J Proteomics. 100, 55-59 (2014).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Schagger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li>
<li>Camacho-Carvajal, M. M., Wollscheid, B., Aebersold, R., Steimle, V., Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-dimensional+Blue+native%2FSDS+gel+electrophoresis+of+multi-protein+complexes+from+whole+cellular+lysates%3A+a+proteomics+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Two-dimensional Blue native/SDS gel electrophoresis of multi-protein complexes from whole cellular lysates: a proteomics approach.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (2), 176-182 (2004).</li>
<li>Liu, F., Rijkers, D. T., Post, H., Heck, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+profiling+of+protein+assemblies+by+cross-linking+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide profiling of protein assemblies by cross-linking mass spectrometry.</a> Nat Methods. 12 (12), 1179-1184 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Qui, si descrive l&#39;utilizzo di purificazione di affinità seguita da elettroforesi su gel nativo blu in combinazione con la spettrometria di massa quantitativa per risolvere complessi proteici. Questo approccio offre un metodo di svelare elenchi interazione proteina unidimensionali in assiemi proteina funzionale. Dimostriamo il metodo basato sull&#39;utilizzo di proteine ​​epitopo-tag. Tuttavia, se una linea cellulare che esprime una proteina tag non è disponibile, in alternativa potrebbe essere quella di utilizzare gli anticorpi contro la proteina di interesse, purché vi sia un peptide a disposizione per raggiungere eluizione competitiva nativo. La quantità di materiale di partenza e la quantità di perline potrebbe essere necessario modificare a seconda del livello di espressione della proteina bersaglio. Noi di solito effettuare questo protocollo con 2-5 x 10 8 cellule materiale di partenza, e questo è sufficiente anche per le proteine a basso livello di espressione. La composizione del tampone di lisi dovrebbe essere scelto empiricamente per ottenerevicino alla completa solubilizzazione dell&#39;esca. Questo potrebbe essere difficile per alcuni tipi di proteine, in particolare legame cromatina o proteine ​​di membrana. Opzioni alternative includono l&#39;aumento della quantità di sale, purché il complesso proteina in esame è stabile in alto sale, o utilizzando sonicazione e / o il trattamento nucleasi per cromatina proteine leganti 20, 29. Nel caso delle proteine di membrana, il passaggio detersivo DDM o digitonina può essere consigliabile 30. Nel caso di legame al DNA proteine, è utile includere un nucleasi come benzonasi durante la fase di purificazione 20. La rimozione completa di acidi nucleici assicura che le interazioni rilevate si verificano tra le proteine ​​e non sono mediati da DNA. Un elemento fondamentale da considerare quando si utilizza questo approccio è la stabilità del complesso sotto inchiesta. La procedura è lunga e può comportare preserving proteina overnight complesso. Abbiamo raggiunto un buon successo con due complessi di rimodellamento della cromatina (D. Bode e M. Pardo, dati non mostrati), ma questo deve essere valutato. La fase di purificazione per affinità può essere abbreviato se necessario. tecniche alternative che consentono frazionamento nativo, come cromatografia di esclusione dimensionale, sono stati ampiamente utilizzati per oltre 50 anni per caratterizzare complessi proteici. Noi e altri hanno dimostrato che la risoluzione del blu PAGE nativa è superiore a quella ottenuta mediante cromatografia di esclusione dimensionale 20, 31, 32, 33. Un altro vantaggio di blu PAGINA nativa è che non richiede sistemi di cromatografia, che sono costosi, ma piuttosto utilizza proteine ​​attrezzature elettroforetico che è molto diffusa nei laboratori. In termini di hands-on tempo, questo metodo non comporta più lavoro rispetto al tradizionale geLC-MS / MS unAPPROCCIO o offline cromatografica frazionamento. Tuttavia, come la maggior parte delle tecniche di frazionamento fanno, ha un limite alla loro risoluzione. Complessi che sono molto omogenei o chiudere in massa e la forma può essere oltre la risoluzione offerta dal blu PAGE nativa, e quindi il protocollo come riportato qui potrebbe non essere universalmente riuscito a risolvere complessi distinti con subunità condivisi. È incoraggiante, abbiamo avuto successo nel separare due complessi tetrameriche molto simili che condividono tre subunità (M. Pardo, manoscritto in preparazione). Poiché spettrometria di massa è diventata sempre più sensibile, anche piccole quantità di interattori e contaminanti non specifici possono essere rilevati in campioni di AP-MS. L&#39;approccio qui presentato potrebbe aiutare nel discriminare interattori reali dalla contaminazione di fondo nella purificazione di affinità focalizzando l&#39;attenzione sulle proteine ​​con picchi di migrazione che coincidono con picchi di migrazione esche a più alto peso molecolare di quello dile proteine ​​monomeriche. Diversi gruppi hanno utilizzato tecniche di frazionamento seguite da proteine correlazione profilatura a delineare complessi proteici in scala cellulare senza bisogno di precedente isolamento 10, 11, 12, 34. Tuttavia, ciò può comportare il mancato rilevamento interazioni sub-stechiometrico. L&#39;incorporazione di una fase di arricchimento attraverso la purificazione di affinità può aiutare a superare questo. L&#39;approccio qui descritto dovrebbe essere generalmente utile per esplorare la topologia di complessi proteici e disfare le molteplici complessi una data proteina partecipa nello stesso contesto cellulare. La strategia è semplice e suscettibili di laboratori che non possono avere costose apparecchiature di frazionamento cromatografico per risolvere complessi proteici.

Nelle cellule, maggior parte delle proteine ​​svolgere le loro funzioni attraverso transitori interazioni proteina-proteina o formando complessi proteici stabili. Caratterizzare le interazioni delle proteine ​​è fondamentale per i processi cellulari completamente comprensione. purificazione di affinità in combinazione con la spettrometria di massa (AP-SM) è una delle strategie più comunemente applicati per identificare le interazioni proteina nativa. Miglioramenti significativi nella capacità dello strumento raggiunti negli ultimi dieci anni hanno reso questo approccio estremamente potente. E &#39;importante notare che le interazioni identificate da esperimenti di AP-MS comprendono una miscela di associazioni dirette e indirette tra esche e prede. Inoltre, spesso proteine ​​partecipano a numerosi complessi diversi all&#39;interno dello stesso contesto cellulare, che potrebbero avere diversi ruoli biologici, e quindi le interattori identificati da AP-MS possono rappresentare una miscela di complessi proteici distinte o entità funzionali. Non è possibile derivaretali informazioni topologica a priori dalle liste mono-dimensionale di proteine generati da semplici esperimenti AP-MS. Tuttavia, la tecnica può essere sfruttata ulteriormente per definire l&#39;architettura di complessi proteici combinandolo con uno o più metodi per risolvere questi gruppi. Al fine di risolvere la topologia delle interazioni proteiche individuati attraverso AP-MS, sono stati applicati diverse strategie. Un approccio è quello di eseguire esperimenti iterativi AP-MS utilizzando le prede identificati in un precedente round di esperimenti come esche 1. Anche se molto informativo, questo è piuttosto un compito alta intensità di lavoro sia sperimentalmente e analiticamente. Proteina reticolazione in combinazione con la spettrometria di massa è sempre più utilizzata per ricavare informazioni topologiche su complessi proteici 2, 3, 4, 5. Tuttavia, computatioanalisi nale peptidi reticolati rimane ancora un compito impegnativo e quindi è il collo di bottiglia nel flusso di lavoro. L&#39;avvento di MS-scindibili reagenti di reticolazione dovrebbe facilitare la mappatura dei residui di amminoacidi che si trovano in prossimità di proteine interagenti 6, 7. Un&#39;altra alternativa è quella di combinare la purificazione per affinità con le precedenti tecniche di separazione ortogonali 8, 9. Frazionamento cromatografico mediante gel filtrazione o scambio ionico, o saccarosio frazionamento gradiente sono recentemente stato usato in combinazione con la spettrometria di massa quantitativa per descrivere complessi multiproteici a livello di tutto il sistema, by-passando la fase di complesso di isolamento 10, 11, 12, 13. Blu gel di poliacrilammide nativo elettroforesi (BN-PAGE) è stato ampiamente applicato aindagare le interazioni proteina nativa, in genere quelli che coinvolgono membrana mitocondriale complessi proteici 14. Questa tecnica di separazione è stato recentemente utilizzato in combinazione con quantificazione della proteina priva di etichetta e correlazione profilatura, non solo su complessi mitocondriali 15, 16, 17, ma anche per dipanare altri complessi proteici da cellule intere 18, 19. Abbiamo ipotizzato che la combinazione di purificazione di affinità con i successivi approcci frazionamento nativi e MS quantitativa dovrebbe fornire una strategia utile per risolvere più assembly proteina contenente una particolare proteina. Qui si descrive un metodo che combina nucleo purificazione per affinità epitopo-based con blu nativo elettroforesi su gel di poliacrilammide dei complessi isolati, seguita da sp massa quantitativaectrometry e proteine ​​correlazione profilatura, per risolvere i più assembly una proteina potrebbe essere coinvolta. Impieghiamo cellule staminali embrionali di topo in cui una proteina di interesse fusa ad un epitopo è espresso dal locus endogeno per ottenere vicino all&#39;abbondanza fisiologica e garantire nativo efficiente isolamento complesso. Questo approccio svela i molteplici interazioni proteina impegna in, risolverli in assiemi distinti sulla base dei loro profili di correlazione, mentre non richiede più lavoro rispetto ai tradizionali geLC-MS 20.

<table><tbody><tr><td>Proteina G Dynabeads</td><td>Life Technologies</td><td>10003D</td><td></td></tr><tr><td>FLAG anticorpo M2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1804</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, grado proteico, soluzione al 10%</td><td>Millipore</td><td>655206</td><td></td></tr><tr><td>dimetilpimelimidato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>80490</td><td></td></tr><tr><td>0,2 M tampone trietanolammina, pH 8,2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T0449</td><td></td></tr><tr><td>3x FLAG peptide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4799</td><td></td></tr><tr><td>Vivaspin 5K NMWCO, PES</td><td>Sartorius</td><td>VS0112</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3-12% Bis-Tris gel</td><td>Life Technologies</td><td>BN1001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>20x NativePAGE Cathodo Additive</td><td>Life Technologies</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>4x NativePAGE tampone di caricamento del campione</td><td>Life Technologies</td><td>BN2003</td><td></td></tr><tr><td>NativeMARK</td><td>Life Technologies</td><td>LC0725</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 5% G-250 additivo del campione&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>BN2004</td><td></td></tr><tr><td>Nunc fondo conico piastra a 96 pozzetti, polipropilene</td><td>Thermo</td><td>249944</td><td></td></tr><tr><td>Multiscreen HTS 96 pozzetti Sistema di filtrazione</td><td>Thermo</td><td>MSDVN6550</td><td></td></tr><tr><td>Nunc con tappo a 96 pozzetti naturale</td><td>Thermo</td><td>276002</td><td></td></tr><tr><td>TCEP (Tris(2-carbossietil)fosfina cloridrato)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646547</td><td></td></tr><tr><td>Iodoacetammide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile, grado HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A/0627/17</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina, grado di sequenziamento</td><td>Roche</td><td>11418475001</td><td></td></tr><tr><td>MaxQuant (software)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111795/maxquant</td></tr><tr><td>Perseus (software)</td><td>N.A.</td><td>N.A.</td><td>http://www.biochem.mpg.de/5111810/perseus</td></tr></tbody></table>

risoluzione purificato per affinità complessi proteici di blue native page e proteine ​​correlazione profiling

Resolving Affinity Purified Protein Complexes by Blue Native PAGE and Protein Correlation Profiling

La maggior parte delle proteine agisce in associazione con altre; quindi, è fondamentale caratterizzare queste unità funzionali per comprendere appieno i processi biologici. La purificazione per affinità accoppiata alla spettrometria di massa (AP-MS) è diventata il metodo di scelta per identificare le interazioni proteina-proteina. Tuttavia, gli studi convenzionali AP-MS forniscono informazioni sulle interazioni proteiche, ma le informazioni organizzative vengono perse. Per affrontare questo problema, abbiamo sviluppato una strategia per svelare i distinti assemblaggi funzionali in cui una proteina potrebbe essere coinvolta, risolvendo complessi proteici purificati per affinità prima della loro caratterizzazione mediante spettrometria di massa. I complessi proteici isolati attraverso la purificazione per affinità di una proteina esca utilizzando un tag epitopo e un'eluizione competitiva vengono separati attraverso l'elettroforesi nativa blu. Il confronto dei profili di migrazione delle proteine attraverso il profilo di correlazione utilizzando la spettrometria di massa quantitativa consente l'assegnazione di proteine interagenti a entità molecolari distinte. Questo metodo è in grado di risolvere complessi proteici di peso molecolare ravvicinato che potrebbero non essere risolti con le tecniche cromatografiche tradizionali come la filtrazione su gel. Con poco più lavoro rispetto alle convenzionali AP-geLC-MS/MS, dimostriamo che questa strategia può in molti casi essere adeguata per ottenere informazioni topologiche complesse proteiche in concomitanza con l'identificazione delle interazioni proteiche.

Il flusso di lavoro della purificazione di affinità Blu nativa delle proteine Correlazione profilatura mediante spettrometria di massa (ABC-MS) strategia è rappresentata in figura 7. complessi proteici nativi intorno ad una proteina di interesse sono isolati da purificazione per affinità utilizzando anticorpi contro un tag epitopo (in questo caso FLAG) ed eluizione competitivo. I complessi si risolvono con BN-PAGE, e tutta la corsia di gel viene asportato in 48 sezioni, e preparati per il fucile da caccia LC-MS / MS. Quantitative informazioni MS viene utilizzato per generare un profilo di migrazione per ogni proteina identificata attraverso la separazione nativo blu. Proteine ​​che interagiscono per formare un distinti profili migratori simili visualizzazione complesso con picchi sovrapponibili. Quando una proteina di interesse partecipa a più di un assemblaggio, picchi multipli si osservano nel suo profilo migrazione, date le sotto-complessi sono nel potere di risoluzione del gel nativo blu. Un confronto sistematico del migprofili razione può essere ottenuto mediante correlazione proteina profilatura usando clustering gerarchico. Dendrogramma e l&#39;intensità dei picchi per tutte le frazioni vengono visualizzati in una mappa termica, facilitando l&#39;identificazione di proteine interagenti che appartengono a distinti complessi proteici (Figura 8). Abbiamo usato questa strategia per analizzare i partner che interagiscono di MTA2, una subunità nucleo della cromatina nurd rimodellamento complesso 20. Come mostrato in figura 9, il profilo di migrazione MTA2 visualizzata due picchi di intensità distinti tra 700 kDa e 1,2 MDa, con il picco di massa inferiore visualizzazione maggiore abbondanza. Altre subunità nucleo nurd, tra mta1 / 3, HDAC1 / 2 e Mbd3, mostravano modello separazione identici, sebbene i picchi per alcune delle subunità, cioè Chd4, Gatad2a / b e Rbbp4 / 7, avevano la distribuzione abbondanza inversa (Figura 9A, B). Al contrario, il profilo di Cdk2ap1, un fattore di regolazione che recluta il complesso nurd di promotori genici Wnt 23, visualizzato solo il picco di massa superiore (Figura 9C), e così pure SALL4, un repressore trascrizionale che ha anche dimostrato di impegnare nurd 20, 24, 25. Così, frazionamento di affinità purificate proteine ​​MTA2-associata di blu PAGE nativa è riuscito a risolvere due diverse forme del complesso nurd. ABC-MS permette anche l&#39;identificazione di nuovi interattori mentre assegnandoli a particolari entità proteiche. Attraverso l&#39;esame dei cluster proteine e intensità frazione rappresentata in una mappa termica abbiamo rilevato una forte correlazione tra subunità nurd e Wdr5, una subunità regolatrice del complesso metiltransferasi MLL 26, con Wdr5 visualizzazione due picchi migrazione coincidenti con i due nurd peaks (Figura 8), suggerendo una nuova interazione tra Wdr5 e nurd. Abbiamo confermato questa interazione mediante co-immunoprecipitazione e co-migrazione cromatografia di esclusione dimensionale 20. La scelta di calcolo della metrica distanza nel clustering gerarchico influenzerà la forma dei cluster e quindi le correlazioni. Si consiglia di sperimentare le diverse metriche per raggiungere la migliore forma con la conoscenza dell&#39;interazione esistente della proteina o complessi di interesse. Generalmente abbiamo ottenuto risultati migliori con il Manhattan (L1) distanza metrica 20. Correlazione di Pearson o metriche distanza euclidea sono stati riportati anche per identificare complessi basati su tecniche di frazionamento alternative 10, 11, 12. la quandati titative MS ottenuti da frazioni native blu possono anche essere utilizzati per determinare la stechiometria dei complessi proteici. Il valore iBAQ (intensità basato assoluta quantificazione) fornisce una misura della relativa abbondanza di proteine identificate 27, 28. I valori iBAQ per la proteina membri complessi in tutte le frazioni all&#39;interno di un profilo di migrazione picco vengono normalizzati a quella della proteina esca per ottenere quantità relative. I iBAQs normalizzati attraverso un profilo di picco di un membro complessa data proteina dovrebbero seguire un andamento orizzontale, e i valori delle curve riflettere la stechiometria delle proteine ​​interagenti relativi alla proteina esca. Per una rappresentazione più dettagliata di calcoli stechiometrici, vedi 20. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig7.jpg" /> Figura 7: Schema flusso che sintetizza l&#39;ABC-MS sSTRATEGIA. Questa figura è modificata da 20. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig7large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig8.jpg" /> Figura 8. raggruppamento gerarchico dei profili migratori BN-PAGE di interattori MTA2. proteine ​​MTA2-associati sono stati raggruppati in base alla somiglianza delle loro profili migratori. È mostrata solo un sottoinsieme della mappa termica contenente il complesso nurd (racchiuso nella scatola blu). La scatola gialla evidenzia la forte correlazione del Wdr5 con il complesso nurd. I pesi molecolari annotati sono stati stimati dalle distanze di migrazione degli standard proteine ​​eseguite sullo stesso gel. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in molecolare e cellulare Proteomica 20 l&#39;American Society for Biochimica e Mo<html> Biologia lecular. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55498/55498fig8large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 9" src="/files/ftp_upload/55498/55498fig9.jpg" /> Figura 9. BN-PAGE profilo migrazione delle subunità nurd e proteine associate. A) subunità MTA2 e nurd presenti in un modello simile intensità. B) MTA2 e nurd subunità con il modello intensità inversa. C) MTA2 e Cdk2ap1, che è presente solo nell&#39;entità nurd peso molecolare superiore. I pesi molecolari annotati sono stati stimati dal profilo migrazione degli standard proteina. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Cellular Proteomics 20 l&#39;American Society for Biochimica e Biologia Molecolare Molecolare e._blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="File supplementare" src="/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.jpg" /> Dati supplementari: set di dati campione. MaxQuant-derivato del file contenente proteingroups.txt identificazioni di proteine ​​e valori di quantificazione da un esperimento ABC-MS. Questa ricerca è stato originariamente pubblicato in Cellular Proteomics 20 l&#39;American Society for Biochimica e Biologia Molecolare Molecolare e. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/55498/proteinGroupsDB04.txt" target="_blank">Cliccate qui per scaricare questo file.</a>

Presentiamo qui protocolli per purificazione per affinità di complessi proteici e la loro separazione dal blu PAGE nativa, seguiti da proteine ​​correlazione profilatura mediante un&#39;etichetta disponibile spettrometria di massa quantitativa. Questo metodo è utile per risolvere interattomi in distinti complessi proteici.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

Most proteins act in association with others; hence, it is crucial to characterize these functional units in order to fully understand biological ...

L'obiettivo generale di questa strategia sperimentale è risolvere gli assemblaggi funzionali distinti in cui una proteina può essere coinvolta, mediante frazionamento mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide nativo blu di complessi proteici purificati per affinità e analisi della correlazione tramite spettrometria di massa. Questo metodo può contribuire ad aggiungere informazioni organizzative alle liste di proteine generate da esperimenti di spettrometria di massa ad alta risoluzione con purificazione per affinità. I principali vantaggi di questo procedimento sono la semplicità di esecuzione, la buona risoluzione e il fatto che richieda poco più lavoro rispetto alla classica spettrometria CMSMS su gel.Questo protocollo è ottimizzato per la purificazione di complessi proteici da 200 a 500 milioni di cellule che esprimono livelli endogeni di una proteina marcatra con il tag FLAG. Dopo aver scongelato il pellet cellulare, come descritto nel protocollo testuale, aggiungere cinque millilitri di buffer di lisi freddo di ghiaccio contenente DTT e inibitori delle proteasi alla sospensione cellulare e agitare delicatamente per mescolare. Incubare la sospensione sul ghiaccio per 10 minuti.Trasferire la sospensione cellulare in un omogeneizzatore refrigerato. Lisiare le cellule con 20-30 movimenti utilizzando il pestello stretto, fino a quando non si osserva più viscosità evidente, quindi trasferire l'omogenato in provette da microcentrifuga fredde. Dopo la centrifugazione, trasferire il lisato chiarificato in una provetta fredda e pulita, lasciando circa 50 microlitri di lisato nel fondo.Conservare un'aliquote di 35 microlitri del lisato per misurare la concentrazione proteica e monitorare la purificazione. Successivamente, rimuovere il tampone dai microsfera preparati in precedenza. Ri-sospendere i microsfera con un millilitro del lisato, quindi mescolare con il resto del lisato.Incubare la miscela su una ruota rotante a quattro gradi Celsius per uno-due ore. Raccogliere le perline sul lato del tubo con un magnete. Prelevare un'aliquota di 30 microlitri di soprannatante e scartare il resto.Risospendere le perle in 0,5 millilitri di buffer IPP150 aspirando e dispensando da quattro a sei volte. Successivamente, trasferire la sospensione in una provetta da 1,5 millilitri fredda. Poi, lavare le perle tre volte con 0,5 millilitri di buffer nativo per l'eluizione di FLAG.Con l'ultimo lavaggio, trasferire le perle in un nuovo tubo freddo. Rimuovere completamente il tampone. Risospendere le perle in 100 microlitri di peptido 3X5 a 200 microgrammi per millilitro nel tampone di eluizione nativo.Quindi, incubare a quattro gradi Celsius per 10 minuti con rotazione delicata. Raccogliere le perle con il magnete e trasferire il soprannatante in un nuovo tubo freddo. Ripetere questo passaggio due volte prima di raccogliere tutti gli eluati.Concentrare l&apos;eluito fino a 25 microlitri in un filtro centrifugo mediante centrifugazione a 10.000 ×g a quattro gradi Celsius. Preparare il campione aggiungendo al volume concentrato di 25 microlitri un buffer di carico nativo 4X e un additivo campione al 0,5% G-250. Caricare il campione e i marcatori di peso molecolare nativi, lasciando un pozzetto vuoto tra loro.Quindi, caricare da 10 a 20 microlitri di tampone di caricamento nativo 1X in tutti i pozzetti vuoti. Riempire con attenzione la camera catodica con 200 millilitri di tampone catodico scuro 1X per elettroforesi su gel nativo, avendo cura di non disturbare i campioni. Riempire la camera anodica con 550 millilitri di tampone anodico 1X per elettroforesi su gel nativo.Eseguire l'elettroforesi a 150 volt per 30 minuti. Al termine della corsa, rimuovere il tampone catodico di colore blu scuro con una pipetta sierologica e sostituirlo con tampone catodico 1X di colore blu chiaro. Dopo aver proseguito la corsa per 60 minuti, aprire la cassetta del gel e scartare una delle due piastre della cassetta.Il gel rimane attaccato all'altra piastra della cassetta. Posizionare il gel in un contenitore contenente una quantità sufficiente di soluzione fissativa da coprirlo e incubare per 30 minuti con agitazione delicata. Successivamente, rimuovere la soluzione fissativa e sostituirla con acqua prima di scansionare il gel.Per preparare lo spettrometro di massa, posizionare innanzitutto una piastra conica da 96 pozzetti su un'altra piastra da 96 pozzetti per raccogliere i rifiuti. Praticare dei fori sul fondo dei pozzetti della piastra conica utilizzando un ago da 21 gauge. Successivamente, aggiungere 200 microlitri di acetonitrile al 50%, acido formico 0,25% nei pozzetti della piastra forata.Incubare lo stack di piastre in uno shaker per 10 minuti. Successivamente, centrifugare la piastra a 500 ×g per un minuto, in modo che il liquido passi attraverso i fori nella piastra di raccolta degli scarti. Dopo aver ripetuto i passaggi di lavaggio due volte, riempire i pozzetti della piastra 96 pozzetti forata con 150 microlitri di bicarbonato di ammonio 50 millimolare.Successivamente, posizionare il gel su una superficie pulita. Tagliare la corsia contenente il campione in 48 fette identiche. Tagliare ciascuna fetta in due o tre pezzi più piccoli, eccetto le ultime cinque fette nella parte superiore del gel.Posizionare ogni fetta in sequenza in un pozzetto di una piastra 96 pozzetti lavata con l'estremità forata. Aggiungere 50 microlitri di acetonitrile in ogni pozzetto e incubare la piastra sotto agitazione per 30-60 minuti. Dopo aver rimosso il liquido mediante centrifugazione, aggiungere 200 microlitri di TSEB 2 millimolari e bicarbonato di ammonio 50 millimolari in ogni pozzetto.Incubare la piastra con agitazione per 30 minuti a temperatura ambiente prima di rimuovere il liquido mediante centrifugazione come in precedenza. Disidratare i pezzetti di gel aggiungendo 200 microlitri di acetonitrile puro e incubare con agitazione a temperatura ambiente per 20 minuti fino a quando i pezzetti di gel diventano bianchi e opachi. Dopo aver rimosso l'acetonitrile, aggiungere 150 microlitri di tripsina in bicarbonato di ammonio freddo in ciascun pozzetto.Incubare la piastra con agitazione a 37 gradi Celsius per due ore. Successivamente, posizionare una piastra pulita a fondo conico sotto la piastra contenente il gel, assicurandosi dell'orientamento corretto delle piastre. Quindi, raccogliere il liquido contenente i peptidi mediante centrifugazione a 200 × g per un minuto.Posizionare la piastra contenente i peptidi in un evaporatore centrifugo ed evaporare il liquido eseguendo contemporaneamente il passaggio successivo. Aggiungere 150 microlitri di acetonitrile al 50%, acido formico 0,25% ai frammenti di gel. Incubare sotto agitazione a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Raccogliere il liquido nella piastra parzialmente essiccata mediante centrifugazione a 200 × g per un minuto. Continuare l'evaporazione della piastra contenente i peptidi mentre si esegue il passaggio successivo. Trasferire le soluzioni di peptidi nella piastra per filtrazione centrifuga precedentemente lavata.Posizionare una piastra pulita con fondo conico al di sotto per raccogliere i peptidi e centrifugare il blocco di piastre come in precedenza. Evaporare il liquido nella piastra con fondo conico fino a quando le pozzette non saranno completamente asciutte. Una volta asciutte, la piastra può essere coperta con un coperchio in silicone e conservata a meno 20 gradi Celsius fino all'esecuzione della spettrometria di massa e dell'analisi dei dati, come descritto nel protocollo testuale.Di seguito sono mostrati i risultati rappresentativi del raggruppamento gerarchico dei profili di migrazione ottenuti mediante elettroforesi blue native PAGE per Mta2 e le proteine che si purificano in contemporanea, presentati come dendrogramma e mappa termica che rappresenta le intensità proteiche. Il profilo di migrazione di Mta2 mostra due picchi, indicativi di due complessi distinti. Alcune subunità del complesso NuRD mostrano un andamento simile, con abbondanza massima nell'assemblea a peso molecolare più basso.Al contrario, altre subunità di NuRD sono più abbondanti nell'assemblato di NuRD con peso molecolare più elevato. D'altra parte, l'interagente di Mta2, Cdk2ap1, è presente solo nell'assemblato di NuRD con peso molecolare più elevato. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due giorni e mezzo.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere tutti i campioni e i reagenti sul ghiaccio per evitare la dissociazione dei complessi proteici. Questa procedura può essere applicata a qualsiasi proteina di interesse, purché sia possibile analizzarla a partire dal mezzo di affinità mediante eluizione competitiva in condizioni native. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come la co-immunoprecipitazione inversa o sequenziale per validare i sottocomplessi identificati.

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Multimer-PAGE: Un metodo per acquisire e risolvere i complessi proteici nei campioni biologici

Interazioni proteina-proteina e proteina-metabolita sono cruciali per tutte le funzioni cellulari. Qui, descriviamo un protocollo che permette l'analisi parallela di queste interazioni con una proteina di scelta. Il nostro protocollo è stato ottimizzato per colture di cellule vegetali e combina purificazione di affinità con proteina basati sulla spettrometria di massa e rilevamento di metabolita.

2 in 1: purificazione di affinità per l'analisi parallela di proteina-proteina e proteina-metabolita complessi in un unico passaggio

Per la profilazione complesso ad alta risoluzione viene presentato un versatile protocollo BN-MS crioscillante utilizzando un microtoma.

Profilazione complesso ad alta risoluzione di Cryoslicing BN-MS Analysis

Questo articolo fornisce una procedura per la purificazione per affinità di una proteina ricombinante umana, l'endonucleasi del lembo 1 (FEN1), che è stata marcata con un tag 6X-istidina. Il protocollo prevede l'utilizzo di due distinte colonne ioniche metalliche immobilizzate per la purificazione della proteina marcata.

Purificazione per affinità di una proteina marcata 6X-His-Tagged utilizzando un sistema di cromatografia liquida proteica veloce 

Qui, presentiamo un protocollo per consentire la cattura e l'identificazione di interazioni proteina-proteina specifiche della malattia da cellule e tessuti nativi utilizzando sonde chimiche e spettrometria di massa. I set di dati di interazione risultanti vengono analizzati attraverso una piattaforma web dedicata per rivelare disfunzioni dinamiche della rete e alterazioni del percorso legate alla malattia.

Mappatura delle interazioni disfunzionali proteina-proteina nella malattia

Scopri la purificazione per affinità di complessi proteici con Blue Native PAGE e spettrometria di massa. Questo metodo semplice offre alta risoluzione per studiare interazioni proteiche in grandi popolazioni cellulari.

Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine ​​correlazione Profiling

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Risoluzione purificato per affinità complessi proteici di Blue Native PAGE e proteine correlazione Profiling