Name: Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Scopri come indurre la transizione mesenchimale-epiteliale nelle cellule di sarcoma usando microRNA-200 e GRHL2. Questo metodo riproducibile aiuta a studiare le reti di regolazione genica e a identificare nuove strategie terapeutiche per migliorare gli esiti clinici.

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JAS riconosce il sostegno del duca Cancer Institute, The Duke University genito-urinario Laboratorio di Oncologia, e il Dipartimento di Ortopedia dell&#39;Università Duke. HL è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Centro di Fisica Teorica biologica (NSF PHY-1.427.654) e NSF DMS-1.361.411, e come un CPRIT (prevenzione del cancro e Research Institute del Texas) Scholar Ricerca sul Cancro dello Stato del Texas alla Rice University. KEW stato supportato dal NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiato utili discussioni con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare DMEM per coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 mL di penicillina-streptomicina (5.000 U / ml) a 500 ml di DMEM. Questo terreno può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi. </li><li> Risospendere primer liofilizzati in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione finale di 10 uM. primer negozio risospese a -20 ° C. </li><li> Preparare dosaggio radioimmunoprecipitazione (RIPA) tampone (150 mM NaCl, 0.5% desossicolato sodico, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Supplemento con cocktail inibitore della proteasi prima dell&#39;uso e mantenere tampone sul ghiaccio quando è in uso. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 10 mg / mL polibrene (hexadimethrine bromuro) filtro acqua e la siringa per sterilizzare utilizzando un filtro polietersulfone 0,45 um. Soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi. </li><li> Preparare una soluzione di 1 mg / ml di lavoro del nitro blu tetrazolio cloruro sciogliendo 10 mg in 10 ml di PBS. Conservare a 4 ° C.</li></ol> 2. lentivirali trasduzione del GRHL2 Giorno 1 <ol><li> Piastra 3 x 10 5 cellule HEK293T per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2 ml di DMEM supplementato. Quantificare cellule utilizzando un contatore automatico di cellule. Le cellule devono essere 40 - 60% confluenti dopo coltura di una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> Giorno 2 <ol start="2"><li> Diluire 2 pg di vettore vuoto (pCMV-UBC-EGFP) o 2 pg di pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 in 200 ml di mezzo privo di siero insieme con 1,8 ug di pΔ8.9 e 0,2 pg di pCMV-VSV plasmidi helper -G. In un tubo separato, diluire 4 ml di una base lipidica reagente di trasfezione in 200 ml di mezzo privo di siero per ogni trasfezione (8 ml in 400 microlitri per due campioni). Aggiungere 200 microlitri di miscela reagente di trasfezione per ogni soluzione plasmide e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante l&#39;incubazione, lavare le cellule HEK293T rimuovendo il mezzo mediante aspirazione sottovuoto e risciacquo cellule con 1 ml di PBS. Sostituire il PBS con 800 ml di mezzi senza siero. Dopo 20 minuti, aggiungere 200 ml di reagente di trasfezione: miscela plasmide dal punto 2.2 a gocce a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> rimuovere accuratamente mezzo trasfezione mediante aspirazione a vuoto e sostituirlo con 2 mL di supplementato DMEM. Riportare le cellule per l&#39;incubatore per la cultura durante la notte. NOTA: le cellule HEK293T sono vagamente aderente. sostituzione dei supporti deve essere effettuata con cautela per limitare la rimozione delle cellule dal fondo del piatto o del matraccio. </li></ol> 3 ° giorno <ol start="5"><li> Aggiornare multimediale su cellule trasfettate e HEK293T piastra 3 x 10 5 cellule RD per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2 ml di DMEM supplementato. cellule cultura durante la notte. cellule RD sono una linea cellulare di rabdomiosarcoma umano disponibile in commercio. </li></ol> 4 ° giorno </p&gt; <ol start="6"><li> Raccogliere media virali dalle cellule HEK293T. Pipettare il supporto DMEM dalle cellule HEK293T e posto in un nuovo 15 ml conica. Ricollocare accuratamente con i nuovi media e cellule DMEM posto HEK293T indietro in incubatrice per il giorno successivo. </li><li> Aggiungere 2 ml di 10 mg / mL polibrene per mL di mezzi virali in due nuove provette coniche 50 ml (uno per il vettore trasfezione vuota e un&#39;altra per la trasfezione GRHL2). Filtro per siringa media virali rimuovendo lo stantuffo di una siringa da 3 ml e allegare un filtro da 0,45 micron polietersulfone alla punta. <ol><li> Aggiungere i media virali raccolti nella fase 2.6 nel cilindro della siringa, e immergersi supporti nelle nuove provette coniche da 50 ml contenente polibrene. Rimozione di supporti da cellule RD mediante aspirazione a vuoto e aggiungere media viral filtrato cellule RD. </li></ol></li></ol> 5 ° giorno <ol start="8"><li> Ripetere Giorno 4. Cellule HEK293T possono essere scartati dopo che i media virale è stato raccolto. </li></ol> giorno 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> Lavare le cellule RD con 1 ml di PBS e aggiungere 200 ml di 0,05% tripsina per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 5 minuti, aggiungere 2 ml di terreni integrati, e spostare sospensione cellulare in un 15 ml conica. cellule centrifugare a 250 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e dei media aspirare. Risospendere in 1 ml di DMEM (supplementato con 5% FBS e 1% di penicillina-streptomicina). NOTA: Utilizzando una percentuale maggiore di FBS può causare intasamenti durante citofluorimetria <ol><li> celle filtranti per citometria di flusso. Utilizzare una pipetta per applicare la sospensione cellulare 1 mL RD attraverso un filtro 30 um in citofluorimetria tubi e Consiglio di tubi su ghiaccio. </li><li> EGFP + cellule Ordina 26 in provette da 1,5 ml microcentrifuga contenenti 0,5 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina e posto sul ghiaccio. Piastra EGFP + cellule in totale di 1 ml di DMEM supplementato ordinati in un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti e posto in incubatore per coltura. ; NOTA: La resa di cellule EGFP + da citofluorimetria dopo trasduzione è solitamente bassa (50.000-100.000 cellule). Le cellule possono avere bisogno di essere in coltura per 10 - 14 giorni prima di procedere alla fase 3. </li></ol></li></ol> 3. Reverse trasfezione di Mir-200s <ol><li> Preparare 50 uM scorte di miR-200 imita utilizzando priva di nucleasi H 2 O. scorte aliquote e conservare a -20 ° C per evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento. </li><li> Aggiungere 3 ml di ogni 50 pM miR-200 mimico (miR-200a, miR-200b, e miR-200c) a 300 ml di mezzo privo di siero o 9 ml di 50 mM miRNA controllo negativo a mezzo privo di siero 300 microlitri. </li><li> Aggiungere 6 ml di specifici siRNA reagente di trasfezione per 600 ml di mezzo privo di siero e dividere 300 ml di questa miscela in due tubi, uno per ciascuna delle due miscele miR dal punto 3.2. Combinare i 300 ml di ciascuna miscela miR dal passo 3.2 con una miscela di 300 ml di reagente di trasfezione. Incubare per 20 min a camera temperature. </li><li> Durante l&#39;incubazione preparare una sospensione cellulare di 600.000 cellule EGFP + RD esprimenti EV o GRHL2 creato nella sezione 2 in 2.4 mL (250 cellule / pl) di mezzo privo di siero per ogni trattamento. </li><li> In una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di miR-200 della miscela o della miscela di controllo negativo dal punto 3.3 in sei pozzetti e quindi aggiungere 400 ml di ciascuna sospensione cellulare in tre pozzetti di ogni miscela miR. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in 5% di CO 2 durante la notte e cambiare media per integrati pienamente DMEM il giorno seguente. Raccogliere celle 2 giorni più tardi per analisi utilizzando tampone appropriato (vedi sotto). time-lapse imaging di cellule di sarcoma RD sottoposti TEM è disponibile come materiale supplementare. Immagine ciascun pozzetto ogni 2 h con un obiettivo 10X utilizzando un processo automatizzato imager live-cell 27. </li></ol> 4. estrazione dell&#39;RNA, trascrizione inversa e qPCR <ol><li> Estrarre l&#39;RNA secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando un RNA di seriekit di estrazione 24. RNA estratto può essere conservato a -80 ° C. </li><li> Quantificare concentrazione di RNA. Scongelare e lavorare con l&#39;RNA sul ghiaccio. Per quantificare le concentrazioni di RNA, misurare l&#39;assorbanza UV a 260 nm con uno spettrofotometro lettore di piastre secondo il protocollo del produttore. Diluire tutti i campioni per la più bassa concentrazione di acqua priva di nucleasi. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa di RNA totale in DNA complementare (cDNA). Combinare non inferiore a 100 ng di RNA totale con tampone PCR, miscela dNTP (100 mM), primer esameriche casuali, trascrittasi inversa e acqua priva di nucleasi in un volume di reazione di 20 microlitri 24. Eseguire cicli RT secondo il protocollo del produttore. cDNA può essere immagazzinato a lungo termine a -20 ° C. </li><li> Diluire 20 reazioni microlitri a 100 microlitri con 80 ml di priva di nucleasi H 2 O. </li><li> Mescolare 5 ml di una fluorescenza a base di colorante intercalante 2x qPCR master mix, 0,06 ml di ogni 10 micron di primer, unnd 2 microlitri di reazione RT diluito per campione. </li><li> Eseguire qPCR secondo il protocollo del produttore per il master mix basato sulla fluorescenza. </li><li> Quantificare quantità relative di mRNA mediante il metodo CT delta e normalizzare a GAPDH. Tracciare l&#39;espressione dell&#39;mRNA medio di repliche biologiche ± deviazione standard per ciascun gruppo di trattamento. NOTA: devono essere prese precauzioni speciali quando si lavora con l&#39;RNA per evitare il contatto con RNasi, come l&#39;utilizzo della plastica e dei reagenti RNasi-free. materiali riutilizzabili devono essere trattati prima dell&#39;uso per rimuovere RNasi. </li></ol> 5. Immunofluorescenza <ol><li> Seguendo passo 3.6, supporti aspirato mediante aspirazione a vuoto da cellule RD in formato a 24 pozzetti. </li><li> Fissare cellule aggiungendo 500 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per pozzetto ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Seguendo fissazione, Consiglio di cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e conservare a 4 ° C per una notte, se necessario. </li><li> permeabilizecellule aggiungendo 500 ml di PBS + 0,2% Triton-X100 e incubare 30 minuti a temperatura ambiente. Mediante aspirazione a vuoto, rimuovere il tampone permeabilizzazione e lavare tre volte con PBS. </li><li> Blocco in 500 ml di 5% di albumina sierica bovina (BSA) / PBS e incubare le cellule per 30 minuti a RT. Cellule possono essere conservate a 4 ° C per una notte, se necessario. </li><li> Preparare la diluizione anticorpo primario. Pipettare 200 ml di 5% BSA / PBS per pozzetto in una conica 15 mL (12 pozzetti = 2,4 mL) e aggiungere 1 ml di anticorpo primario per ml di 5% BSA / PBS necessaria. Rimuovere tampone bloccante mediante aspirazione a vuoto e dispensare 200 microlitri di anticorpo primario diluito ad ogni pozzetto. <ol><li> Incubare le cellule in 1: 1.000 diluiti anticorpi primari in 5% BSA / PBS per 1 ora a RT o durante la notte a 4 ° C. Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte con PBS. </li></ol></li><li> Preparare la diluizione anticorpo secondario nello stesso volume di 5% BSA / PBS come sopra. Aggiungere l&#39;anticorpo secondario rosso lontano colorante-coniugato con una diluizione 1: 2.000. Inoltre aggiungi1 mg / mL di Hoechst colorante per il mix. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 ml di miscela per ogni pozzetto. <ol><li> Incubare a RT per 1 ora al buio. Lavare 3 volte con PBS, le cellule lasciare in PBS, e proteggere le cellule dalla luce con un foglio. Cellule possono essere conservate a 4 ° C, se necessario. </li></ol></li><li> celle di immagine a 400X ingrandimento totale con un microscopio a epifluorescenza invertita con lunghezza d&#39;onda di eccitazione 594 - 650 nm. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Lavare le cellule da 3.6 due volte con PBS ghiacciato. In ghiaccio, le cellule Lisare con 50 ml di 1x RIPA buffer di integrate con 1x cocktail di inibitori delle proteasi. </li><li> lisati Rock a 4 ° C per 15 min, raccolgono lisati in provette da 1,5 mL, e centrifugare ad alta velocità (20.000 xg) per 5 minuti per chiarire campioni. I lisati cellulari possono essere conservati a lungo termine a -80 ° C, se necessario. </li><li> Quantificare proteina totale utilizzando un saggio Bradford e un&#39;aliquota una pari quantità di proteina in nuove provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Brincampioni g a parità di volume, con tampone RIPA e tampone di caricamento 3x Laemmli integrato con 2-mercaptoetanolo. </li><li> Incubare campioni in 1x Laemmli buffer di caricamento del campione per 5 min a 95 ° C ed eseguire SDS-PAGE usando un gel Tris-glicina 4-12% a 200 V per 45 minuti. La quantità di catene proteiche caricata a seconda della linea cellulare. In alcuni casi, è necessario 50-100 pg di proteina totale per rilevare E-caderina in cellule mesenchimali. </li><li> proteine ​​di trasferimento su una membrana di nitrocellulosa per 2 ore a 50 V in tampone di trasferimento 1x Tris-glicina. </li><li> Blocco membrana per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C in tampone bloccante BSA-based. </li><li> Diluire anticorpi primari a 1: 1.000 concentrazione in 5 mL di tampone bloccante, aggiungere diluizione alla membrana, e incubare con delicata dondolo per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. membrana lavata 3 volte in PBS con 0,05% Tween-20. </li><li> Incubare membrane per 1 ora a temperatura ambiente con secondar fluorescente accoppiati infrarossiy anticorpo a 1: 20.000 diluizione nel tampone di bloccaggio come sopra. </li><li> Lavare membrana due volte in PBS con 0,05% Tween-20 e poi una volta in PBS. </li><li> Membrana Immagine utilizzando il rilevamento della fluorescenza a raggi infrarossi standard. </li></ol> 7. saggi crescita ancoraggio-indipendente NOTA: Per una dettagliata morbido protocollo del test agar, vedere 28. <ol><li> Calda sterile supporti 2x DMEM al 42 ° C in bagno di acqua calda. Durante questo tempo, il calore pre-autoclave 1% agarosio nel microonde per 3 minuti. Microonde per altri 30 s per volta, se necessario o fino a quando completamente sciolto. Spostare agarosio ad un bagno d&#39;acqua C 42 °. </li><li> Posizionare una provetta da 50 ml in un becher con 42 ° C acqua in una cappa sterile e mescolare 1% agarosio e supporti 2x DMEM in un rapporto 1: 1 contabilità per 1,5 ml di miscuglio per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Sempre preparare in più DMEM / agarosio per tenere conto di errori di pipettamento e per evitare le bolle. </li><li> Aggiungete il composto alpareti del pozzo, assicurando bolle si formano e lasciate riposare per 30 minuti a RT. </li><li> Mentre lo strato inferiore è solidificazione, preparare ciascun gruppo di cellule trasfettate RD nel passaggio 3 aspirando media e lavare una volta con 1 ml di PBS. Aspirare PBS e aggiungere 0,2 ml di 0,05% tripsina e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Neutralizzare tripsina in 0,8 mL di media e cellule Triturare per formare una cella singola sospensione. Trasferimento sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. </li><li> Contare le cellule e calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per 10.000 cellule per pozzetto. </li><li> Riscaldare 0,6% agarosio nel microonde per 3 min, seguiti da 30 s alla volta fino completamente sciolto. Spostare agarosio a 42 ° C bagnomaria. </li><li> Posizionare una provetta da 50 ml in un becher con 42 ° C acqua in una cappa sterile. Mescolare 0,6% agarosio e sospensione cellulare diluita in un rapporto 1: 1 per preparare 1,5 ml di miscela per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Sempre preparare sospensione cellulare extra / agarosio mix per tenere conto di errori pipettaggio eper evitare bolle. NOTA: E &#39;importante lavorare a 42 ° C qui. Se la temperatura è troppo bassa la miscela solidificare prima placcatura, e temperature superiori a 42 ° C influenzerà vitalità cellulare. </li><li> Mescolare bene triturando cellule diverse volte e aggiungere miscela di cellule nei pozzetti, garantendo che non forma bolle e lasciate solidificare per 20 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 2 ml di media integrate ad ogni bene e passare piastre per incubatrice. <ol><li> Modificare i media una volta alla settimana per 3-4 settimane o fino a quando le colonie multicellulari formano. Fare attenzione a non toccare l&#39;agar quando si rimuove media da parte aspirazione a vuoto. In alternativa, utilizzare un P1000 per rimuovere lo strato superiore di liquidi. </li><li> Macchiare molli piastre di agar aggiungendo 200 ml di soluzione di cloruro Nitro Blu tetrazolo (1 mg / ml in PBS) e incubare la piastra per una notte a 37 ° C. Sostituire i media il giorno dopo con PBS per l&#39;imaging. </li><li> pozzi Immagine a 40X di ingrandimento totale di un microscopio invertito. </li><li> Eseguire l&#39;analisi su ImageJ per l&#39;area della colonia e il numero. Trama numero medio colonia di repliche biologiche ± deviazione standard. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I sarcomi sono rari, ma altamente aggressivi tumori di un lignaggio mesenchimale. Nonostante la loro lignaggio mesenchimali, un sottogruppo di sarcomi sembra subire una transizione fenotipica ad un epiteliale stato simile più. Questo interruttore TEM-like ha rilevanza prognostica, come pazienti con più tumori epiteliali-simili sono meno aggressivi 24. Nonostante la loro rilevanza clinica, ci sono pochi studi che riguardano i meccanismi molecolari mappa queste transizioni fenotipiche in sarcomi. <...

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Shenghan Xu
to:
Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticità fenotipica si riferisce ad una transizione reversibile tra fenotipi cellulari, ed è generalmente suddiviso in due tipi, epiteliali-to-mesenchimale (EMT) transizioni e mesenchimali-to-epiteliale transizioni (TEM). Questa plasticità fenotipica gioca un ruolo importante nei normali processi di organismi multicellulari, come lo sviluppo e la guarigione della ferita 1; tuttavia, questi stessi percorsi e programmi di espressione genica può anche portare a malattie come la fibrosi (valutata in 2, 3, 4) e carcinoma metastasi (valutata in riferimento 5, 6, 7, 8). Durante la metastasi, per esempio, EMT sconvolge la polarità delle cellule, le interazioni cellula-cellula, e promuove l&#39;invasione 9, 10. Insieme, EMT contribuires ad uno stato fenotipico che facilita la diffusione delle cellule tumorali. Inoltre, EMT comporta anche una serie di altre alterazioni fenotipiche che guidano un fenotipo aggressivo, tra deregolazione del metabolismo delle cellule del cancro 6, lo sviluppo di resistenza ai farmaci 11, 12, maggiore capacità tumore-apertura 13, 14 e ospitare evasione immune 15. plasticità fenotipica è stato ben studiato nella progressione carcinoma; Tuttavia, sarcomi presentano inoltre plasticità fenotipica. È interessante notare che sembra come se alcuni degli stessi conducenti di plasticità fenotipica in carcinomi contribuiscono anche al sarcoma plasticità e l&#39;aggressività. Ad esempio, è stato dimostrato cellule tumorali circolanti (CTC) di pazienti con sarcoma di esprimere EpCAM, una proteina di superficie cellulare che si trova in genere su cellule epiteliali 16. Addizionale, 250 campioni sarcomi dei tessuti molli sono stati classificati come epiteliali simile o mesenchimali come base di espressione genica. I pazienti nella firma biomarker epiteliale simile hanno avuto una prognosi migliore rispetto ai pazienti con la firma biomarcatore mesenchimali simil-17. Ciò è coerente con molti carcinomi, in cui i pazienti con più carcinomi epiteliali-come hanno risultati migliori rispetto ai pazienti con più tumori mesenchimali simil-18. Mentre alcuni sarcomi visualizzano biomarker e percorsi di espressione genica coerenti con il TEM, le basi molecolari di questa plasticità fenotipica rimangono poco compresi. Per studiare i meccanismi e gli autisti di MET nel sarcoma abbiamo sviluppato un modello di induzione MET usando due fattori specifici epiteliali, il microRNA (miR) -200 famiglia e grainyhead-like 2 (GRHL2). I miR-200 sono una famiglia di piccoli RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione genica legandosi alla UTR di messen 3&#39;ger RNA e prevenire traduzione in proteina. La famiglia miR-200 è costituito da due sottogruppi - uno contenente miR-141 e miR-200a, e l&#39;altro tra cui miR-200b, 200c-miR, e miR-429. I membri della famiglia miR-200 sono arricchite nei tessuti epiteliali, e la perdita di miR-200 è associata con metastasi nei carcinomi 19. La famiglia miR-200 è anche downregulated in sarcomi dei tessuti molli rispetto al tessuto normale 20. Simile alle MIR-200s, GRHL2 è un regolatore chiave che è importante per lo sviluppo epiteliale 21. Il fattore di trascrizione GRHL2 agisce in due modi per upregulate geni epiteliali, come E-caderina: 1) Nelle cellule epiteliali, GRHL2 reprime direttamente il principale regolatore EMT, ZEB1 22; e 2) GRHL2 direttamente attiva la trascrizione dei geni epiteliali 23. Le nostre indagini precedenti hanno dimostrato che l&#39;espressione combinata di miR-200 e GRHL2 in cellule di sarcomainduce un fenotipo MET simile 24. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per creare un modello in vitro del TEM induzione in cellule di sarcoma usando l&#39;espressione ectopica di miR-200 e GRHL2.

<table><tbody><tr><td>Contatore automatizzato Countess</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR micropiastra</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit qPCR universale veloce</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Blocco iniziale (PBS) Tampone di blocco</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>Tampone di blocco a base di BSA</td></tr><tr><td>Agarosio Uso generale LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Tampone di corsa</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Tampone di trasferimento</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Buffer Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu; m nitrocellulosa</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Kit MiniPrep Quick-RNA</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA miRNA mimic controllo negativo #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miMike</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miMik</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miMike</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>terreni senza siero</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Ecaderina</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteasi e Inibitore della fosfasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratori Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; m filtro per flusso</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCCCAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro blu tetrazolio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di esadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td> siringa <td>in polibrene</td></tr><tr><td>da 3 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa sterile</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria</td>a<td>fondo tondo in polipropilene da 5 ml</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>Thermo Fisher</td><td>Kit di trascrizione inversa</td> <td>4368814</td></tr><tr><td>4% paraformaldiide</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticità fenotipica si riferisce a un fenomeno in cui le cellule transitoriamente ottenere tratti di un altro lineage. Durante la progressione del carcinoma, plasticità fenotipica spinge l&#39;invasione, la diffusione e le metastasi. Infatti, mentre la maggior parte degli studi di plasticità fenotipica sono stati nel contesto di carcinomi epiteliali derivate, si scopre sarcomi, che sono mesenchimali in origine, anche esibire plasticità fenotipica, con un sottoinsieme di sarcomi subire un fenomeno che assomiglia a un mesenchymal- transizione epiteliale (TEM). Qui, abbiamo sviluppato un metodo comprendendo la famiglia miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) per imitare questo fenomeno MET-come osservato nel sarcoma paziente samples.we sequenzialmente esprimono GRHL2 e la famiglia miR-200 utilizzando la trasduzione delle cellule e trasfezione, rispettivamente , per meglio comprendere le basi molecolari di queste transizioni fenotipiche in cellule di sarcoma. cellule di sarcoma che esprimono miR-200 e GRHL2 hanno dimostrato una maggiore caratteristica atmosfera epitelialeCI della morfologia cellulare e le modificazioni del epiteliali e mesenchimali biomarker. Studi futuri usando questi metodi possono essere utilizzati per comprendere meglio le conseguenze fenotipiche dei processi MET simili su cellule di sarcoma, quali la migrazione, invasione, propensione metastatica, e resistenza alla terapia.

Schema per l&#39;induzione MET in cellule di sarcoma Una cronologia generale per l&#39;induzione di modifiche MET simili in cellule di sarcoma è mostrato in Figura 1. Il protocollo inizia trasduzione GRHL2 (Figura 1A), seguita da trasfezione della famiglia miR-200 (Figura 1B). familiari GRHL2 o miR-200 non erano in grado di influenzare l&#39;aspetto delle cellule RD quando espres...

Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell&#39;impatto biologico della plasticità fenotipica sull&#39;aggressività cancro e trattamenti.

Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le conseguenze fenotipiche delle transizioni mesenchimale-epiteliali nei sarcomi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sul perché i sarcomi di tipo epiteliale abbiano esiti migliori rispetto ai sarcomi di tipo più mesenchimale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un mezzo semplice e riproducibile per studiare le reti di regolazione genica a valle e i fenotipi associati alle transizioni mesenchimale-epiteliali nei sarcomi.Comprendendo meglio la plasticità fenotipica nei sarcomi, speriamo di identificare interventi terapeutici che ci permettano di indirizzare i sarcomi verso uno stato più indolente di tipo epiteliale. A dimostrazione della procedura saranno due studenti universitari del nostro laboratorio, Jackson Xu e Shivee Gilja. Nel primo giorno della trasduzione, piastrare tre volte 10 alla quinta cellule HEK293T in ciascuna delle due pozzette di una piastra a sei pozzette in due millilitri di DMEM integrato.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo aver coltivato durante la notte, esaminare le cellule al microscopio. Queste dovrebbero essere confluenti al 40-60%.Successivamente, in provette separate contenenti 200 microlitri di mezzo privo di siero con 1,8 microgrammi di p delta 8.9 e 0,2 microgrammi di plasmidi ausiliari pCMV-VSV-G, diluire due microgrammi del vettore vuoto e due microgrammi del vettore contenente GRHL2. In un'altra provetta, diluire quattro microlitri di un reagente di trasfezione a base lipidica in 200 microlitri di mezzo privo di siero per ogni trasfezione. Per due campioni, saranno necessari otto microlitri e 400 microlitri.Aggiungere 200 microlitri di miscela del reagente di trasfezione a ciascuna soluzione di plasmide, quindi incubare i campioni per 20 minuti a temperatura ambiente. Nel frattempo, utilizzare un aspiratore a vuoto per rimuovere il mezzo dalle cellule HEK293T. Lavare le cellule una volta con un millilitro di PBS, quindi sostituire il PBS con 800 microlitri di mezzo privo di siero.Dopo 20 minuti, aggiungere goccia a goccia 400 microlitri della miscela di reagente di trasfezione e plasmide in ciascun pozzetto delle cellule seminate. Incubare la piastra per due ore a 37 gradi Celsius in presenza di anidride carbonica al 5%. Al termine dell'incubazione, rimuovere con attenzione il mezzo di trasfezione mediante aspirazione sotto vuoto.Le cellule HEK293T sono debolmente aderenti, quindi quando si aspira il mezzo, fare attenzione a non rimuovere le cellule dal fondo della piastra o del fiasco. Sostituire il mezzo aspirato con due millilitri di DMEM integrato. Rimettere le cellule nell'incubatrice per una coltura notturna.Il giorno successivo, rinnovare il mezzo sui colture di cellule HEK293T transfezionate, quindi seminare tre volte 10 alla quinta cellule RD di rabdomiosarcoma umano in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti contenente due millilitri per pozzetto di DMEM integrato. Colture entrambe le piastre per tutta la notte. Al quarto giorno, utilizzare una pipetta per raccogliere il mezzo virale dalle cellule HEK293T e trasferirlo in due nuovi tubi conici da 15 millilitri, uno per il lentivirus contenente un vettore vuoto e un altro per il lentivirus contenente il plasmide GRHL2.Sostituire con attenzione il mezzo con DMEM fresco e riposizionare le cellule HEK293T nell'incubatrice per tutta la notte. Successivamente, aggiungere due microlitri di polibrenina a 10 milligrammi per millilitro per ogni millilitro di mezzo virale in due nuove provette coniche da 50 millilitri, una per la trasfezione con vettore vuoto e un'altra per la trasfezione con GRHL2. Rimuovere lo stantuffo da una siringa da tre millilitri e collegare un filtro in polietersolfone da 0,45 micrometri alla punta della siringa.Aggiungere il mezzo virale raccolto in precedenza nel cilindro della siringa e versarlo in uno dei nuovi tubi conici da 50 millilitri contenenti polibren. Ripetere questo passaggio con l'altro campione. Successivamente, rimuovere il mezzo dalle cellule RD mediante aspirazione sotto vuoto e aggiungere due millilitri di ciascun campione di mezzo virale filtrato in pozzi separati della piastra RD.Incubare le cellule RD a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato. Il giorno successivo, ripetere il prelievo del mezzo virale e aggiungere il mezzo di infezione agli stessi pozzetti contenenti le cellule RD precedentemente infettate. Le cellule HEK293T possono essere eliminate dopo il prelievo del mezzo virale.Incubare le cellule per altri due giorni. Nel settimo giorno, lavare le cellule RD con un millilitro di PBS, quindi aggiungere 200 microlitri di tripsina 0,05% in ogni pozzetto. Incubare a 37 gradi Celsius per cinque minuti.Aggiungere due millilitri di mezzo integrato e quindi trasferire la sospensione cellulare in nuove provette coniche da 15 millilitri. Centrifugare le cellule a 250 g per cinque minuti a temperatura ambiente. Al termine della centrifugazione, aspirare il mezzo e risospendere le cellule in un millilitro di DMEM integrato con 5% FBS e 1% penicillina-streptomicina.Per filtrare le cellule in preparazione alla citometria a flusso, utilizzare una pipetta per applicare la sospensione cellulare RD di un millilitro attraverso un filtro sterile da 30 micrometri direttamente in provette per citometria a flusso. Posizionare le provette sul ghiaccio. Utilizzando un citometro a flusso, separare le cellule positive per EGFP in provette microcentrifuga da 1,5 millilitri contenenti 0,5 millilitri di DMEM integrato con 10% di FBS e 1% di penicillina-streptomicina.Riporre le cellule ordinate sul ghiaccio. Piastrare le cellule positive per EGFP provenienti sia dal vettore vuoto che dalle trasduzioni GRHL2 in un volume totale di un millilitro di DMEM integrato in pozzetti separati di una piastra a 12 pozzetti. Successivamente, collocare le cellule nell'incubatrice per la coltura.Il rendimento di cellule positive per EGFP dopo la citometria a flusso è solitamente piuttosto basso, nell'intervallo di 50.000-100.000 cellule. Per questo motivo, potrebbe essere necessario coltivare le cellule per un periodo aggiuntivo di 10-14 giorni prima di passare al passaggio successivo. In un tubo da microcentrifuga, aggiungere tre microlitri di ciascun mimico di miR-200 a 50 micromolari a 300 microlitri di mezzo privo di siero.In un tubo separato, aggiungere nove microlitri di micro RNA di controllo negativo a 50 micromolari in 300 microlitri di mezzo privo di siero. Successivamente, in un altro tubo da microcentrifuga, aggiungere sei microlitri di reagente di trasfezione specifico per siRNA in 600 microlitri di mezzo privo di siero. Dividere 300 microlitri di questa miscela in due tubi, uno per ciascuna delle due miscele di miR.Combinare i 300 microlitri di ciascuna miscela di miR con una miscela di 300 microlitri di reagente di trasfezione. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. Durante l'incubazione, preparare una sospensione cellulare di 600.000 cellule RD positive per EGFP che esprimono il vettore MD o GRHL2 in 2,4 millilitri con 250 cellule per microlitro di mezzo privo di siero per ogni trattamento.In una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 100 microlitri per pozzetto della miscela miR-200 o del controllo negativo in sei pozzetti. Successivamente, aggiungere 400 microlitri di ciascuna sospensione cellulare in tre pozzetti per ogni miscela di miR. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in atmosfera di anidride carbonica al 5% per tutta la notte.Il giorno successivo, sostituire il mezzo con DMEM completamente supplementato. Raccogliere le cellule due giorni dopo per l'analisi utilizzando il tampone appropriato. Acquisire un'immagine di ogni pozzetto ogni due ore con un obiettivo 10X utilizzando un sistema automatizzato per l'immagine di cellule vive.Queste immagini a intervalli mostrano la transizione mesenchimale-epiteliale, o MET, in cellule RD che esprimono GRHL2, EGFP e miRNA miR-200. Le cellule cambiano forma da fusiforme a selciata, con un aumento delle adesioni tra cellula e cellula e una morfologia più arrotondata. La MET non viene osservata in altre condizioni sperimentali.Invece, le cellule mostrano una morfologia allungata, a forma di fuso, con pochi attacchi tra cellula e cellula. Durante l'induzione della MET, il cambiamento morfologico nelle cellule RD in seguito alla sovraespressione di GRHL2 e miR-200 è stato accompagnato da un aumento dell'espressione del marcatore epiteliale E-cadherina, misurato mediante qPCR e western blotting. L'aggiunta di miR-200 ha aumentato l'espressione dell'E-cadherina da sola, ma la sovraespressione combinata di miR-200 e GRHL2 ha potenziato sinergicamente l'espressione dell'E-cadherina.Come dimostrato dalla microscopia a immunofluorescenza, si è osservato un aumento, alle giunzioni intercellulari, delle molecole di adesione epiteliale EpCAM e TJP-1, indicate dalle frecce bianche. L'upregolazione delle proteine epiteliali è stata accompagnata da una downregolazione dei geni mesenchimali ZEB1 e Notch1 mediante QRT-PCR. L'induzione di MET ha ridotto la crescita indipendente dall'ancoraggio delle cellule RD, come misurato mediante saggi di crescita in agar soffice.L'inibizione della crescita in agar morbido è stata determinata esclusivamente dai miR-200, poiché la sovraespressione di GRHL2 ha portato a un aumento della crescita indipendente dall'ancoraggio. Questo risultato è in accordo con precedenti studi che mostrano come l'espressione di GRHL2 induca crescita indipendente dall'ancoraggio. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, inclusi saggi per misurare i cambiamenti nella migrazione cellulare, nell'invasione, nella metastasi e nella risposta alla terapia, al fine di chiarire le conseguenze fenotipiche del MET nei sarcomi.

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Biologia dello sviluppo

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