Name: Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Scopri come indurre la transizione mesenchimale-epiteliale nelle cellule di sarcoma usando microRNA-200 e GRHL2. Questo metodo riproducibile aiuta a studiare le reti di regolazione genica e a identificare nuove strategie terapeutiche per migliorare gli esiti clinici.

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JAS riconosce il sostegno del duca Cancer Institute, The Duke University genito-urinario Laboratorio di Oncologia, e il Dipartimento di Ortopedia dell&#39;Università Duke. HL è stato sostenuto dalla National Science Foundation (NSF) Centro di Fisica Teorica biologica (NSF PHY-1.427.654) e NSF DMS-1.361.411, e come un CPRIT (prevenzione del cancro e Research Institute del Texas) Scholar Ricerca sul Cancro dello Stato del Texas alla Rice University. KEW stato supportato dal NIH F32 CA192630 MKJ e HL beneficiato utili discussioni con Mary C. Farach-Carson, JN Onuchic, Samir M. Hanash, Kenneth J. Pienta, e Donald S. Coffey.

1. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparare DMEM per coltura cellulare aggiungendo 50 ml di siero fetale bovino (FBS) e 5 mL di penicillina-streptomicina (5.000 U / ml) a 500 ml di DMEM. Questo terreno può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi. </li><li> Risospendere primer liofilizzati in acqua priva di nucleasi ad una concentrazione finale di 10 uM. primer negozio risospese a -20 ° C. </li><li> Preparare dosaggio radioimmunoprecipitazione (RIPA) tampone (150 mM NaCl, 0.5% desossicolato sodico, 0,1% SDS, 50 mM Tris, pH 8,0). Supplemento con cocktail inibitore della proteasi prima dell&#39;uso e mantenere tampone sul ghiaccio quando è in uso. Conservare a 4 ° C. </li><li> Preparare 10 mg / mL polibrene (hexadimethrine bromuro) filtro acqua e la siringa per sterilizzare utilizzando un filtro polietersulfone 0,45 um. Soluzione può essere conservato a 4 ° C per un massimo di sei mesi. </li><li> Preparare una soluzione di 1 mg / ml di lavoro del nitro blu tetrazolio cloruro sciogliendo 10 mg in 10 ml di PBS. Conservare a 4 ° C.</li></ol> 2. lentivirali trasduzione del GRHL2 Giorno 1 <ol><li> Piastra 3 x 10 5 cellule HEK293T per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2 ml di DMEM supplementato. Quantificare cellule utilizzando un contatore automatico di cellule. Le cellule devono essere 40 - 60% confluenti dopo coltura di una notte a 37 ° C con 5% di CO 2. </li></ol> Giorno 2 <ol start="2"><li> Diluire 2 pg di vettore vuoto (pCMV-UBC-EGFP) o 2 pg di pCMV-GRHL2-UBC-EGFP 24, 25 in 200 ml di mezzo privo di siero insieme con 1,8 ug di pΔ8.9 e 0,2 pg di pCMV-VSV plasmidi helper -G. In un tubo separato, diluire 4 ml di una base lipidica reagente di trasfezione in 200 ml di mezzo privo di siero per ogni trasfezione (8 ml in 400 microlitri per due campioni). Aggiungere 200 microlitri di miscela reagente di trasfezione per ogni soluzione plasmide e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Durante l&#39;incubazione, lavare le cellule HEK293T rimuovendo il mezzo mediante aspirazione sottovuoto e risciacquo cellule con 1 ml di PBS. Sostituire il PBS con 800 ml di mezzi senza siero. Dopo 20 minuti, aggiungere 200 ml di reagente di trasfezione: miscela plasmide dal punto 2.2 a gocce a ciascun pozzetto e incubare le cellule per 2 ore a 37 ° C in 5% CO 2. </li><li> rimuovere accuratamente mezzo trasfezione mediante aspirazione a vuoto e sostituirlo con 2 mL di supplementato DMEM. Riportare le cellule per l&#39;incubatore per la cultura durante la notte. NOTA: le cellule HEK293T sono vagamente aderente. sostituzione dei supporti deve essere effettuata con cautela per limitare la rimozione delle cellule dal fondo del piatto o del matraccio. </li></ol> 3 ° giorno <ol start="5"><li> Aggiornare multimediale su cellule trasfettate e HEK293T piastra 3 x 10 5 cellule RD per pozzetto di una piastra da 6 pozzetti in 2 ml di DMEM supplementato. cellule cultura durante la notte. cellule RD sono una linea cellulare di rabdomiosarcoma umano disponibile in commercio. </li></ol> 4 ° giorno </p&gt; <ol start="6"><li> Raccogliere media virali dalle cellule HEK293T. Pipettare il supporto DMEM dalle cellule HEK293T e posto in un nuovo 15 ml conica. Ricollocare accuratamente con i nuovi media e cellule DMEM posto HEK293T indietro in incubatrice per il giorno successivo. </li><li> Aggiungere 2 ml di 10 mg / mL polibrene per mL di mezzi virali in due nuove provette coniche 50 ml (uno per il vettore trasfezione vuota e un&#39;altra per la trasfezione GRHL2). Filtro per siringa media virali rimuovendo lo stantuffo di una siringa da 3 ml e allegare un filtro da 0,45 micron polietersulfone alla punta. <ol><li> Aggiungere i media virali raccolti nella fase 2.6 nel cilindro della siringa, e immergersi supporti nelle nuove provette coniche da 50 ml contenente polibrene. Rimozione di supporti da cellule RD mediante aspirazione a vuoto e aggiungere media viral filtrato cellule RD. </li></ol></li></ol> 5 ° giorno <ol start="8"><li> Ripetere Giorno 4. Cellule HEK293T possono essere scartati dopo che i media virale è stato raccolto. </li></ol> giorno 7 </strong&gt; <ol start="9"><li> Lavare le cellule RD con 1 ml di PBS e aggiungere 200 ml di 0,05% tripsina per pozzetto. Incubare a 37 ° C per 5 minuti, aggiungere 2 ml di terreni integrati, e spostare sospensione cellulare in un 15 ml conica. cellule centrifugare a 250 xg per 5 minuti a temperatura ambiente e dei media aspirare. Risospendere in 1 ml di DMEM (supplementato con 5% FBS e 1% di penicillina-streptomicina). NOTA: Utilizzando una percentuale maggiore di FBS può causare intasamenti durante citofluorimetria <ol><li> celle filtranti per citometria di flusso. Utilizzare una pipetta per applicare la sospensione cellulare 1 mL RD attraverso un filtro 30 um in citofluorimetria tubi e Consiglio di tubi su ghiaccio. </li><li> EGFP + cellule Ordina 26 in provette da 1,5 ml microcentrifuga contenenti 0,5 ml di DMEM supplementato con 10% FBS e 1% di penicillina-streptomicina e posto sul ghiaccio. Piastra EGFP + cellule in totale di 1 ml di DMEM supplementato ordinati in un singolo pozzetto di una piastra 12 pozzetti e posto in incubatore per coltura. ; NOTA: La resa di cellule EGFP + da citofluorimetria dopo trasduzione è solitamente bassa (50.000-100.000 cellule). Le cellule possono avere bisogno di essere in coltura per 10 - 14 giorni prima di procedere alla fase 3. </li></ol></li></ol> 3. Reverse trasfezione di Mir-200s <ol><li> Preparare 50 uM scorte di miR-200 imita utilizzando priva di nucleasi H 2 O. scorte aliquote e conservare a -20 ° C per evitare ripetuti cicli di congelamento / scongelamento. </li><li> Aggiungere 3 ml di ogni 50 pM miR-200 mimico (miR-200a, miR-200b, e miR-200c) a 300 ml di mezzo privo di siero o 9 ml di 50 mM miRNA controllo negativo a mezzo privo di siero 300 microlitri. </li><li> Aggiungere 6 ml di specifici siRNA reagente di trasfezione per 600 ml di mezzo privo di siero e dividere 300 ml di questa miscela in due tubi, uno per ciascuna delle due miscele miR dal punto 3.2. Combinare i 300 ml di ciascuna miscela miR dal passo 3.2 con una miscela di 300 ml di reagente di trasfezione. Incubare per 20 min a camera temperature. </li><li> Durante l&#39;incubazione preparare una sospensione cellulare di 600.000 cellule EGFP + RD esprimenti EV o GRHL2 creato nella sezione 2 in 2.4 mL (250 cellule / pl) di mezzo privo di siero per ogni trattamento. </li><li> In una piastra a 24 pozzetti, aggiungere 100 microlitri per pozzetto di miR-200 della miscela o della miscela di controllo negativo dal punto 3.3 in sei pozzetti e quindi aggiungere 400 ml di ciascuna sospensione cellulare in tre pozzetti di ogni miscela miR. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C in 5% di CO 2 durante la notte e cambiare media per integrati pienamente DMEM il giorno seguente. Raccogliere celle 2 giorni più tardi per analisi utilizzando tampone appropriato (vedi sotto). time-lapse imaging di cellule di sarcoma RD sottoposti TEM è disponibile come materiale supplementare. Immagine ciascun pozzetto ogni 2 h con un obiettivo 10X utilizzando un processo automatizzato imager live-cell 27. </li></ol> 4. estrazione dell&#39;RNA, trascrizione inversa e qPCR <ol><li> Estrarre l&#39;RNA secondo le istruzioni del costruttore, utilizzando un RNA di seriekit di estrazione 24. RNA estratto può essere conservato a -80 ° C. </li><li> Quantificare concentrazione di RNA. Scongelare e lavorare con l&#39;RNA sul ghiaccio. Per quantificare le concentrazioni di RNA, misurare l&#39;assorbanza UV a 260 nm con uno spettrofotometro lettore di piastre secondo il protocollo del produttore. Diluire tutti i campioni per la più bassa concentrazione di acqua priva di nucleasi. </li><li> Eseguire la trascrizione inversa di RNA totale in DNA complementare (cDNA). Combinare non inferiore a 100 ng di RNA totale con tampone PCR, miscela dNTP (100 mM), primer esameriche casuali, trascrittasi inversa e acqua priva di nucleasi in un volume di reazione di 20 microlitri 24. Eseguire cicli RT secondo il protocollo del produttore. cDNA può essere immagazzinato a lungo termine a -20 ° C. </li><li> Diluire 20 reazioni microlitri a 100 microlitri con 80 ml di priva di nucleasi H 2 O. </li><li> Mescolare 5 ml di una fluorescenza a base di colorante intercalante 2x qPCR master mix, 0,06 ml di ogni 10 micron di primer, unnd 2 microlitri di reazione RT diluito per campione. </li><li> Eseguire qPCR secondo il protocollo del produttore per il master mix basato sulla fluorescenza. </li><li> Quantificare quantità relative di mRNA mediante il metodo CT delta e normalizzare a GAPDH. Tracciare l&#39;espressione dell&#39;mRNA medio di repliche biologiche ± deviazione standard per ciascun gruppo di trattamento. NOTA: devono essere prese precauzioni speciali quando si lavora con l&#39;RNA per evitare il contatto con RNasi, come l&#39;utilizzo della plastica e dei reagenti RNasi-free. materiali riutilizzabili devono essere trattati prima dell&#39;uso per rimuovere RNasi. </li></ol> 5. Immunofluorescenza <ol><li> Seguendo passo 3.6, supporti aspirato mediante aspirazione a vuoto da cellule RD in formato a 24 pozzetti. </li><li> Fissare cellule aggiungendo 500 ml di 4% paraformaldeide (PFA) per pozzetto ed incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT). Seguendo fissazione, Consiglio di cellule in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e conservare a 4 ° C per una notte, se necessario. </li><li> permeabilizecellule aggiungendo 500 ml di PBS + 0,2% Triton-X100 e incubare 30 minuti a temperatura ambiente. Mediante aspirazione a vuoto, rimuovere il tampone permeabilizzazione e lavare tre volte con PBS. </li><li> Blocco in 500 ml di 5% di albumina sierica bovina (BSA) / PBS e incubare le cellule per 30 minuti a RT. Cellule possono essere conservate a 4 ° C per una notte, se necessario. </li><li> Preparare la diluizione anticorpo primario. Pipettare 200 ml di 5% BSA / PBS per pozzetto in una conica 15 mL (12 pozzetti = 2,4 mL) e aggiungere 1 ml di anticorpo primario per ml di 5% BSA / PBS necessaria. Rimuovere tampone bloccante mediante aspirazione a vuoto e dispensare 200 microlitri di anticorpo primario diluito ad ogni pozzetto. <ol><li> Incubare le cellule in 1: 1.000 diluiti anticorpi primari in 5% BSA / PBS per 1 ora a RT o durante la notte a 4 ° C. Dopo l&#39;incubazione, lavare le cellule due volte con PBS. </li></ol></li><li> Preparare la diluizione anticorpo secondario nello stesso volume di 5% BSA / PBS come sopra. Aggiungere l&#39;anticorpo secondario rosso lontano colorante-coniugato con una diluizione 1: 2.000. Inoltre aggiungi1 mg / mL di Hoechst colorante per il mix. Rimuovere il PBS e aggiungere 200 ml di miscela per ogni pozzetto. <ol><li> Incubare a RT per 1 ora al buio. Lavare 3 volte con PBS, le cellule lasciare in PBS, e proteggere le cellule dalla luce con un foglio. Cellule possono essere conservate a 4 ° C, se necessario. </li></ol></li><li> celle di immagine a 400X ingrandimento totale con un microscopio a epifluorescenza invertita con lunghezza d&#39;onda di eccitazione 594 - 650 nm. </li></ol> 6. Western Blotting <ol><li> Lavare le cellule da 3.6 due volte con PBS ghiacciato. In ghiaccio, le cellule Lisare con 50 ml di 1x RIPA buffer di integrate con 1x cocktail di inibitori delle proteasi. </li><li> lisati Rock a 4 ° C per 15 min, raccolgono lisati in provette da 1,5 mL, e centrifugare ad alta velocità (20.000 xg) per 5 minuti per chiarire campioni. I lisati cellulari possono essere conservati a lungo termine a -80 ° C, se necessario. </li><li> Quantificare proteina totale utilizzando un saggio Bradford e un&#39;aliquota una pari quantità di proteina in nuove provette da microcentrifuga da 1,5 ml. Brincampioni g a parità di volume, con tampone RIPA e tampone di caricamento 3x Laemmli integrato con 2-mercaptoetanolo. </li><li> Incubare campioni in 1x Laemmli buffer di caricamento del campione per 5 min a 95 ° C ed eseguire SDS-PAGE usando un gel Tris-glicina 4-12% a 200 V per 45 minuti. La quantità di catene proteiche caricata a seconda della linea cellulare. In alcuni casi, è necessario 50-100 pg di proteina totale per rilevare E-caderina in cellule mesenchimali. </li><li> proteine ​​di trasferimento su una membrana di nitrocellulosa per 2 ore a 50 V in tampone di trasferimento 1x Tris-glicina. </li><li> Blocco membrana per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C in tampone bloccante BSA-based. </li><li> Diluire anticorpi primari a 1: 1.000 concentrazione in 5 mL di tampone bloccante, aggiungere diluizione alla membrana, e incubare con delicata dondolo per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C. membrana lavata 3 volte in PBS con 0,05% Tween-20. </li><li> Incubare membrane per 1 ora a temperatura ambiente con secondar fluorescente accoppiati infrarossiy anticorpo a 1: 20.000 diluizione nel tampone di bloccaggio come sopra. </li><li> Lavare membrana due volte in PBS con 0,05% Tween-20 e poi una volta in PBS. </li><li> Membrana Immagine utilizzando il rilevamento della fluorescenza a raggi infrarossi standard. </li></ol> 7. saggi crescita ancoraggio-indipendente NOTA: Per una dettagliata morbido protocollo del test agar, vedere 28. <ol><li> Calda sterile supporti 2x DMEM al 42 ° C in bagno di acqua calda. Durante questo tempo, il calore pre-autoclave 1% agarosio nel microonde per 3 minuti. Microonde per altri 30 s per volta, se necessario o fino a quando completamente sciolto. Spostare agarosio ad un bagno d&#39;acqua C 42 °. </li><li> Posizionare una provetta da 50 ml in un becher con 42 ° C acqua in una cappa sterile e mescolare 1% agarosio e supporti 2x DMEM in un rapporto 1: 1 contabilità per 1,5 ml di miscuglio per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Sempre preparare in più DMEM / agarosio per tenere conto di errori di pipettamento e per evitare le bolle. </li><li> Aggiungete il composto alpareti del pozzo, assicurando bolle si formano e lasciate riposare per 30 minuti a RT. </li><li> Mentre lo strato inferiore è solidificazione, preparare ciascun gruppo di cellule trasfettate RD nel passaggio 3 aspirando media e lavare una volta con 1 ml di PBS. Aspirare PBS e aggiungere 0,2 ml di 0,05% tripsina e incubare a 37 ° C per 5 min. </li><li> Neutralizzare tripsina in 0,8 mL di media e cellule Triturare per formare una cella singola sospensione. Trasferimento sospensione cellulare in un tubo da 15 ml. </li><li> Contare le cellule e calcolare il volume di sospensione cellulare richiesto per 10.000 cellule per pozzetto. </li><li> Riscaldare 0,6% agarosio nel microonde per 3 min, seguiti da 30 s alla volta fino completamente sciolto. Spostare agarosio a 42 ° C bagnomaria. </li><li> Posizionare una provetta da 50 ml in un becher con 42 ° C acqua in una cappa sterile. Mescolare 0,6% agarosio e sospensione cellulare diluita in un rapporto 1: 1 per preparare 1,5 ml di miscela per pozzetto in una piastra da 6 pozzetti. Sempre preparare sospensione cellulare extra / agarosio mix per tenere conto di errori pipettaggio eper evitare bolle. NOTA: E &#39;importante lavorare a 42 ° C qui. Se la temperatura è troppo bassa la miscela solidificare prima placcatura, e temperature superiori a 42 ° C influenzerà vitalità cellulare. </li><li> Mescolare bene triturando cellule diverse volte e aggiungere miscela di cellule nei pozzetti, garantendo che non forma bolle e lasciate solidificare per 20 minuti a RT. </li><li> Aggiungere 2 ml di media integrate ad ogni bene e passare piastre per incubatrice. <ol><li> Modificare i media una volta alla settimana per 3-4 settimane o fino a quando le colonie multicellulari formano. Fare attenzione a non toccare l&#39;agar quando si rimuove media da parte aspirazione a vuoto. In alternativa, utilizzare un P1000 per rimuovere lo strato superiore di liquidi. </li><li> Macchiare molli piastre di agar aggiungendo 200 ml di soluzione di cloruro Nitro Blu tetrazolo (1 mg / ml in PBS) e incubare la piastra per una notte a 37 ° C. Sostituire i media il giorno dopo con PBS per l&#39;imaging. </li><li> pozzi Immagine a 40X di ingrandimento totale di un microscopio invertito. </li><li> Eseguire l&#39;analisi su ImageJ per l&#39;area della colonia e il numero. Trama numero medio colonia di repliche biologiche ± deviazione standard. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

I sarcomi sono rari, ma altamente aggressivi tumori di un lignaggio mesenchimale. Nonostante la loro lignaggio mesenchimali, un sottogruppo di sarcomi sembra subire una transizione fenotipica ad un epiteliale stato simile più. Questo interruttore TEM-like ha rilevanza prognostica, come pazienti con più tumori epiteliali-simili sono meno aggressivi 24. Nonostante la loro rilevanza clinica, ci sono pochi studi che riguardano i meccanismi molecolari mappa queste transizioni fenotipiche in sarcomi. <...

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Shenghan Xu
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Shengnan Xu

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Erratum: Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticità fenotipica si riferisce ad una transizione reversibile tra fenotipi cellulari, ed è generalmente suddiviso in due tipi, epiteliali-to-mesenchimale (EMT) transizioni e mesenchimali-to-epiteliale transizioni (TEM). Questa plasticità fenotipica gioca un ruolo importante nei normali processi di organismi multicellulari, come lo sviluppo e la guarigione della ferita 1; tuttavia, questi stessi percorsi e programmi di espressione genica può anche portare a malattie come la fibrosi (valutata in 2, 3, 4) e carcinoma metastasi (valutata in riferimento 5, 6, 7, 8). Durante la metastasi, per esempio, EMT sconvolge la polarità delle cellule, le interazioni cellula-cellula, e promuove l&#39;invasione 9, 10. Insieme, EMT contribuires ad uno stato fenotipico che facilita la diffusione delle cellule tumorali. Inoltre, EMT comporta anche una serie di altre alterazioni fenotipiche che guidano un fenotipo aggressivo, tra deregolazione del metabolismo delle cellule del cancro 6, lo sviluppo di resistenza ai farmaci 11, 12, maggiore capacità tumore-apertura 13, 14 e ospitare evasione immune 15. plasticità fenotipica è stato ben studiato nella progressione carcinoma; Tuttavia, sarcomi presentano inoltre plasticità fenotipica. È interessante notare che sembra come se alcuni degli stessi conducenti di plasticità fenotipica in carcinomi contribuiscono anche al sarcoma plasticità e l&#39;aggressività. Ad esempio, è stato dimostrato cellule tumorali circolanti (CTC) di pazienti con sarcoma di esprimere EpCAM, una proteina di superficie cellulare che si trova in genere su cellule epiteliali 16. Addizionale, 250 campioni sarcomi dei tessuti molli sono stati classificati come epiteliali simile o mesenchimali come base di espressione genica. I pazienti nella firma biomarker epiteliale simile hanno avuto una prognosi migliore rispetto ai pazienti con la firma biomarcatore mesenchimali simil-17. Ciò è coerente con molti carcinomi, in cui i pazienti con più carcinomi epiteliali-come hanno risultati migliori rispetto ai pazienti con più tumori mesenchimali simil-18. Mentre alcuni sarcomi visualizzano biomarker e percorsi di espressione genica coerenti con il TEM, le basi molecolari di questa plasticità fenotipica rimangono poco compresi. Per studiare i meccanismi e gli autisti di MET nel sarcoma abbiamo sviluppato un modello di induzione MET usando due fattori specifici epiteliali, il microRNA (miR) -200 famiglia e grainyhead-like 2 (GRHL2). I miR-200 sono una famiglia di piccoli RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione genica legandosi alla UTR di messen 3&#39;ger RNA e prevenire traduzione in proteina. La famiglia miR-200 è costituito da due sottogruppi - uno contenente miR-141 e miR-200a, e l&#39;altro tra cui miR-200b, 200c-miR, e miR-429. I membri della famiglia miR-200 sono arricchite nei tessuti epiteliali, e la perdita di miR-200 è associata con metastasi nei carcinomi 19. La famiglia miR-200 è anche downregulated in sarcomi dei tessuti molli rispetto al tessuto normale 20. Simile alle MIR-200s, GRHL2 è un regolatore chiave che è importante per lo sviluppo epiteliale 21. Il fattore di trascrizione GRHL2 agisce in due modi per upregulate geni epiteliali, come E-caderina: 1) Nelle cellule epiteliali, GRHL2 reprime direttamente il principale regolatore EMT, ZEB1 22; e 2) GRHL2 direttamente attiva la trascrizione dei geni epiteliali 23. Le nostre indagini precedenti hanno dimostrato che l&#39;espressione combinata di miR-200 e GRHL2 in cellule di sarcomainduce un fenotipo MET simile 24. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per creare un modello in vitro del TEM induzione in cellule di sarcoma usando l&#39;espressione ectopica di miR-200 e GRHL2.

<table><tbody><tr><td>Contatore automatizzato Countess</td><td>Life technologies</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Vetrini per camera di conteggio cellulare Countess</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler</td><td>Thermo Fisher</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Fc</td><td>LI-COR Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ViiA7 Sistema di PCR in tempo reale</td><td>Thermo Fisher</td><td>4453536</td><td></td></tr><tr><td>PCR micropiastra</td><td>Corning</td><td>321-29-051</td><td></td></tr><tr><td>KAPA SYBR Kit qPCR universale veloce</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4602</td><td></td></tr><tr><td>Blocco iniziale (PBS) Tampone di blocco</td><td>Thermo Fisher</td><td>37538</td><td>Tampone di blocco a base di BSA</td></tr><tr><td>Agarosio Uso generale LE</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0732</td><td>Tampone di corsa</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>161-0734</td><td>Tampone di trasferimento</td></tr><tr><td>RIPA</td><td>Buffer Sigma Life Sciences</td><td>SLBG8489</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Protran 0.45 &mu; m nitrocellulosa</td><td>GE Healthcare Lifesciences</td><td>10600012</td><td></td></tr><tr><td>Kit MiniPrep Quick-RNA</td><td>Genesee Scientific</td><td>11-358</td><td></td></tr><tr><td>Laemmli Sample Buffer (4X)</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Protean Tetra Cell</td><td>Bio-Rad Laboratories Inc</td><td>1658005EDU</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Life technologies</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine RNAi Max</td><td>Thermo Fisher</td><td>13778150</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000 Ragents</td><td>Thermo Fisher</td><td>11668019</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina Streptomicina</td><td>Life technologies</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>miRVana miRNA miRNA mimic controllo negativo #1</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464058</td><td>neg miRNA</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miMike</td><td>Thermo Fisher</td><td>4464066</td><td>miR200A</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miMik</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200B</td></tr><tr><td>has-miR-200 mirVana miRNA miMike</td><td>Thermo Fisher</td><td>4404066</td><td>miR200C</td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life technologies</td><td>11088-021</td><td>terreni senza siero</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Ecaderina</td><td>BD Bioscience</td><td>610182</td><td></td></tr><tr><td>anti-beta actina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-69879</td><td></td></tr><tr><td>anti-EpCam</td><td>Ab Serotec</td><td>MCA18706</td><td></td></tr><tr><td>anti-ZO1</td><td>Invitrogen</td><td>402200</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 800W</td><td>LI-COR Inc</td><td>925-32210</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680</td><td>LI-COR Inc</td><td>926-32223</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>A211241</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio AlexaFluor 647</td><td>Thermo Fisher</td><td>ab150075</td><td></td></tr><tr><td>Halt Proteasi e Inibitore della fosfasi</td><td>Thermo Fisher</td><td>1861281</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Dual Color</td><td>Bio-Rad Laboratori Inc</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>Partec CellTrics</td><td>Sysmex</td><td>04-004-2326</td><td>30 &mu; m filtro per flusso</td></tr><tr><td>GAPDH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>AGCCACATCGCTCAGACAC</td></tr><tr><td>GAPDH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>GCCCAATACGACCAAATCC</td></tr><tr><td>Ecadherin-F</td><td>IDT</td><td></td><td>TGGAGGAATTCTTGCTTTGC</td></tr><tr><td>Ecadherin-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGCTCTCCCCAAGAAAC</td></tr><tr><td>ZEB1-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GCATACAGAACCCAACTTGAACGTC</td></tr><tr><td>ZEB1-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CGATTACACCCAGACTGC</td></tr><tr><td>NOTCH-F</td><td>IDT</td><td></td><td>GGCAATCCGAGGACTATGAG</td></tr><tr><td>NOTCH-R</td><td>IDT</td><td></td><td>CTCAGAACGCACTCGTTGAT</td></tr><tr><td>nitro blu tetrazolio&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>N5514</td><td></td></tr><tr><td>bromuro di esadimetrina</td><td>Sigma</td><td>H9268</td> siringa <td>in polibrene</td></tr><tr><td>da 3 mL</td><td>BD Bioscience</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Filtro per siringa sterile</td><td>VWR</td><td>28145-505</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria</td>a<td>fondo tondo in polipropilene da 5 ml</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione inversa di cDNA ad alta capacità</td><td>Thermo Fisher</td><td>Kit di trascrizione inversa</td> <td>4368814</td></tr><tr><td>4% paraformaldiide</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-281612</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Sigma</td><td>93443</td><td></td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A7906</td><td></td></tr></tbody></table>

induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

Induction of Mesenchymal-Epithelial Transitions in Sarcoma Cells

plasticità fenotipica si riferisce a un fenomeno in cui le cellule transitoriamente ottenere tratti di un altro lineage. Durante la progressione del carcinoma, plasticità fenotipica spinge l&#39;invasione, la diffusione e le metastasi. Infatti, mentre la maggior parte degli studi di plasticità fenotipica sono stati nel contesto di carcinomi epiteliali derivate, si scopre sarcomi, che sono mesenchimali in origine, anche esibire plasticità fenotipica, con un sottoinsieme di sarcomi subire un fenomeno che assomiglia a un mesenchymal- transizione epiteliale (TEM). Qui, abbiamo sviluppato un metodo comprendendo la famiglia miR-200 e grainyhead-like 2 (GRHL2) per imitare questo fenomeno MET-come osservato nel sarcoma paziente samples.we sequenzialmente esprimono GRHL2 e la famiglia miR-200 utilizzando la trasduzione delle cellule e trasfezione, rispettivamente , per meglio comprendere le basi molecolari di queste transizioni fenotipiche in cellule di sarcoma. cellule di sarcoma che esprimono miR-200 e GRHL2 hanno dimostrato una maggiore caratteristica atmosfera epitelialeCI della morfologia cellulare e le modificazioni del epiteliali e mesenchimali biomarker. Studi futuri usando questi metodi possono essere utilizzati per comprendere meglio le conseguenze fenotipiche dei processi MET simili su cellule di sarcoma, quali la migrazione, invasione, propensione metastatica, e resistenza alla terapia.

Schema per l&#39;induzione MET in cellule di sarcoma Una cronologia generale per l&#39;induzione di modifiche MET simili in cellule di sarcoma è mostrato in Figura 1. Il protocollo inizia trasduzione GRHL2 (Figura 1A), seguita da trasfezione della famiglia miR-200 (Figura 1B). familiari GRHL2 o miR-200 non erano in grado di influenzare l&#39;aspetto delle cellule RD quando espres...

Presentiamo qui un metodo di coltura cellulare per indurre transizioni mesenchimali-epiteliale (MET) in cellule di sarcoma basato su espressione ectopica combinata di microRNA-200 familiari e grainyhead-like 2 (GRHL2). Questo metodo è adatto per una migliore comprensione dell&#39;impatto biologico della plasticità fenotipica sull&#39;aggressività cancro e trattamenti.

Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

Phenotypic plasticity refers to a phenomenon in which cells transiently gain traits of another lineage. During carcinoma progression, phenotypic ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare le conseguenze fenotipiche delle transizioni mesenchimale-epiteliali nei sarcomi. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali sul perché i sarcomi di tipo epiteliale abbiano esiti migliori rispetto ai sarcomi di tipo più mesenchimale. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un mezzo semplice e riproducibile per studiare le reti di regolazione genica a valle e i fenotipi associati alle transizioni mesenchimale-epiteliali nei sarcomi.Comprendendo meglio la plasticità fenotipica nei sarcomi, speriamo di identificare interventi terapeutici che ci permettano di indirizzare i sarcomi verso uno stato più indolente di tipo epiteliale. A dimostrazione della procedura saranno due studenti universitari del nostro laboratorio, Jackson Xu e Shivee Gilja. Nel primo giorno della trasduzione, piastrare tre volte 10 alla quinta cellule HEK293T in ciascuna delle due pozzette di una piastra a sei pozzette in due millilitri di DMEM integrato.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica. Dopo aver coltivato durante la notte, esaminare le cellule al microscopio. Queste dovrebbero essere confl

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Biologia dello sviluppo

Un metodo semplice è descritto per l'induzione della transizione epitelio mesenchimale (EMT) in una varietà di tipi cellulari. Metodi per l'analisi di cellule in EMT stati di immunocitochimica sono inclusi.

Induzione e Analisi dei epiteliale a Mesenchymal Transizione

Ingegneria tessutale fibroblasti derivati ​​da matrice nativa è uno strumento emergente per generare un substrato stromale che supporta la proliferazione delle cellule epiteliali e differenziazione. Ecco un protocollo di applicazione di tale metodologia per valutare l'impatto dei diversi tipi di cellule stromali sulla biologia delle cellule tumorali è presentato.

Ingegneria dei tessuti del tumore stromale Microenvironment con l&#39;applicazione di Invasion Cancer Cell

È stato dimostrato che la regolazione alternativa dello splicing contribuisce alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo un metodo che utilizza un modello EMT inducibile per il rilevamento di splicing alternativo durante l'EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Qui, descriviamo lo sviluppo e l'applicazione di un test di contrazione del gel per valutare la funzione contrattile nelle cellule mesenchimali che hanno subito una transizione epitelio-mesenchimale.

Sviluppo di un<em&gt; In Vitro</em&gt; Test per valutare funzione contrattile del mesenchimali Le cellule che sono stati sottoposti a transizione epitelio-mesenchimali

La transizione da epiteliale a mesenchimale (EMT) consente ai tumori di diventare invasivi. Per studiare l'EMT, viene descritto un modello in vitro basato su cellule staminali neurali (NSC) privo di siero ed enzimi. Questo sistema standardizzato consente la valutazione quantitativa e qualitativa della migrazione cellulare, dell'espressione genica e proteica. Il modello è adatto per la scoperta di farmaci.

Un modello enzima e Neural Stem Cell Culture siero-libero per EMT Investigation Adatto per Drug Discovery

Iniezione diretta di cancro-derivato di vescicole extracellulari (SVE) conduce alla riprogrammazione del midollo osseo, sostenendo la progressione del tumore; Tuttavia, le celle che mediano questo effetto è poco chiaro. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per studiare EV-mediata di cellule staminali tumorali mesenchimali (MSC) interazioni in vivo, rivelando un ruolo cruciale per MSCs EV-educato in metastasi.

Un modello murino preclinico di Osteosarcoma per definire la comunicazione mediata della vescicola extracellulare tra tumore e cellule staminali mesenchimali

Descriviamo un protocollo dettagliato per l'isolamento delle cellule che hanno invitato il tumore dalle cellule tumorali che hanno avuto l'ecosmia torace dal paziente xenografti derivati dal paziente mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza, usando l'antigene leucocito umano-1 (HLA-1) come marcatore negativo, e per l'ulteriore convalida e caratterizzazione di queste cellule tumorali hLA-1-negative.

Isolamento e caratterizzazione delle cellule che invitano il tumore dalle cellule che hanno invitato il tumore da Sarcoma Xenotrapianto derivato dal paziente

Un protocollo per l'induzione in vitro di transizione endoteliali mesenchimali (EndMT), che è utile per investigare le vie di segnalazione cellulare coinvolti nella EndMT, è descritto. In questo modello sperimentale, EndMT è indotta dal trattamento con TGF-β in cellule endoteliali MS-1.

Analisi molecolare di transizione endoteliali mesenchimali indotta dalla trasformazione di segnalazione di fattore di crescita-β

Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.

Modello di matrice extracellulare tridimensionale dell'osso per Osteosarcoma

Descriviamo un flusso di lavoro sistematico per indagare la segnalazione di TGF-β e l'EMT indotto da TGF-β studiando l'espressione proteica e genica coinvolta in questa via di segnalazione. I metodi includono western blotting, un saggio di reporter luciferasi, qPCR e colorazione immunofluorescenza.

Studio della segnalazione β TGF e della transizione epiteliale-mesenchimale indotta da TGF-β nel cancro al seno e nelle cellule normali

Il presente protocollo descrive la messa a punto di colture 3D "on top " di una linea cellulare epiteliale mammaria non trasformata, MCF10A, che è stata modificata per studiare la trasformazione indotta dal fattore attivante piastrinico (PAF). L'immunofluorescenza è stata utilizzata per valutare la trasformazione ed è discussa in dettaglio.

Trasformazione indotta dal mediatore dei fosfolipidi in colture tridimensionali

Scopri come indurre la transizione mesenchimale-epiteliale nelle cellule di sarcoma usando microRNA-200 e GRHL2. Questo metodo riproducibile aiuta a studiare le reti di regolazione genica e a identificare nuove strategie terapeutiche per migliorare gli esiti clinici.

Induzione di mesenchimali-epiteliale transizioni in cellule di sarcoma

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