Name: Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Impara a quantificare la neuroinfiammazione nel sistema nervoso centrale utilizzando l'imaging di bioluminescenza in modelli murini di malattia di Parkinson dopo iniezione periferica di fibrille di alfa-sinucleina.

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Gli autori ringraziano Olga Sharma, Theresa Hundt, e il personale delle DZNE microscopia ed animali strutture per il supporto tecnico.

Tutte le procedure tra cui animali sono stati eseguiti con l&#39;approvazione del Comitato per la protezione degli animali di Reno-Westfalia Agenzia North State Environment (LANUV). Gli animali sono stati alloggiati e curati secondo condizioni standard con 12 h ciclo luce / buio e libero accesso a cibo e acqua. 1. Modello Animal <ol><li> Intercross emizigote Tg (GFAP -Luc +/-) topi con emizigote topi Tg (M83 +/-) per generare emizigote bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mouse 15, 16. </li><li> Genotipo progenie con PCR in tempo reale per la presenza del transgene codifica alfasinucleina umana e con PCR standard per luciferasi di lucciola 12, 17. </li><li> Inoculare gli animali ad un&#39;età di sei-otto settimane. </li></ol> 2. Preparazione dell&#39;inoculo <ol><li> preparare monomeric ricombinante alfa-sinucleina umana con la mutazione A53T in tampone salina tamponata con Tris (TBS) contenente 150 mM NaCl in 20 mM Tris-HCl (pH 7,2) come è stato descritto in precedenza 14. </li><li> Preparare fibrillare alfa-sinucleina per vaccinazioni agitando 3 ug / ml di monomerico ricombinante alfa-sinucleina umana in un agitatore orbitale a 800 rpm e 37 ° C per 5 giorni. </li><li> Diluire assiemi fibrille in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) per raggiungere una concentrazione finale di 1 mg / mL per intraperitoneale o 2 mg / mL per vaccinazioni intraglossal. </li><li> Frammentare le fibrille alfasinucleina con un sonicatore asta per 1 min (40 impulsi di durata di 0,5 s con una pausa di un secondo tra ogni impulso e ampiezza impostata al 50%) su ghiaccio. Per evitare la contaminazione da cross-semina. Utilizzare sonde sonicazione puliti per preparare inoculo diverso. </li></ol> 3. Intraglossal Iniezioni <ol><li> Anestetizzare gli animali con un&#39;intrapeiniezione ritoneal di 100 mg / kg di ketamina e 10 mg / kg xilazina. Pinch punta dell&#39;animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia. Utilizzare veterinario pomata sugli occhi dell&#39;animale per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li><li> Fissare animali narcotizzati accuratamente con nastro adesivo su una piastra riscaldante in una dorsale posizione supina con la testa rivolte verso l&#39;investigatore. </li><li> Riempire una siringa ipodermica monouso 27 G con 5 ml di fibrille alfasinucleina sonicata o PBS. </li><li> Utilizzare una pinza pollice smussato dal naso con punte zigrinate per tenere bocca dell&#39;animale aperta, ed una seconda coppia minore di pinze per tirare fuori attentamente la linguetta per rendere il lato inferiore della linguetta accessibile per iniezione. </li><li> Iniettare l&#39;ago della siringa nella parte inferiore destra o sinistra della lingua in prossimità del nervo ipoglosso. Iniettare lentamente l&#39;inoculo dopo 5 s. Lentamente ritrarre l&#39;ago dopo 5 s per garantire che l&#39;inoculoè penetrato il tessuto e non si perde mentre ritraendo l&#39;ago. </li><li> Rilasciare l&#39;animale dalle sue fissazioni e lasciarlo sulla piastra di riscaldamento sotto costante monitoraggio fino al recupero completo. </li></ol> 4. iniezioni intraperitoneali <ol><li> Per le iniezioni intraperitoneali, narcotizzare gli animali brevemente in una camera anestesia per inalazione con isoflurano / ossigeno utilizzando una portata di 2 L / min e il vaporizzatore impostato a 2%. Pinch punta dell&#39;animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia. </li><li> Riempire una siringa ipodermica monouso 27 G con 50 ml di fibrille alfasinucleina sonicata o PBS. </li><li> Direttamente iniettare nel peritoneo del mouse e non penetrare tenue o cieco situato dietro la parete addominale tenendo l&#39;animale in una posizione dorsale con la testa rivolta verso l&#39;investigatore e verso il basso a circa 45 °. Monitorare gli animali fino a quando non hanno recuperatodall&#39;anestesia. </li></ol> 5. Bioluminescenza Imaging <ol><li> Immagine Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi ogni 2-4 settimane con un sistema di imaging bioluminescenza. </li><li> Prima di imaging breve anestetizzare topi in una camera di isoflurano / ossigeno con una portata di 2 L / min e il vaporizzatore impostato a 2%. Pinch punta dell&#39;animale e confermare che non ritira la sua arti posteriori per garantire la corretta anestesia. </li><li> Shave e depilare le teste dei topi con una crema depilatoria. Colorare le orecchie in nero con un indicatore non irritante per bloccare bioluminescenza non specifico. </li><li> Diluire sale di potassio D-luciferina, il substrato di luciferasi, in PBS ad una / soluzione stock di 30 mg mL. Conservare questo in 1 aliquote mL a -20 ° C. Proteggere il D-luciferina disciolto dall&#39;esposizione alla luce. </li><li> Pesare gli animali prima dell&#39;iniezione. Calcolare il volume esatto di D-luciferina per iniezione di 150 mg / kg di peso corporeo. Intraperitoneale iniettare D-luciferin e restituire l&#39;animale alla camera di anestesia. </li><li> Avviare il software di imaging. Dopo che il sistema di imaging ha raggiunto la sua temperatura di esercizio inizializzare il sistema facendo clic sul pulsante &#39;Initialize&#39; nel pannello di controllo. </li><li> Selezionare i pulsanti &#39;luminescenti&#39; e &#39;fotografia&#39;. Impostare il tempo di esposizione a 60 s, il binning a &#39;Media&#39;, l&#39;F / Stop per &#39;1&#39;, e il guadagno EM &#39;Off&#39;. </li><li> Confermare che il filtro di eccitazione è impostato &#39;Block&#39; e il filtro per le emissioni di &#39;aperto&#39;, e impostare l&#39;altezza soggetto a 1,50 cm. </li><li> Dieci minuti dopo l&#39;iniezione con D-luciferina, collocare gli animali sulla piastra di riscaldamento nella camera di imaging e garantire che il muso siano correttamente inseriti nella presa anestesia. Chiudere il flusso isoflurano / ossigeno dalla camera di inalazione e aprire il flusso per la camera di imaging con una portata di 0,25 L / min e un&#39;evaporazione del 2%. Chiudere la porta della camera di imaging properly. </li><li> Fare clic sul pulsante &#39;Acquire&#39; per misurare la bioluminescenza, che prende 60 s. Arrestare il flusso isoflurano e monitorare gli animali fino a quando non hanno completamente recuperato dopo di loro il ritorno alle loro gabbie. </li><li> Utilizzare il software di imaging per quantificare la bioluminescenza. All&#39;interno del &#39;Tool Palette&#39; selezionare &#39;Strumenti ROI. Sotto &#39;Tipo&#39; all&#39;interno dei &#39;Strumenti ROI&#39; selezionare &#39;misurazione del ROI&#39;. </li><li> All&#39;interno dei &#39;Strumenti ROI&#39; clic sullo strumento &quot;cerchio&quot; e selezionare il numero di ROI per disegnare dal menu a discesa - idealmente &#39;3&#39; per tre topi. </li><li> Nell&#39;immagine, fare clic destro ciascuna ROI e sotto &#39;Proprietà&#39; regolare la larghezza e l&#39;altezza di 1,25 cm. Posizionare ogni ROI su tutta l&#39;area del cervello che viene quantificato. </li><li> In alto a sinistra dell&#39;immagine, impostare il pannello unità &#39;radianza (fotoni). </li><li> All&#39;interno del &#39;tavolozza degli strumenti&#39;, selezionare &#39;Regolazione immagine&#39; e regolare il minimo eil massimo della &#39;scala a colori&#39;, per esempio, da 0.20e6 a 1.00e6. </li><li> In &#39;File&#39; salvare i dati con &#39;Salva&#39;. </li></ol> 6. Le analisi biochimiche <ol><li> Isolare il cervello e il midollo spinale secondo i protocolli stabiliti 18, 19. </li><li> Omogeneizzare intero cervello e del midollo spinale interi campioni separatamente in PBS in presenza di inibitori di proteasi e fosfatasi (diluito in PBS a 1x) in due cicli di 30 s con 6.000 rpm in un omogeneizzatore tessuto. Assicurarsi che il cervello e il midollo spinale campioni omogeneizzazione ad una concentrazione finale del 20% (peso / volume). </li><li> Sonicare i campioni due volte mentre il loro mantenimento ghiaccio con una costante di impulso di 10 s ed un&#39;ampiezza impostata al 50%. </li><li> Regolare le omogenati al 10% in PBS e 750 mM NaCl diluendo loro 1: 1 con 1,5 M NaCl in PBS. </li><li> Per separare i detriti cellulari, centrifugare le omogenati a 1.000 xg per 5 minuti a4 ° C. Mantenere i supernatanti per i passaggi successivi e scartare il pellet. </li><li> Misurare la concentrazione di proteine ​​nei omogenati utilizzando il dosaggio dell&#39;acido bicinconinico (BCA) secondo le istruzioni del produttore. Incubare 1,0 mg di proteina totale da omogenati cerebrali o 0,8 mg di omogenati midollo spinale in N-laurylsarcosyl ad una concentrazione finale del 10% (p / v) per 15 min in ghiaccio. </li><li> Sovrapporre le omogenati su un cuscino 3 ml di saccarosio del 10% (peso / volume) in acqua distillata e ultracentrifuga a 465.000 xg per 1 ora a 4 ° C. </li><li> Risospendere il pellet in un tampone contenente 4% di solfato di sodio dodecil (SDS), 2% β-mercaptoetanolo, 192 mM glicina, 25 mM Tris, e 5% (p / v) di saccarosio. </li><li> Bollire i campioni a 100 ° C per 5 min e caricarli su gel di SDS-poliacrilammide per elettroforesi in un sistema tampone acido morpholineethanesulfonic (MES). </li><li> Trasferire le proteine ​​separate per polivinilidene difluoruro (PVDF) membrane in un semiDry sistema assorbente. </li><li> Incubare le membrane a 0,4% (vol / vol) soluzione di formalina in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente su un rotore a 35 rpm per reticolare le proteine ​​con la membrana. </li><li> Bloccare le membrane in tampone TBS contenente 0,05% (vol / vol) di Tween 20 e 5% (p / v) di latte per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le macchie con l&#39;anticorpo primario in tampone bloccante notte a 4 ° C. </li><li> Lavare le membrane tre volte in tampone TBS e incubare con anticorpi secondari perossidasi o fluoroforo-coniugato in TBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Visualizza gli anticorpi secondari legati per chemiluminescenza o fluorescenza secondo i protocolli stabiliti 20. </li></ol> Analisi 7. immunofluorescenza <ol><li> Disidratare il cervello sezionato e il midollo spinale in una stazione di lavorazione dei tessuti e incorporarli in paraffina utilizzando una stazione di paraffina. </li><li> Tagliare il TIS inclusi in paraffinasues con un microtomo a 8 micron sezioni coronali spesse e montare sezioni di vetrini. </li><li> Deparaffinare le sezioni di tessuto incubandoli in due bagni xilolo separate per 5 a 10 min e reidratare attraverso una serie di bagni graduata di etanolo (100%, 90%, 70%, 50%) ed infine con H 2 O. </li><li> Incubare le sezioni in 0,01 M tampone citrato (pH 6,0) per 5 minuti a temperatura ambiente e inoltre li bollire per 10 minuti in un forno a microonde. </li><li> Lasciare che le sezioni raffreddare a temperatura ambiente e incubare con una soluzione di perossido di idrogeno al 3% per 30 minuti per inibire le perossidasi endogene. </li><li> Bloccare le sezioni di tessuto di incubazione con 20% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) siero albumina bovina (BSA), e 0,5% Triton X-100 in PBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Incubare le sezioni con l&#39;anticorpo primario diluito in 1% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) BSA, e 0,25% Triton X-100 in PBS notte a 4 ° C. </li> &lt;li&gt; Lavare sezioni due volte con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS e una volta con PBS. </li><li> Macchiare le sezioni con i corrispondenti anticorpi secondari coniugati fluoroforo e il colorante nucleare DAPI diluito in 1% (vol / vol) siero di capra normale, 1% (vol / vol) BSA, e PBS per 1 ora a temperatura ambiente. </li><li> Dopo lavaggio due volte con 0,25% (vol / vol) Triton X-100 in PBS e una volta con PBS, coprivetrino per i vetrini con mezzi di incorporamento e visualizzare la colorazione con un microscopio confocale a scansione laser. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi rappresenta un metodo facile per indurre la malattia neurologica accompagnato da neuroinflammation ricapitolare caratteristiche importanti synucleinopathies. Analogamente, iniezione lingua rappresenta un altro percorso per neuroinvasione da prionoids alfa-sinucleina in topi transgenici ma è meno efficiente. Abbiamo scelto di interrompere i nostri esperimenti a 420 giorni dopo l&#39;iniezione e...

V&#39;è una crescente evidenza che l&#39;alfa-sinucleina ha caratteristiche che sono simili a quelli della proteina prionica, in particolare nella sua capacità di auto-seme e propagano misfolding tra cellule e lungo percorsi neuronali. La struttura, di alfa-sinucleina è indicato anche come &#39;prioni-like&#39; o &#39;prionoid&#39;, ed è supportata da osservazioni in esperimenti di trapianto, che suggeriscono la trasmissibilità di misfolded alfa-sinucleina da neuroni malati a appena trapiantato neuroni sani 1, 2 , 3, 4. Anche l&#39;iniezione diretta di misfolded alfasinucleina nel cervello o la periferia, per esempio il muscolo arti posteriori o parete intestinale, provoca una diffusione di alfasinucleina patologia a parti distali del SNC 5, 6, 7, &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 8, 9, 10. Abbiamo analizzato trasmissione di prionoids alfa-sinucleina tramite percorsi periferici in maggior dettaglio e affrontato la questione se misfolded alfasinucleina può neuroinvade del SNC dopo una singola iniezione intraperitoneale o intraglossal, una caratteristica che in precedenza era stato mostrato per prioni ma non per alfa misfolded sinucleina. Dopo l&#39;iniezione dei prioni nella lingua, neuroinvasione del SNC avviene tramite propagazione lungo il nervo ipoglosso della lingua che conduce al nucleo del nervo ipoglosso, che si trova nel tronco cerebrale 11. Come un modello murino abbiamo scelto Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che sovraesprimono il mutante A53T di umana alfasinucleina dal promotore prione, e luciferasi di lucciola sotto il controllo di un promotore GFAP per monitorare attivazione degli astrociti da bioluminescenza, come precedentemente indicato nel cervello diprioni infetti topi 12. Nelle nostre mani bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) i topi non hanno sviluppato la malattia fino a 23 mesi di età, come è stato dimostrato da altri 13. Una singola iniezione di fibrille alfasinucleina umani tramite l&#39;intraglossal o rotta indotta malattia neurologica intraperitoneale con patologia nel cervello e midollo spinale di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice sostengono l&#39;ipotesi che prionoids alfa-sinucleina condividere caratteristiche importanti con prioni 14.

<table><tbody><tr><td>anticorpo anti-actina</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1501</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa-sinucleina, anticorpo fosfo S129 [pSyn#64]</td><td>Wako</td><td>015-25191</td><td></td></tr><tr><td>anti-alfa-sinucleina, anticorpo fosfo S129 [EP1536Y]</td><td>Abcam</td><td>ab51253</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFAP</td><td>Dako</td><td>Z0334 01</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-IBA-1</td><td>Wako</td><td>019-19741</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-Sequestosoma-1 (p62)</td><td>Proteintech</td><td>18420-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo anti-ubiquitina [Ubi-1]</td><td>Merck Millipore</td><td>MAB1510</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato (PBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190169</td><td></td></tr><tr><td>Ketamina&nbsp;</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>100 mg/kg</td></tr><tr><td>Xilazina</td><td>Ratiopharm</td><td></td><td>10 mg/kg</td></tr><tr><td>Siringa da 27 G</td><td>VWR</td><td>613-4900</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano&nbsp;</td><td>Piramal Healthcare</td><td>PZN&nbsp; 4831850 Crema</td><td></td></tr><tr><td>depilatoria</td><td>Veet</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Secureline marcatore da laboratorio&nbsp;</td><td>Neolab</td><td>25040</td><td></td></tr><tr><td>D-luciferina sale di potassio</td><td>Acris</td><td>LK10000</td><td>30 mg/mL soluzione madre</td></tr><tr><td>Thermomixer Eppendorf</td><td></td><td>5776671</td><td></td></tr><tr><td>Sonopuls Mini20 sonicatore</td><td>Bandelin</td><td>3648</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina II sistema di imaging</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image 3.0 Software</td><td>PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tg(M83+/-) topi o B6; Topi C3-Tg (Prnp-SNCA*A53T) 83Vle/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>004479</td><td></td></tr><tr><td>Pinze a modello standard</td><td>Strumenti</td> per la scienza <td>11000-16</td><td></td></tr><tr><td>Pinze a modello stretto</td><td>Strumenti per la scienza fine 11002-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>N-laurilasarcosil</td><td>Sigma</td><td>L5125-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga Optima Max-XP&nbsp;</td><td>Rotore Beckman Coulter</td><td></td><td>TLA-110</td></tr><tr><td>Tubi in policarbonato a parete spessa</td><td>Beckman Coulter</td><td>362305</td><td></td></tr><tr><td>NuPAG Novex 4-12% Bis-Tris Midi Protein Gels</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>WG1401BOX</td><td></td></tr><tr><td>HRP anticorpo coniugato</td><td>Cayman</td><td>Cay10004301-1</td><td></td></tr><tr><td>IR Dye 680 anticorpo coniugato&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td>926-68070</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Substrato a durata estesa</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34075</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di imaging Stella 3200</td><td>Sistema</td> di imaging a infrarossi Raytest <td></td><td></td></tr><tr><td>Odyssey&nbsp;</td><td>LI-COR Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>MP Biomedicals</td><td>TWEEN201</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>SA/T8787</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-FL Membrana PVDF</td><td>Merck Millipore</td><td>IPFL00010</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Sigma</td><td>Roth</td><td></td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma</td><td>SA/00216763/000500</td><td>soluzione di lavoro 3%</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A3294-100G</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Thermo Fisher Scientific PCN5000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td>diluizione di lavoro 1:50.000</td></tr><tr><td>Terreni di montaggio in fluoro&nbsp;</td><td>Omnilab</td><td>SA/F4680/000025</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale LSM700</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HALT proteasi e inibitori della fosfatasi</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10516495</tr><tr><td>Precellys 24-Dual omogeneizzatore</td><td>Peqlab</td><td>91-PCS24D</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 anticorpo coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A31619</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 anticorpo coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11005</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp; BCA&nbsp; Proteine&nbsp; Saggio&nbsp; Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10741395</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo RM2255</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LSM700 microscopio confocale a scansione laser</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

bioluminescenza imaging di neuroinflammation in topi transgenici dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

Bioluminescence Imaging of Neuroinflammation in Transgenic Mice After Peripheral Inoculation of Alpha-Synuclein Fibrils

Per studiare il comportamento prione-come misfolded alfasinucleina, sono necessari modelli murini che permettono la trasmissione veloce e semplice di prionoids alfa-sinucleina, che causano neuropatologia all&#39;interno del sistema nervoso centrale (CNS). Qui si descrive che intraglossal o iniezione intraperitoneale di fibrille alfasinucleina in bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che iperesprimono alfasinucleina umano con la mutazione A53T dal promotore proteina prionica e luciferasi di lucciola da il promotore di proteina acida fibrillare gliale (GFAP), è sufficiente per indurre la malattia neuropatologiche. In confronto a omozigote Tg (M83 + / +) topi che sviluppano gravi sintomi neurologici che cominciano ad un&#39;età di 8 mesi, eterozigote Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) gli animali rimangono liberi da malattia spontanea fino a raggiungere un all&#39;età di 22 mesi. È interessante notare che l&#39;iniezione di fibrille alfasinucleina tramite l&#39;intraperitoneal percorso indotta malattia neurologica con paralisi in quattro dei cinque Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. animali malati hanno mostrato gravi depositi di fosforilata alfa-sinucleina nel cervello e midollo spinale. Accumuli di alfa-sinucleina erano sarcosile insolubile e colocalized con ubiquitina e P62, e sono accompagnati da una risposta infiammatoria conseguente gliosi astrocitaria e microgliosis. Sorprendentemente, l&#39;inoculazione di fibrille alfasinucleina nella lingua era meno efficace nel causare malattia con uno solo dei cinque animali iniettati mostrano alfasinucleina patologia dopo 285 giorni. I nostri risultati mostrano che l&#39;inoculazione per via intraglossal e ancora di più per via intraperitoneale è idoneo ad indurre la malattia neurologica con caratteristiche rilevanti del sinucleinopatie a Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi. Ciò fornisce un nuovo modello per lo studio patogenesi prioni come indurred entro prionoids alfa-sinucleina in maggiore dettaglio.

Iniezione periferica prionoids alfa-sinucleina tramite la lingua o il peritoneo indotta neuropatologia nel SNC di bigenic Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) mice (Tabella 1 e Figura 1). Dopo una singola iniezione intraperitoneale con fibrille alfasinucleina, quattro dei cinque topi sviluppato malattia neurologica con un tempo di incubazione medio di 229 ± 17 giorni. Sorprendentemente, uno dei cinque topi hanno sviluppato malattie ...

Iniezione periferica di fibrille alfasinucleina nel peritoneo o linguetta di Tg (M83 +/-: GFAP -Luc +/-) topi che esprimono umana alfasinucleina con la mutazione A53T familiare e luciferasi di lucciola, può indurre neuropatologia, compreso neuroinflammation , nel loro sistema nervoso centrale.

Bioluminescenza Imaging di Neuroinflammation in topi transgenici Dopo periferica inoculazione di alfa-sinucleina fibrille

To study the prion-like behavior of misfolded alpha-synuclein, mouse models are needed that allow fast and simple transmission of alpha-synuclein ...

L'obiettivo generale di questo metodo di imaging bioluminescente è quantificare la neuroinfiammazione nel sistema nervoso centrale di un modello murino di malattia di Parkinson dopo l'iniezione periferica di fibrille di alfa-sinucleina. Questo metodo può aiutare a determinare quando e in quale misura si verifica la neuroinfiammazione nei modelli murini di malattie neurodegenerative. Il principale vantaggio di questa tecnica è che la neuroinfiammazione può essere monitorata in modo non invasivo e ripetutamente fino a quando alcuni topi sviluppano una patologia neurologica.L'implicazione di questa tecnica è la diagnosi della malattia neurologica alla decima ora, poiché un aumento della bioluminescenza dovuto all'infiammazione del nervo non solo accompagna, ma spesso precede la malattia neurologica. Iniziare anestetizzando correttamente l'animale per l'intervento chirurgico. Eseguire una compressione del dito del piede e verificare che l'animale non ritragga l'arto, per confermare un livello di anestesia chirurgica.Applicare un unguento oftalmico per prevenire l'essiccazione durante l'anestesia. Utilizzare del nastro adesivo per fissare con cura l'animale su una piastra riscaldante in posizione supina, con la testa rivolta verso l'investigatore. Successivamente, riempire una siringa ipodermica monouso da 27 gauge con cinque microlitri di fibrille di alfa-sinucleina sottoposte a sonificazione.Successivamente, utilizzare un paio di pinze anatomiche a punta arrotondata per tenere aperta la bocca dell'animale e usare il secondo paio di pinze più piccolo per estrarre con attenzione la lingua, in modo da rendere accessibile la sua superficie inferiore per l'iniezione. Inserire l'ago della siringa nel lato inferiore destro o sinistro della lingua, in prossimità del nervo ipoglosso. Dopo cinque secondi, iniettare lentamente l'inoculo.Lasciare l'ago in posizione per ulteriori cinque secondi per assicurare che l'inoculo penetri nel tessuto, quindi estrarre con attenzione l'ago. Dopo l'iniezione, rilasciare l'animale e lasciarlo sulla piastra riscaldata sotto costante monitoraggio fino al completo recupero. Per le iniezioni intraperitoneali, narcotizzare brevemente gli animali in una camera per anestesia con isoflurano.Nuovamente, pizzicare l'alluce dell'animale e verificare che non ritragga l'arto posteriore per assicurare un'adeguata anestesia. Riempire una siringa ipodermica monouso da 27 gauge con 50 microlitri di fibrille di alfa-sinucleina sonicate o con PBS. Tenere l'animale in posizione dorsale con la testa rivolta lontano dall'operatore e inclinata verso il basso di circa 45 gradi.Iniettare direttamente nel peritoneo del topo senza penetrare l'intestino tenue o il cieco situati dietro la parete addominale. Monitorare gli animali fino a quando non si saranno ripresi dall'anestesia. Prima dell'imaging, rasare e depilare le teste dei topi anestetizzati con isoflurano.Colorare le orecchie in nero con un pennarello non irritante per bloccare la bioluminescenza aspecifica. Pesare gli animali prima dell'iniezione. Calcolare quindi il volume esatto di D-Luciferina da iniettare pari a 150 milligrammi per chilogrammo di peso corporeo.Iniettare intraperitonealmente il volume calcolato di D-Luciferina, quindi restituire ogni animale nella camera di anestesia. Avviare il software di acquisizione delle immagini. Dopo che il sistema di imaging ha raggiunto la temperatura operativa, inizializzare il sistema facendo clic sul pulsante Inizializza nel pannello di controllo.Quindi selezionare i pulsanti Luminescente e Fotografia. Impostare il tempo di esposizione su 60 secondi, il Binning su medio, l'F/Stop su uno e il guadagno EM su spento. Selezionare Blocco e poi Apri.Quindi, nella scheda "altezza soggetto", selezionare 1,50 dal menu a tendina. Dieci minuti dopo l'iniezione con D-Luciferina, posizionare gli animali sulla piastra riscaldante all'interno della camera di imaging e assicurarsi che i loro muscoli siano correttamente inseriti nell'uscita dell'anestesia. Passare il flusso di isoflurano dalla camera di inalazione alla camera di imaging e chiudere correttamente la porta della camera di imaging.Fare clic sul pulsante di acquisizione per misurare la bioluminescenza, operazione che richiede 60 secondi. Arrestare il flusso di isoflurano, quindi riportare gli animali nelle loro gabbie. Utilizzare il software di imaging per quantificare la bioluminescenza aprendo il menu della tavolozza degli strumenti e selezionando Strumenti di area di interesse (ROI).In tipo, selezionare Area di misurazione (ROI). All'interno di Strumenti ROI, fare clic sullo strumento cerchio e selezionare il numero di ROI da disegnare dal menu a discesa. Idealmente tre per tre topi.Nell'immagine, fare clic con il tasto destro su ciascuna ROI e, nelle proprietà, regolare larghezza e altezza a 1,25 centimetri. Posizionare ogni ROI sulla zona cerebrale da quantificare. Nell'angolo superiore sinistro dell'immagine, impostare il pannello delle unità su radiance in fotoni.Quindi aprire il menu della tavolozza degli strumenti. Selezionare "aggiustamento immagine" e regolare il valore minimo e massimo della scala cromatica. Ad esempio, da 200.000 a un milione.Infine, nel menu file, fare clic su salva per salvare i dati. Come mostrato qui, dopo l'iniezione intraperitoneale con fibrille di alfa-sinucleina, quattro dei cinque topi transgenici A53T sinucleina GFAP luciferina reporter hanno sviluppato una malattia neurologica entro 229 giorni, come indicato dai quadrati viola. Tuttavia, solo uno dei cinque topi iniettati interglossalmente ha sviluppato una malattia neurologica entro 285 giorni, come indicato dai cerchi verdi.L'immagine bioluminescente ha rivelato che i topi transgenici emettevano una bioluminescenza aumentata dai loro cervelli e midolli spinali, poco prima dello sviluppo di segni di malattia neurologica. Questa bioluminescenza risultava più intensa dopo l'iniezione intraperitoneale e assente dopo l'iniezione di PBS, suggerendo l'assenza di gliosi astrocitaria. Questa figura mostra la bioluminescenza nei cervelli di topi transgenici nel tempo, dopo l'iniezione intraperitoneale di fibrille di alfa-sinucleina.Come mostrato dai cerchi blu, verdi, marroni e arancioni. Aumentati livelli di bioluminescenza superiori a una soglia di 2 milioni di fotoni al secondo per centimetro quadrato per steradiante sono stati osservati alcune settimane prima che questi quattro topi sviluppassero segni neurologici della malattia. Uno su cinque animali ha mostrato anche livelli elevati di bioluminescenza poco prima di morire, a 285 giorni dall'iniezione intraglossale con fibrille di alfa-sinucleina.Al contrario, nei topi di controllo sani inoculati con PBS e in un animale che non ha sviluppato la malattia dopo iniezione intraperitoneale, con i fibrilli di alfa-sinucleina indicati dai cerchi rossi, il segnale di bioluminescenza è rimasto al di sotto della soglia durante il periodo di osservazione. La colorazione immunofluorescente di sezioni cerebrali di animali malati con anticorpi diretti contro GFAP e Iba1 ha confermato la neuroinfiammazione con microgliosi e astrociti reattivi nelle regioni con depositi di alfa-sinucleina. Gli animali sani che non hanno accumulato depositi di alfa-sinucleina hanno mostrato una debole colorazione per GFAP e Iba1.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di un'ora se effettuata correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurodegenerazione per esplorare in modo non invasivo la neuroinfiammazione nel sistema nervoso centrale dei topi. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come iniettare perifericamente fibrille di alfa-sinucleina nei topi e di come eseguire l'immagine bioluminescente per monitorare la neuroinfiammazione del sistema nervoso centrale.L'obiettivo generale della procedura è indurre perifericamente una malattia neurologica mediante iniezione intraglossale o intraperitoneale di fibrille di alfa-sinucleina e immaginare in modo non invasivo l'insorgenza di neuroinfiammazione nel tempo.

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