Name: Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 33 s
Description: Scopri due metodi per isolare DNA organellare di alta qualità da tessuto fogliare vegetale: centrifugazione differenziale e meta frazionamento. Queste tecniche permettono analisi genomiche accurate per studi di biologia vegetale.

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Vorremmo riconoscere i finanziamenti del Dipartimento per l&#39;Agricoltura-Agricoltura del Dipartimento degli Stati Uniti e della National Science Foundation (IOS 1025881 e IOS 1361554). Ringraziamo R. Caspers per la manutenzione delle serre e la cura delle piante. Ringraziamo anche l&#39;Università del Minnesota Genomics Center, dove sono stati eseguiti i preparativi e la sequenza delle biblioteche Illumina. Siamo anche grati per i commenti dei redattori e dei quattro recensori anonimi che hanno ulteriormente rafforzato il nostro manoscritto. Ringraziamo anche l&#39;OCSE per una borsa di studio alla SK per integrare questi protocolli per progetti di collaborazione con i colleghi in Giappone.

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<li>Iorizzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+assembly+of+the+carrot+mitochondrial+genome+using+next+generation+sequencing+of+whole+genomic+DNA+provides+first+evidence+of+DNA+transfer+into+an+angiosperm+plastid+genome%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">De novo assembly of the carrot mitochondrial genome using next generation sequencing of whole genomic DNA provides first evidence of DNA transfer into an angiosperm plastid genome.</a> BMC Plant Biol. 12 (61), 1-17 (2012).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+sequences+of+organelle+genomes+from+the+medicinal+plant+Rhazya+stricta+%28Apocynaceae%29+and+contrasting+patterns+of+mitochondrial+genome+evolution+across+asterids%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Complete sequences of organelle genomes from the medicinal plant Rhazya stricta (Apocynaceae) and contrasting patterns of mitochondrial genome evolution across asterids.</a> BMC Genomics. 15 (405), 1-18 (2014).</li>
<li>Skippington, E., Barkman, T. J., Rice, D. W., Palmer, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+mitogenome+of+the+parasitic+plant+Viscum+scurruloideum+is+extremely+divergent+and+dynamic+and+has+lost+all+nad+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Miniaturized mitogenome of the parasitic plant Viscum scurruloideum is extremely divergent and dynamic and has lost all nad genes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (27), E3515-E3524 (2015).</li>
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<li>Eubel, H., Heazlewood, J. L., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+plant+mitochondria+for+proteomic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of plant mitochondria for proteomic analysis.</a> Methods Mol Biol. 355, 49-62 (2007).</li>
<li>Hao, W., Fan, S., Hua, W., Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+extraction+and+assembly+methods+for+simultaneously+obtaining+plastid+and+mitochondrial+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Effective extraction and assembly methods for simultaneously obtaining plastid and mitochondrial genomes.</a> PLoS One. 9 (9), e108291(2014).</li>
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Gli autori dichiarano di non avere interessi in gioco. La menzione dei nomi commerciali o dei prodotti commerciali della presente pubblicazione è esclusivamente ai fini della fornitura di informazioni specifiche e non implica raccomandazione o approvazione da parte del Dipartimento dell&#39;agricoltura USA. USDA è un fornitore di pari opportunità e datore di lavoro.

Ad oggi, la maggior parte degli studi organizzativi di sequenziamento si concentra sui metodi DC tradizionali per arricchire il DNA specifico. Sono stati descritti metodi per isolare gli organelli da diverse piante, tra cui il muschio 40 ; Monocots come il grano 15 e l&#39;avena 11 ; E dicoti come arabidopsis 11 , girasole 17 e colza 14 . La maggior parte dei protocolli si conce...

<html> Il sequenziamento del genoma è un potente strumento per disseccare la base genetica sottostante di importanti tratti vegetali. La maggior parte degli studi di sequenziamento genomico si concentra sul contenuto del genoma nucleare, in quanto la maggioranza dei geni si trova nel nucleo. Tuttavia, i genomi organellari, inclusi i mitocondri (attraverso eucarioti) e plastidi (in piante, la forma specializzata, il cloroplasto, funzionano in fotosintesi) contribuiscono a fornire notevoli informazioni genetiche fondamentali per lo sviluppo organico, la risposta allo stress e la forma fisica1 . I genomi organellari sono tipicamente inclusi nelle estrazioni totali del DNA destinate al sequenziamento del genoma nucleare, anche se vengono impiegati anche metodi per ridurre i numeri degli organeli prima dell&#39;estrazione del DNA 2 . Molti studi hanno utilizzato risultati di sequenziamento delle estrazioni totali di gDNA per assemblare genomi organistici 3 , 4 , 5 ,xref &quot;&gt; 6, 7. Tuttavia, quando l&#39;obiettivo dello studio è di concentrarsi su genomi organellari, utilizzando il totale gDNA aumenta i costi di sequenziamento perché molti letture sono &#39;perso&#39; per le sequenze di DNA nucleare, in particolare in impianti di grandi genomi nucleari Inoltre, a causa della duplicazione e del trasferimento di sequenze organellari nel genoma nucleare e tra gli organelli, risolvendo la corretta posizione di mappatura del sequenziamento legale al genoma corretto è bioinformatica impegnativa 2 , 8. La purificazione dei genomi organellari dal genoma nucleare è una Strategia per ridurre questi problemi.Per ulteriori strategie di bioinformatics possono essere utilizzati per separare le letture che mappano alle regioni di omologia tra i mitocondri ei cloroplasti. Mentre i genomi organellari da molte specie vegetali sono stati sequenziati, poco si sa sulla larghezza della diversità genomica organellareDisponibile in popolazioni selvatiche o in piscine coltivate. I genomi organellari sono noti anche per essere molecole dinamiche che subiscono un significativo riarrangiamento strutturale a causa della ricombinazione tra sequenze di ripetizione 9 . Inoltre, molte copie del genoma organellare sono contenute all&#39;interno di ciascuna organella e sono presenti più organelli all&#39;interno di ciascuna cellula. Non tutte le copie di questi genomi sono identiche, che è conosciuto come eteroplasma. Contrariamente all&#39;immagine canonica di &quot;cerchi master&quot;, ora si registra una crescente evidenza per un quadro più complesso di strutture del genoma organellare, compresi cerchi subgenomiali, cromosomi lineari, concatamers lineari e strutture ramificate 10 . L&#39;assemblaggio di genomi organellari vegetali è ulteriormente complicato dalle loro dimensioni relativamente grandi e dalle sostanziali ripetizioni invertite e dirette. Protocolli tradizionali per l&#39;isolamento organellare, la purificazione del DNA e il genoma successivo<html> I sequenziamenti sono spesso ingombranti e richiedono grandi volumi di input tissutale, con diversi grammi in aumento di centinaia di grammi di tessuti fogliari giovani necessari come punto di partenza 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Questo rende il sequenziamento del genoma organellare inaccessibile quando il tessuto è limitato. In alcune situazioni, gli importi dei semi sono limitati, ad esempio quando è necessario sequenziare su base generazionale o in linee sterili maschili che devono essere mantenute attraverso l&#39;attraversamento. In queste situazioni, il DNA organellare può essere purificato e quindi sottoposto ad amplificazione del genoma intero. Tuttavia, l&#39;amplificazione del genoma intero può introdurre significative bias di sequenziamento, che costituisce un problema particolare nella valutazione della variazione strutturale, delle strutture subgenomiche e dei livelli di eteroplasmi&gt; 18. I recenti progressi nella preparazione della biblioteca per le tecnologie di sequenza brevettate hanno superato le barriere a basso input per evitare l&#39;amplificazione del genoma intero. Ad esempio, il kit di preparazione alla libreria Illumina Nextera XT consente di utilizzare fino a 1 ng di DNA come input 19 . Tuttavia, le preparazioni standard di libreria per applicazioni di sequenziamento a lungo lette, come le tecnologie di sequenziamento PacBio o Oxford Nanopore, richiedono ancora una quantità relativamente elevata di DNA di input, che può rappresentare una sfida per il sequenziamento del genoma organellare. Recentemente, sono stati sviluppati nuovi protocolli di sequencing realizzati a livello manuale per ridurre gli importi e contribuire a facilitare il sequenziamento dei genomi nei campioni in cui è difficile ottenere quantità di DNA di microgrammi 20 , 21 . Tuttavia, ottenendo frazioni organolari puri ad alto peso molecolare per alimentare questi preparati alla libreria rimane una sfida. Abbiamo cercato tO confrontare e ottimizzare i metodi di arricchimento e isolamento del DNA organellare adatti a NGS senza la necessità di amplificazione del genoma intero. In particolare, il nostro obiettivo era quello di determinare le migliori pratiche per arricchire il DNA organellare a peso molecolare dai materiali di partenza limitati, ad esempio un sottoinsieme di foglia. Questo lavoro presenta un&#39;analisi comparativa dei metodi da arricchire per il DNA organellare: (1) un protocollo di centrifugazione differenziale tradizionale modificato rispetto a (2) un protocollo di frazionamento del DNA basato sull&#39;uso di un approccio pulldown di proteine ​​del dominio di DNA di CpG 22 applicato al tessuto vegetale 23 . Raccomandiamo le migliori pratiche per l&#39;isolamento del DNA organellare da tessuti di foglie di grano, che possono essere facilmente estesi ad altre piante e tipi di tessuti.

<table><tbody><tr><td>Il 2-mercaptoetanolo (beta-mercaptoetanolo; BME)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ml</td><td></td></tr><tr><td>2-propanolo (alcool isopropilico/isopropanolo), bioreagente</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I9516</td><td></td></tr><tr><td>agarosio, Bio-Rad Cetified Megabase agarosio</td><td>Bio-Rad</td><td>1613108</td><td></td></tr><tr><td>bilancia</td><td>analitica Mettler Toledo</td><td>AB54-S</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Mettler Toledo</td><td>PB1502-S</td><td></td></tr><tr><td>siero bovino albumina (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>Cilindri di macinazione in ceramica, 3/8" x 7/8"</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2183</td><td></td></tr><tr><td>Blocchi criogenici compatibili con omogeneizzatore tissutale per contenere provette da 50 mL</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2664</td><td></td></tr><tr><td>DNaseI</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>etanolo, assoluto</td><td>Decon Laboratories</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiammina tetraacetico (EDTA), soluzione 0,5 M, pH 8,0</td><td>Fisher</td><td>BP2482-500</td><td></td></tr><tr>sistema <td></td><td></td><td></td><td>di imaging su gel</td></tr><tr><td>colorante</td><td></td><td></td><td>per gel come GelRed o Ethidium Bromide</td></tr><tr><td>grinding pestile, punta larga per provette</td><td></td><td></td><td></td>coniche da 2 mL</tr><tr><td>Guanidina-HCl, soluzione 8 M</td><td>ThermoFisher</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 SYBR Green I Master</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td></td></tr><tr><td>azoto</td><td></td><td></td><td></td>liquido</tr><tr><td>Enzimi lissanti da Trichoderma harzianum</td><td>Sigma</td><td>L1412</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>G Bioscience</td><td>24115</td><td></td></tr><tr><td>rack magnetico</td><td>ThermoFisher</td><td>A13346</td><td></td></tr><tr><td>provette per microcentrifuga, LoBind 1,5 mL&nbsp;</td><td>Provette</td> per microcentrifuga Eppendorf <td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>, standard da 1,5 mL senza nucleasi</td> Microcentrifuga <td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, refrigerata</td><td>Sorvall&nbsp;</td><td>Legend X1R</td><td>O prodotto equivalente, deve essere in grado di raggiungere almeno 18.000 x g con rotori per provette da 50 mL, provette Oak Ridge e provette da 1,5 mL</td></tr><tr><td>per microcentrifuga, temperatura ambiente</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>O prodotto equivalente, deve essere in grado di raggiungere almeno 18.000 x g con rotore per provette da microcentrifuga da 1,5 mL e 2 mL</td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Microcon DNA Unità filtranti centrifughe a flusso rapido</td><td>EMD Millipore</td><td>MRCFOR100</td><td></td></tr><tr><td>Miracloth, 1 quadrato per campione tagliato per adattarsi all'imbuto</td><td>EMD Millipore</td><td>475855</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Microbiome DNA Enrichment Kit New</td><td>England Biolabs</td><td>E2612L</td><td></td></tr><tr><td>parafilm</td><td>Parafilm M</td><td>PM992</td><td></td></tr><tr><td>vasi e vassoi</td><td></td><td></td><td></td>in plastica</tr><tr><td>polivinilpirrolidone (PVP)</td><td>Fisher</td><td>BP431-100</td><td></td></tr><tr><td>Proteinasi K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>Impianto di elettroforesi su gel a campo pulsato (ad es. CHEF DR III)</td>perle di purificazione per <td>1703697</td><td></td> <td>Bio-Rad</td></tr><tr><td>, perline Agencourt AMpureXP,</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>Kit QIAamp DNA,</td><td>Qiagen</td><td>51304</td><td></td></tr>, <tr><td>Qiagen 20/g Kit di estrazione del DNA con punta genomica</td>, <td>Qiagen</td><td>10223</td><td></td></tr>, <tr><td>Qiagen Buffer EB (tampone di eluizione)</td><td>Qiagen</td><td>19086</td><td></td></tr><tr><td>Set di tamponi per l'estrazione del DNA</td><td>Qiagen Qiagen</td><td>19060</td><td></td></tr><tr><td>QiaRack</td><td>Qiagen</td><td>19015</td><td></td></tr><tr><td>qPCR machine (ad es. Roche Light Cycler 480)</td><td>Roche</td> qPCR plate sealing film Roche <td></td><td></td></tr> 4729757001 <tr><td>qPCR plate,</td><td>Roche</td><td></td> 96 pozzetti piastra Roche 4729692001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Qubit&nbsp; provette per saggi</td><td>Life Technologies</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Kit per saggi ad ampio spettro Qubit</td><td>Life Technologies</td><td>Q32850</td><td></td></tr><tr><td>Kit per saggi Qubit ad alta sensibilità</td><td>Life Technologies</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>RNaseA</td><td>Qiagen</td><td>19101</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sierologiche (20 mL) e pipettatore</td><td>Fisher</td><td>13-678-11</td><td></td></tr><tr><td>Piccoli imbuti, 1 per campione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Ambion</td><td>AM9759</td><td></td></tr><tr><td>Pennello morbido, 2 per campione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>SPEX SamplePrep 2010 Geno/Grinder o un altro tipo di omogeneizzatore tissutale</td><td>SPEX SamplePrep</td><td></td><td>O un altro omogeneizzatore tissutale comparabile. Se non si ha accesso a un omogeneizzatore di tessuti, sarà sufficiente macinare in un mortaio e un pestello pre-raffreddati (vedere il protocollo per i dettagli). Tuttavia, un omogeneizzatore darà risultati più coerenti e il tempo totale di omogeneizzazione sarà ridotto.</td></tr><tr><td>Termomiscelatore</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Saccarosio</td><td>Omnipure</td><td>8550</td><td></td></tr><tr><td>TBE</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>T2819-100ml</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>provette rotanti</td><td></td><td></td><td></td>per provette</tr><tr><td>, 50 mL polipropilene conico</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>provette, 50 mL di polipropilene ad alta velocità&nbsp;</td><td>ThermoScientific/Nalgene</td><td>3119-0050</td><td>ad es. tubi Nalgene Oakridge o acqua equivalente</td></tr><tr><td>per bagnomaria</td><td></td><td></td><td></td>in</tr><tr><td>vermiculite</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, sterile e certificata senza nucleasi&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>1481</td><td></td></tr><tr><td>acqua, sterile milliQ</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del dna organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Optimization and Comparative Analysis of Plant Organellar DNA Enrichment Methods Suitable for Next-generation Sequencing

I genomi organellari delle piante contengono grandi elementi ripetitivi che possono subire un accoppiamento o una ricombinazione per formare strutture complesse e / o frammenti subgenomici. Anche i genomi organistici esistono in aggiunte all&#39;interno di una determinata cellula o tipo di tessuto (eteroplasma) e un&#39;abbondanza di sottotipi può cambiare durante lo sviluppo o quando è sotto lo stress (spostamento sotto-stechiometrico). Sono necessarie tecnologie di sequenziamento di nuova generazione (NGS) per ottenere una comprensione più approfondita della struttura e della funzione del genoma organellare. Gli studi di sequenziamento tradizionali utilizzano diversi metodi per ottenere DNA organellare: (1) Se viene utilizzata una grande quantità di tessuto di partenza, viene omogeneizzata e sottoposta a centrifugazione differenziale e / o depurazione gradiente. (2) Se si utilizza una quantità minore di tessuti ( cioè, se i semi, il materiale o lo spazio sono limitati), lo stesso processo viene eseguito come in (1), seguito da un&#39;amplificazione del genoma completa per ottenere un DNA sufficiente. (3) L&#39;analisi di bioinformatica può essere usata per seqIl DNA totale genomico e per analizzare le letture organellari. Tutti questi metodi hanno sfide intrinseche e compromessi. In (1), può essere difficile ottenere una così grande quantità di tessuto di partenza; In (2), l&#39;amplificazione del genoma intero potrebbe introdurre una bias di sequenziamento; E in (3), l&#39;omologia tra genomi nucleari e organellari potrebbe interferire con l&#39;assemblaggio e l&#39;analisi. Nelle piante con grandi genomi nucleari è vantaggioso arricchire il DNA organellare per ridurre i costi di sequenza e la complessità delle sequenze per le analisi di bioinformatica. Qui confrontiamo un tradizionale metodo di centrifugazione differenziale con un quarto metodo, un approccio adattato CpG-metile, per separare il DNA genomico totale in frazioni nucleari e organellari. Entrambi i metodi forniscono un sufficiente DNA per NGS, DNA che è altamente arricchito per sequenze organellari, anche se a diversi rapporti nei mitocondri e nei cloroplasti. Presentiamo l&#39;ottimizzazione di questi metodi per i fogli di frumento e discutere di importanti vantaggi e dI vantaggi di ogni approccio nel contesto dell&#39;input di campionamento, della facilità di protocollo e dell&#39;applicazione a valle.

I protocolli presentati in questo manoscritto descrivono due metodi distinti per arricchire il DNA organellare dai tessuti vegetali. Le condizioni qui presentate riflettono l&#39;ottimizzazione del tessuto di grano. Un confronto tra i passaggi chiave nei protocolli, l&#39;input richiesto e l&#39;output del DNA sono descritti in Figura 1 . Le fasi del protocollo DC che abbiamo testato seguono condizioni simili a quelle descritte in precedenza ( <strong class=...

Viene presentato il confronto e l&#39;ottimizzazione di due metodi di arricchimento organellare del DNA vegetale: centrifugazione differenziale tradizionale e frazionamento del gDNA totale sulla base dello stato di metilazione. Valutiamo la quantità e la qualità del DNA risultanti, dimostriamo le prestazioni in sequenza di prossima generazione e discutiamo il potenziale di utilizzo in sequenza a lunga lettura di singole molecole.

Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

Plant organellar genomes contain large, repetitive elements that may undergo pairing or recombination to form complex structures and/or sub-genomic ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di confrontare due metodi utilizzati per isolare il DNA organellare di alta qualità, sia il DNA plastidico che il DNA mitocondriale, dal tessuto fogliare vegetale adatto al sequenziamento di nuova generazione. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave in biologia vegetale, come l'entità della diversità organellare tra i taxa e come i cambiamenti nella sequenza o nella struttura del genoma organellare influenzano lo sviluppo e la risposta allo stress. Confronteremo due tecniche, il metodo di centrifugazione differenziale che arricchisce per uno specifico tipo organellare e la tecnica di metafrazionamento che recupera il DNA organellare totale da campioni di tessuto congelato più piccoli.La procedura standard per la coltivazione di piantine di grano, è quella di piantare semi in vermiculite, in vasi quadrati con quattro o sei semi per angolo. Trasferisci i vasi in una serra con un ciclo di luce di 16 ore. Innaffia le piante ogni giorno.Concimare le piante con un quarto di cucchiaino di fertilizzante granulare 20-20-20 MPK dopo la germinazione e di nuovo a sette giorni dopo la germinazione. Per l'adulazione delle piantine di grano, piantare semi e prendersi cura delle piante come nella procedura standard. Ma metti i vasi in una camera di crescita buia.Un'alternativa alla coltivazione di queste piantine in una camera di crescita buia è quella di coprire le piante nella serra ma con un'adeguata ventilazione. Il primo passo di questa procedura è isolare gli organelli. Raccogli cinque grammi di fazzoletto fresco e sciacqualo in acqua fredda e sterile in un bicchiere freddo su ghiaccio.Con le forbici, tagliare il tessuto fogliare in pezzi di circa un centimetro direttamente in un tubo pre-raffreddato da 50 millimetri contenente due cilindri di macinazione in ceramica. Mantenere i campioni in ghiaccio durante tutta la procedura. Per evitare la contaminazione incrociata, è importante cambiare le forbici tra un campione e l'altro.Portare i campioni nella cappa aspirante e aggiungere 20 millilitri di tampone STE a ciascuna provetta da 50 millilitri. Posizionare i campioni in blocchi di macinazione criogenica pre-raffreddati in un apparecchio di macinazione tissutale e macinare i campioni per 30 secondi a 1.750 rotazioni al minuto. Mettere i campioni sul ghiaccio per circa un minuto.Ruotare le posizioni del campione e macinare per altri 30 secondi a 1.750 rotazioni al minuto. Rimetti i campioni nel secchiello del ghiaccio. Per ogni campione, inserire un imbuto in una provetta pulita da 50 millilitri posta nel ghiaccio e posizionare uno strato di panno filtrante nell'imbuto.Pre-bagnare il tessuto filtrante con cinque millilitri di tampone STE e risparmiare il flusso. Versare il fazzoletto omogeneizzato nell'imbuto. Sciacquare il tubo di macinazione con 15 millilitri di tampone STE, richiudere e capovolgere il tubo per sciacquare le pareti e il coperchio e versare il suo contenuto nell'imbuto.Rimuovere con cautela le pietre ceramiche, quindi strizzare e strizzare il panno filtrante nell'imbuto. Per evitare la contaminazione incrociata, cambiare i guanti tra un campione e l'altro. Avvolgere i tappi delle provette con pellicola di paraffina per evitare fuoriuscite.Centrifugare a 2.000 x G, a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica per aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet e posizionarlo in una provetta da centrifuga ad alta velocità da 50 millilitri con una guarnizione di tenuta ermetica. Metti un piccolo bicchiere di ghiaccio su una bilancia, strappa la bilancia e pesa ogni surnatante.Utilizzare il tampone STE per bilanciare le provette con una precisione di 0,1 grammi e centrifugare a 18.000 x G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine della centrifugazione, rimettere i campioni nella cappa aspirante ed eliminare il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone ST al pellet e risospendere delicatamente con un pennello morbido.Aggiungere 24 millilitri di tampone ST per ottenere un volume finale di 25 millilitri. Agitare delicatamente il pennello in sospensione per mescolare, quindi premere il pennello sul lato di un tubo per rimuovere tutto il liquido prima di rimuovere il pennello. Dopo aver bilanciato le provette, centrifugare a 18.000 x G a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Durante questa centrifugazione, preparare la soluzione 1 di DNA come descritto nel protocollo di testo e aliquotare 200 microlitri in una provetta da 1,5 millilitri per campione. Al termine della centrifugazione, eliminare il surnatante e tamponare la provetta. Ad ogni provetta da centrifuga ad alta velocità, aggiungere 300 microlitri di tampone STE e risospendere il pellet utilizzando un pennello morbido.Posizionare il pennello nella provetta da 1,5 millilitri precedentemente preparata contenente 200 microlitri di soluzione di DNA 1 e agitare il pennello per rimuovere eventuali residui di pellet bloccati nel pennello. Pipettare la soluzione 1 del DNA nella provetta da centrifuga ad alta velocità e agitare delicatamente per mescolare. Avvolgere la pellicola di paraffina attorno alla parte superiore di ogni provetta e incubare a 37 gradi Celsius a bagnomaria per 30 minuti.Durante l'incubazione, mescolare delicatamente roteando. Utilizzando un puntale per pipetta con un orifizio largo, pipettare delicatamente la miscela di pellet fuori dal tubo e posizionarla in un tubo a basso legame da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di EDTA da 400 millimolari, pH 8.0 alla provetta da centrifuga ad alta velocità.Pipettare delicatamente per rimuovere completamente il pellet residuo e trasferire l'EDTA nel tubo a basso legame contenente la miscela di pellet. Mescolare delicatamente per inversione. Centrifugare a 18.000 x G, a quattro gradi Celsius per 20 minuti.Successivamente, scartare il surnatante, tamponare ogni provetta e utilizzare immediatamente il pellet per l'isolamento del DNA. In questo metodo, il DNA organellare viene arricchito dal DNA genomico totale estratto utilizzando colonne di estrazione del DNA commerciali. Preparare la quantità richiesta di microsfere magnetiche legate alla proteina MBD2 FC, secondo le istruzioni del produttore e scalare le reazioni per utilizzare tra uno e due microgrammi di DNA totale in ingresso.In questa dimostrazione, sono necessari 160 microlitri di perline per un microgrammo di DNA totale in ingresso. Per catturare il DNA nucleare metilato, aggiungere un microgrammo di DNA in ingresso a una provetta contenente 160 microlitri di microsfere magnetiche legate a MBD2 per ogni singolo campione e pipettare delicatamente su e giù con una punta a foro largo. Aggiungere il volume appropriato di 5x tampone di lavaggio legante per una concentrazione finale di 1x e pipettare il campione su e giù con una punta a foro largo, alcune volte per mescolare.Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 15 minuti. Per il successo del pull down, è fondamentale mescolare accuratamente le perle durante l'incubazione, in particolare se c'è un aggregazione significativo delle perle. Per evitare l'aggregazione delle microsfere e per garantire l'estrazione verso il basso del DNA metilato, pipettare delicatamente i campioni con una punta per pipetta a foro largo e agitare i campioni due o tre volte durante l'incubazione.Far girare brevemente le provette contenenti la miscela di DNA e microsfere magnetiche. Posizionare le provette su una griglia magnetica per almeno cinque minuti per raccogliere le perle a lato delle provette. La soluzione dovrebbe apparire limpida, contiene DNA arricchito con organellare non metilato.Utilizzando punte a foro largo, rimuovere con cura il surnatante eliminato senza disturbare le perle e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da due millilitri pulita e a basso legante. Conservare i campioni a 20 o 80 gradi Celsius. Il test PCR acuto è stato impiegato per valutare le abbondanze relative di tre impliconi specifici per organelli nel DNA genomico totale e la frazione di DNA organellare ottenuta da entrambi i metodi.Nel complesso, i dati indicano che il metodo di centrifugazione differenziale arricchisce preferenzialmente i mitocondri. La frazione non metilata del DNA genomico totale metilfrazionato, mostra un sostanziale arricchimento di entrambi gli impliconi organellari. Le percentuali di reads mappate sui genomi di riferimento dei mitocondri o dei cloroplasti della primavera cinese e del grano coltivato da chris sono coerenti con i risultati della QPCR.La centrifugazione differenziale produce DNA che è più arricchito in DNA mitocondriale e il frazionamento metilale produce DNA che probabilmente riflette l'abbondanza nativa dei due genomi organellari. Le etichette dei campioni, tra cui E, designano i campioni idilliati e NE designano i campioni non idillati. È interessante notare che l'idillio non ha cambiato le abbondanze organellari.In entrambi i metodi, la copertura teorica dei genomi referenziati dai mitocondri o dai cloroplasti, supera la copertura di 100 volte, anche quando 12 librerie sono rimultiplexate. Il DNA genomico totale migra come striscio diffuso nell'elettroforesi su gel post-campo e supera le 50 kilobasi. La frazione nucleare dopo il metilfrazionamento diminuisce di dimensioni, ma rimane centrata intorno alle 50 kilobasi, suggerendo che il DNA metilfrattutato è più adatto per il sequenziamento a lettura lunga.Una volta padroneggiate, entrambe le tecniche di estrazione del DNA organellare possono essere eseguite in uno o due giorni, dalla raccolta del campione alla valutazione del prodotto finale, se eseguite correttamente. La tecnica del metilfrazionamento ha il potenziale per espandere notevolmente la gamma di studi del DNA organellare a campioni rari e difficili, poiché gli input tissutali sono estremamente bassi. Tuttavia, la centrifugazione differenziale può ancora essere preferibile quando per gli studi a valle è richiesto esclusivamente il DNA dei mitocondri.Allo stesso modo, le fasi di centrifugazione possono essere regolate per estrarre preferenzialmente il DNA plastidico, se lo si desidera. Entrambi i metodi di estrazione del DNA organellare producono DNA adatto al sequenziamento di nuova generazione, ma il frazionamento metilale produce DNA ad alta velocità molecolare, ideale per il sequenziamento a lettura lunga.

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