Ottimizzazione e analisi comparativa dei metodi di arricchimento del DNA organologico vegetale adatti per la sequenziazione di nuova generazione

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di confrontare due metodi utilizzati per isolare il DNA organellare di alta qualità, sia il DNA plastidico che il DNA mitocondriale, dal tessuto fogliare vegetale adatto al sequenziamento di nuova generazione. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave in biologia vegetale, come l'entità della diversità organellare tra i taxa e come i cambiamenti nella sequenza o nella struttura del genoma organellare influenzano lo sviluppo e la risposta allo stress. Confronteremo due tecniche, il metodo di centrifugazione differenziale che arricchisce per uno specifico tipo organellare e la tecnica di metafrazionamento che recupera il DNA organellare totale da campioni di tessuto congelato più piccoli.

La procedura standard per la coltivazione di piantine di grano, è quella di piantare semi in vermiculite, in vasi quadrati con quattro o sei semi per angolo. Trasferisci i vasi in una serra con un ciclo di luce di 16 ore. Innaffia le piante ogni giorno.

Concimare le piante con un quarto di cucchiaino di fertilizzante granulare 20-20-20 MPK dopo la germinazione e di nuovo a sette giorni dopo la germinazione. Per l'adulazione delle piantine di grano, piantare semi e prendersi cura delle piante come nella procedura standard. Ma metti i vasi in una camera di crescita buia.

Un'alternativa alla coltivazione di queste piantine in una camera di crescita buia è quella di coprire le piante nella serra ma con un'adeguata ventilazione. Il primo passo di questa procedura è isolare gli organelli. Raccogli cinque grammi di fazzoletto fresco e sciacqualo in acqua fredda e sterile in un bicchiere freddo su ghiaccio.

Con le forbici, tagliare il tessuto fogliare in pezzi di circa un centimetro direttamente in un tubo pre-raffreddato da 50 millimetri contenente due cilindri di macinazione in ceramica. Mantenere i campioni in ghiaccio durante tutta la procedura. Per evitare la contaminazione incrociata, è importante cambiare le forbici tra un campione e l'altro.

Portare i campioni nella cappa aspirante e aggiungere 20 millilitri di tampone STE a ciascuna provetta da 50 millilitri. Posizionare i campioni in blocchi di macinazione criogenica pre-raffreddati in un apparecchio di macinazione tissutale e macinare i campioni per 30 secondi a 1.750 rotazioni al minuto. Mettere i campioni sul ghiaccio per circa un minuto.

Ruotare le posizioni del campione e macinare per altri 30 secondi a 1.750 rotazioni al minuto. Rimetti i campioni nel secchiello del ghiaccio. Per ogni campione, inserire un imbuto in una provetta pulita da 50 millilitri posta nel ghiaccio e posizionare uno strato di panno filtrante nell'imbuto.

Pre-bagnare il tessuto filtrante con cinque millilitri di tampone STE e risparmiare il flusso. Versare il fazzoletto omogeneizzato nell'imbuto. Sciacquare il tubo di macinazione con 15 millilitri di tampone STE, richiudere e capovolgere il tubo per sciacquare le pareti e il coperchio e versare il suo contenuto nell'imbuto.

Rimuovere con cautela le pietre ceramiche, quindi strizzare e strizzare il panno filtrante nell'imbuto. Per evitare la contaminazione incrociata, cambiare i guanti tra un campione e l'altro. Avvolgere i tappi delle provette con pellicola di paraffina per evitare fuoriuscite.

Centrifugare a 2.000 x G, a quattro gradi Celsius per 10 minuti. Successivamente, utilizzare una pipetta sierologica per aspirare accuratamente il surnatante senza disturbare il pellet e posizionarlo in una provetta da centrifuga ad alta velocità da 50 millilitri con una guarnizione di tenuta ermetica. Metti un piccolo bicchiere di ghiaccio su una bilancia, strappa la bilancia e pesa ogni surnatante.

Utilizzare il tampone STE per bilanciare le provette con una precisione di 0,1 grammi e centrifugare a 18.000 x G a quattro gradi Celsius per 20 minuti. Al termine della centrifugazione, rimettere i campioni nella cappa aspirante ed eliminare il surnatante. Aggiungere un millilitro di tampone ST al pellet e risospendere delicatamente con un pennello morbido.

Aggiungere 24 millilitri di tampone ST per ottenere un volume finale di 25 millilitri. Agitare delicatamente il pennello in sospensione per mescolare, quindi premere il pennello sul lato di un tubo per rimuovere tutto il liquido prima di rimuovere il pennello. Dopo aver bilanciato le provette, centrifugare a 18.000 x G a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Durante questa centrifugazione, preparare la soluzione 1 di DNA come descritto nel protocollo di testo e aliquotare 200 microlitri in una provetta da 1,5 millilitri per campione. Al termine della centrifugazione, eliminare il surnatante e tamponare la provetta. Ad ogni provetta da centrifuga ad alta velocità, aggiungere 300 microlitri di tampone STE e risospendere il pellet utilizzando un pennello morbido.

Posizionare il pennello nella provetta da 1,5 millilitri precedentemente preparata contenente 200 microlitri di soluzione di DNA 1 e agitare il pennello per rimuovere eventuali residui di pellet bloccati nel pennello. Pipettare la soluzione 1 del DNA nella provetta da centrifuga ad alta velocità e agitare delicatamente per mescolare. Avvolgere la pellicola di paraffina attorno alla parte superiore di ogni provetta e incubare a 37 gradi Celsius a bagnomaria per 30 minuti.

Durante l'incubazione, mescolare delicatamente roteando. Utilizzando un puntale per pipetta con un orifizio largo, pipettare delicatamente la miscela di pellet fuori dal tubo e posizionarla in un tubo a basso legame da 1,5 millilitri. Aggiungere 500 microlitri di EDTA da 400 millimolari, pH 8.0 alla provetta da centrifuga ad alta velocità.

Pipettare delicatamente per rimuovere completamente il pellet residuo e trasferire l'EDTA nel tubo a basso legame contenente la miscela di pellet. Mescolare delicatamente per inversione. Centrifugare a 18.000 x G, a quattro gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, scartare il surnatante, tamponare ogni provetta e utilizzare immediatamente il pellet per l'isolamento del DNA. In questo metodo, il DNA organellare viene arricchito dal DNA genomico totale estratto utilizzando colonne di estrazione del DNA commerciali. Preparare la quantità richiesta di microsfere magnetiche legate alla proteina MBD2 FC, secondo le istruzioni del produttore e scalare le reazioni per utilizzare tra uno e due microgrammi di DNA totale in ingresso.

In questa dimostrazione, sono necessari 160 microlitri di perline per un microgrammo di DNA totale in ingresso. Per catturare il DNA nucleare metilato, aggiungere un microgrammo di DNA in ingresso a una provetta contenente 160 microlitri di microsfere magnetiche legate a MBD2 per ogni singolo campione e pipettare delicatamente su e giù con una punta a foro largo. Aggiungere il volume appropriato di 5x tampone di lavaggio legante per una concentrazione finale di 1x e pipettare il campione su e giù con una punta a foro largo, alcune volte per mescolare.

Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 15 minuti. Per il successo del pull down, è fondamentale mescolare accuratamente le perle durante l'incubazione, in particolare se c'è un aggregazione significativo delle perle. Per evitare l'aggregazione delle microsfere e per garantire l'estrazione verso il basso del DNA metilato, pipettare delicatamente i campioni con una punta per pipetta a foro largo e agitare i campioni due o tre volte durante l'incubazione.

Far girare brevemente le provette contenenti la miscela di DNA e microsfere magnetiche. Posizionare le provette su una griglia magnetica per almeno cinque minuti per raccogliere le perle a lato delle provette. La soluzione dovrebbe apparire limpida, contiene DNA arricchito con organellare non metilato.

Utilizzando punte a foro largo, rimuovere con cura il surnatante eliminato senza disturbare le perle e trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga da due millilitri pulita e a basso legante. Conservare i campioni a 20 o 80 gradi Celsius. Il test PCR acuto è stato impiegato per valutare le abbondanze relative di tre impliconi specifici per organelli nel DNA genomico totale e la frazione di DNA organellare ottenuta da entrambi i metodi.

Nel complesso, i dati indicano che il metodo di centrifugazione differenziale arricchisce preferenzialmente i mitocondri. La frazione non metilata del DNA genomico totale metilfrazionato, mostra un sostanziale arricchimento di entrambi gli impliconi organellari. Le percentuali di reads mappate sui genomi di riferimento dei mitocondri o dei cloroplasti della primavera cinese e del grano coltivato da chris sono coerenti con i risultati della QPCR.

La centrifugazione differenziale produce DNA che è più arricchito in DNA mitocondriale e il frazionamento metilale produce DNA che probabilmente riflette l'abbondanza nativa dei due genomi organellari. Le etichette dei campioni, tra cui E, designano i campioni idilliati e NE designano i campioni non idillati. È interessante notare che l'idillio non ha cambiato le abbondanze organellari.

In entrambi i metodi, la copertura teorica dei genomi referenziati dai mitocondri o dai cloroplasti, supera la copertura di 100 volte, anche quando 12 librerie sono rimultiplexate. Il DNA genomico totale migra come striscio diffuso nell'elettroforesi su gel post-campo e supera le 50 kilobasi. La frazione nucleare dopo il metilfrazionamento diminuisce di dimensioni, ma rimane centrata intorno alle 50 kilobasi, suggerendo che il DNA metilfrattutato è più adatto per il sequenziamento a lettura lunga.

Una volta padroneggiate, entrambe le tecniche di estrazione del DNA organellare possono essere eseguite in uno o due giorni, dalla raccolta del campione alla valutazione del prodotto finale, se eseguite correttamente. La tecnica del metilfrazionamento ha il potenziale per espandere notevolmente la gamma di studi del DNA organellare a campioni rari e difficili, poiché gli input tissutali sono estremamente bassi. Tuttavia, la centrifugazione differenziale può ancora essere preferibile quando per gli studi a valle è richiesto esclusivamente il DNA dei mitocondri.

Allo stesso modo, le fasi di centrifugazione possono essere regolate per estrarre preferenzialmente il DNA plastidico, se lo si desidera. Entrambi i metodi di estrazione del DNA organellare producono DNA adatto al sequenziamento di nuova generazione, ma il frazionamento metilale produce DNA ad alta velocità molecolare, ideale per il sequenziamento a lettura lunga.