3: Analisi di metilazione del DNA

La metilazione del DNA è una modificazione chimica del DNA che influenza l'espressione genica in diversi contesti cellulari. Molti ricercatori sono interessati al meccanismo e alle funzioni di questo processo, poiché la metilazione aberrante del DNA è stata associata a malattie come il cancro.

In questo video, tratteremo i principi alla base della metilazione del DNA e i metodi per rilevarla. Quindi, esploreremo un protocollo generale per uno di questi metodi, l'analisi del bisolfito, e alcune applicazioni di questa tecnica.

Innanzitutto, diamo un'occhiata a cos'è la metilazione del DNA e come può essere rilevata.

Durante questo processo biochimico, una cellula aggiunge un tag chimico noto come gruppo metilico alle basi della citosina nel suo DNA. La maggior parte delle citosine metilate si trova accanto alle basi guanina nello stesso filamento di DNA, e questi nucleotidi adiacenti – e il legame fosfodiestere che li lega – sono indicati come "CpGs". Sebbene la maggior parte dei CpG dei vertebrati siano metilati, quelli che non sono metilati tendono a verificarsi vicini tra loro nelle "isole" di CpG. vicino ai promotori dei geni espressi attivamente e vari altri elementi di sequenza regolatori.

Il modo in cui i cambiamenti nella metilazione del DNA contribuiscono alla regolazione genica è ancora oggetto di intense indagini. La metilazione delle isole CpG sembra essere importante per il silenziamento genico stabile e a lungo termine osservato nei processi epigenetici come l'imprinting genomico, che è l'espressione specifica del genitore di origine di alcuni geni, così come l'inattivazione del cromosoma X, il silenziamento di uno dei due cromosomi X in ciascuna cellula di mammiferi femmine. È stato anche dimostrato che la repressione di geni critici a causa della metilazione aberrante delle isole CpG contribuisce alla crescita cellulare incontrollata, che può portare al cancro. Meccanicisticamente, la metilazione del DNA può contribuire al silenziamento genico impedendo ai fattori di trascrizione di associarsi ai promotori o reclutando proteine che modificano gli istoni e rimodellano la cromatina in uno stato trascrizionalmente non permissivo.

Esistono diversi metodi per rilevare lo stato di metilazione del DNA.

Una tecnica, il saggio HELP, coinvolge due endonucleasi di restrizione chiamate HpaII e MspI, che rispettivamente scindono solo le sequenze CCGG non metilate, o sia metilate che non metilate. Confrontando i modelli di digestione prodotti da questi due enzimi, si può dedurre lo stato di metilazione del DNA.

Un altro metodo, chiamato immunoprecipitazione del DNA metilato o ? MeDIP,? utilizza anticorpi che si legano alle citosine metilate per arricchire le sequenze di DNA metilato.

Infine, l'analisi del bisolfito viene utilizzata per distinguere la citosina metilata da quella non metilata nel DNA, effettuando una reazione chimica che converte la citosina non metilata in uracile. A seguito di questa conversione, il DNA trattato con bisolfito può essere sottoposto a PCR, sequenziato e confrontato con un genoma di riferimento. Le citosine non metilate sono quelle presenti nel riferimento, ma sostituite con timine in seguito all'analisi del bisolfito e alla PCR. Sottoponendo il DNA trattato con bisolfito alla spettrometria di massa, i ricercatori possono anche creare "epigrammi di metilazione". che rappresentano linearmente diversi CpG nel genoma e rappresentano il grado di metilazione in ciascuno di essi. Tali epigrammi sono particolarmente utili se i ricercatori desiderano confrontare i modelli di metilazione tra diversi tipi di cellule.

Diamo ora uno sguardo approfondito al protocollo per l'analisi del bisolfito.

Per iniziare, l'idrossido di sodio viene aggiunto a preparazioni di DNA genomico, che vengono poi incubate a 95 °C. Questo denatura il DNA e rende le sue basi accessibili alle successive reazioni chimiche. Il metabisolfito di sodio viene quindi introdotto nella miscela di DNA denaturato e si verificheranno due fasi di reazione chimica. Durante la prima fase, la solfonazione, un gruppo solfito viene aggiunto a una citosina non metilata per formare citosina solfonato. Quindi, durante la deaminazione idrolica, un gruppo amminico viene rimosso dalla citosina solfonato per generare uracile solfonato.

Per facilitare queste prime fasi della reazione chimica, la preparazione del DNA viene ricoperta di olio minerale, che impedisce l'evaporazione e aiuta a mantenere la concentrazione di metabisolfito di sodio. La reazione viene quindi incubata a 55 anni? C nel buio. Durante questa fase, alla miscela viene aggiunto anche un agente per prevenire l'ossidazione, come il chinolo.

Per raccogliere il DNA modificato contenente uracile solfonato e senza olio minerale, la miscela viene centrifugata e viene recuperato lo strato liquido più basso. Il DNA contenuto in questa soluzione viene quindi purificato.

Successivamente, l'idrossido di sodio viene aggiunto alla miscela di DNA, che viene quindi incubata a 37 °C. Questo viene fatto per indurre la desolfonazione, che – come avrete intuito – rimuove il gruppo solfito dall'uracile solfonato, formando uracile e completando la reazione chimica.

Infine, la miscela viene neutralizzata con l'aggiunta di acetato di ammonio e il DNA viene raccolto mediante precipitazione di etanolo. Una volta che il DNA convertito con bisolfiti è stato purificato, viene sottoposto a PCR e sequenziamento.

Ora che abbiamo discusso la tecnica di base per l'analisi del bisolfito, diamo un'occhiata ad alcune applicazioni sperimentali.

Alcuni ricercatori utilizzano l'analisi del bisolfito per studiare l'imprinting genomico. Qui, i ricercatori hanno incrociato due ceppi di Arabidopsis con differenze genetiche, in modo da poter distinguere il DNA materno da quello paterno. Sono stati quindi confrontati i modelli di metilazione negli embrioni risultanti e nell'endosperma associato, o nel tessuto che sostiene l'embrione. Utilizzando questo metodo, gli scienziati hanno scoperto che le CpG nell'allele materno di un gene codificante una proteina, MEA, tendevano ad essere metilate negli embrioni ma non metilate nell'endosperma, indicando un imprinting tessuto-specifico.

Altri ricercatori stanno utilizzando questa tecnica per capire come i fattori ambientali o sociali possono alterare i modelli di metilazione. Qui, i cuccioli di topo sono stati separati dalle loro madri per indurre stress e i loro tessuti cerebrali sono stati successivamente isolati. Dopo il sequenziamento del DNA trattato con bisolfito, gli scienziati hanno determinato che i modelli di metilazione in un gene codificante ormoni, AVP, sono cambiati in una specifica regione del cervello in un gene ?separato? cuccioli, suggerendo un possibile meccanismo molecolare per gli effetti biologici a lungo termine delle prime esperienze di vita.

Infine, molti ricercatori stanno cercando di ottimizzare l'analisi del bisolfito per facilitare il confronto dei modelli di metilazione tra singole cellule uniche. Qui, i ricercatori hanno modificato il metodo di analisi del bisolfito in modo che tutti i passaggi fossero eseguiti su singoli ovociti di topo incorporati nell'agarosio, il che ha contribuito a proteggersi dalla perdita di DNA. Utilizzando questo metodo, i ricercatori sono stati in grado di identificare facilmente campioni di singoli ovociti che erano stati contaminati da altre cellule cercando quelli che fornivano più modelli di metilazione.

Hai appena visto il video di JoVE sulle analisi sensibili alla metilazione. Qui, abbiamo discusso il ruolo che la metilazione del DNA svolge nella regolazione genica, i metodi che i ricercatori utilizzano per identificare le regioni metilate nel genoma, un protocollo generalizzato per l'analisi del bisolfito e, infine, alcune applicazioni di questa tecnica. Come sempre, grazie per la visione!