Spettroscopia NMR come uno strumento robusto per la rapida valutazione del profilo lipidico di olio di pesce integratori
1 maggio 2017
Qui, la spettroscopia ad alta risoluzione 1 H e 13 C Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) è stato utilizzato come strumento di rapida e affidabile per l'analisi quantitativa e qualitativa dei supplementi di olio di pesce incapsulati.
L'obiettivo generale di questo metodo è determinare il profilo lipidico degli integratori di olio di pesce utilizzando la spettroscopia di risonanza magnetica nucleare. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per l'analisi dei lipidi, come il contenuto lipidico degli integratori di olio di pesce e la distribuzione posizionale di vari acidi grassi sullo scheletro di glicerolo. Il vantaggio principale di questa tecnica è che rende possibile l'analisi rapida e robusta di diverse molecole in un'unica istantanea senza l'utilizzo di fasi di separazione e purificazione.
Per preparare i campioni per l'analisi NMR di protoni e carbonio, estrarre prima 120 microlitri, ovvero circa 110 milligrammi di olio di pesce, da una capsula alimentare utilizzando una siringa e metterli in una fiala di vetro da 4 ml. Registrare il peso dell'olio di pesce. Utilizzare 500 microlitri di una soluzione madre BHT per sciogliere 100 milligrammi più o meno 10 milligrammi di olio di pesce.
Dopo aver sciolto l'olio, trasferire tutta la soluzione direttamente in un tubo NMR di alta qualità da cinque millimetri e fissare un tappo. Analizzare i campioni entro 24 ore dalla preparazione dei campioni. Inserire il tubo NMR in una turbina rotante.
Posizionare l'ogiva e il tubo sulla parte superiore di un profondimetro graduato e spingere delicatamente la parte superiore del tubo fino a quando la sua parte inferiore tocca la parte inferiore del misuratore. Quindi posizionare la provetta NMR in un punto aperto della custodia del campione. Prendere nota del numero di slot in cui è posizionato il campione.
Per caricare il campione nello strumento NMR, tornare al computer di controllo e digitare il numero SX, dove numero è lo slot nella custodia del campione che contiene il campione. Attendere che sullo schermo appaia il segnale del deuterio del cloroformio deuterato. Non appena il segnale del deuterio è visibile, digitare lock"sulla riga di comando e selezionare il cloroformio deuterato dall'elenco dei solventi per bloccare il campione utilizzando la sua risonanza del deuterio.
Digita bsmsdisp"nella riga di comando per assicurarti che la rotazione non sia attiva. Se il pulsante di selezione è verde, fare clic su di esso per disattivare la rotazione. Dopo aver digitato il comando new"per creare un nuovo set di dati, inserisci un nome per il set di dati nella scheda del nome e il numero dell'esperimento nella scheda del numero dell'esperimento intitolata EXPNO.
Utilizzare il numero uno nella scheda del numero di processo denominata PROCNO. Scrivi il titolo dell'esperimento nella scheda TITOLO. Nella scheda Esperimento, premi Seleziona e scegli il file dei parametri C13IG.
Quindi premi Imposta l'elemento selezionato nell'editor"e fare clic su OK. Digita getprosol"nella riga di comando per ottenere i parametri standard per la sonda NMR e il solvente correnti. Quindi digita il comando atma"per eseguire la sintonizzazione automatica e l'abbinamento della sonda sia per i nuclei di carbonio che per quelli di protoni. Successivamente, eseguire lo spessoramento a gradiente unidimensionale per ottenere un campo magnetico altamente omogeneo e quindi una forma ottimale della linea per i segnali NMR.
Per fare ciò, utilizzare la procedura automatica standard per lo shimming 1D semplicemente eseguendo in sequenza i comandi qu topshim 1dfast ss; qu topshim tuneb ss; e qu topshim riporta"nella riga di comando. Dopo l'ottimizzazione dei parametri come descritto nel protocollo di testo, acquisire spettri NMR di carbonio unidimensionali. Per fare ciò, vai al set di dati sul carbonio e utilizza una sequenza di impulsi disaccoppiati con gate inverso digitando pulprog zgig" nella riga di comando.
Digita i comandi sulla riga di comando per impostare lo spettrale con nppm, il centro del trasmettitore RF, il numero di scansioni, il numero di scansioni fittizie, il numero di punti dati e la durata dell'impulso per un angolo di impulso di novanta gradi. Digita digmod baseopt"nella riga di comando per acquisire uno spettro con una linea di base migliorata. Impostare quindi un ritardo di rilassamento di 60 secondi per lo strumento da 850 megahertz digitando di 60s" nella riga di comando.
Impostare il guadagno del ricevitore su un valore appropriato utilizzando il comando rga"per il calcolo automatico del guadagno del ricevitore. Infine, avvia l'acquisizione digitando il comando di acquisizione impulsi zg"nella riga di comando. Per elaborare i dati, digitare prima si 64K"nella riga di comando per applicare il riempimento zero e impostare la dimensione dello spettro ferroviario su 64K.
Quindi impostare il parametro di allargamento della linea su 1,0 hertz digitando lb 1,0" nella riga di comando per applicare una funzione di attesa con un fattore di allargamento della linea di 1,0 hertz prima della trasformata 4ea. Esegui la trasformazione 4ea digitando efp"nella riga di comando. Successivamente, eseguire la correzione automatica della fase digitando il comando apk"nella riga di comando.
Se sono necessarie ulteriori regolazioni di fase per migliorare ulteriormente lo spettro, fare clic sulla scheda Processo. Quindi fare clic sull'icona Regola fase e sulle icone Correzione di fase per la correzione di fase dell'ordine zero e del primo ordine. Facendo clic sulle icone di correzione della fase dell'ordine zero e del primo ordine, trascinare il mouse fino a quando tutti i segnali sono in modalità di assorbimento positivo.
Applicare e salvare i valori di correzione di fase facendo clic sul pulsante Torna e salva per uscire dalla modalità di correzione di fase. Applicare una funzione polinomiale di quarto ordine per la correzione della linea di base al momento dell'integrazione digitando il comando abs n" nella riga di comando. Per segnalare gli spostamenti chimici in ppm dal TMS, ingrandire il segnale TMS, quindi fare clic sull'icona Calibrazione e posizionare il cursore con la linea rossa sopra il segnale NMR a cui fare riferimento, in questo caso TMS.
Per regolare l'intensità della soglia, utilizzare il pulsante centrale del mouse, se necessario. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse e digitare 0. Quando si utilizza BHT come standard interno, integrare il picco a delta 151,45 estendendosi di cinque hertz da ciascun lato del picco.
Quindi impostare l'integrale uguale alle micromoli di BHT per 0,5 millilitri della soluzione madre. Integra i picchi di interesse estendendosi di cinque hertz da ciascun lato del picco. Se è necessario concentrarsi su una regione, fare clic sull'icona di evidenziazione per disattivarla.
Quindi fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare per ingrandire la regione. Fare nuovamente clic sull'icona di evidenziazione per attivare la funzione di integrazione e passare alla vetta successiva. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinare il cursore attraverso l'integrale.
Fai clic sul pulsante Restituisci regioni di salvataggio. Qui è mostrato uno spettro rappresentativo dell'analisi NMR del carbonio nella regione del carbonio carbonilico. Vengono visualizzati i segnali NMR di EPA e DHA sulle posizioni sn-1, 3 e sn-2.
Questi segnali possono essere utilizzati per la determinazione quantitativa di EPA e DHA. Qui è mostrato uno spettro rappresentativo dell'analisi NMR del protone. Vengono mostrati i segnali NMR di EPA e DHA che possono essere utilizzati per la loro determinazione.
Lo spettro NMR del protone è caratterizzato da una larghezza spettrale più stretta rispetto allo spettro NMR del carbonio e quindi da una risoluzione spettrale inferiore. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 30 minuti se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'analisi dei lipidi per analizzare rapidamente vari componenti lipidici che compaiono in matrici multicomponente, come integratori alimentari, olio vegetale e biocarburanti.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come applicare la spettroscopia NMR di protoni e carbonio per l'analisi del profilo lipidico degli integratori di olio di pesce. Non dimenticare che lavorare con forti campi magnetici prodotti dagli spettrometri NMR può essere estremamente pericoloso per pacemaker e protesi chirurgiche, nonché per oggetti elettronici come carte di credito e orologi.
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Panoramica
Questo studio illustra l'uso della spettroscopia di Risonanza Magnetica Nucleare (NMR) ad alta risoluzione per 1H e 13C per l'analisi di integratori a base di olio di pesce. Il metodo consente un profilo lipidico sia quantitativo che qualitativo, fornendo informazioni sulla composizione e sulla struttura degli acidi grassi.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Chimica biochimica
- Chimica analitica
Sfondo
- La spettroscopia di risonanza magnetica nucleare (NMR) è una tecnica analitica potente.
- Gli integratori di olio di pesce sono ampiamente utilizzati per i loro benefici per la salute.
- Comprendere i profili lipidici è fondamentale per la scienza della nutrizione.
- La distribuzione posizionale degli acidi grassi influisce sulla loro funzione biologica.
Scopo dello studio
- Determinare il profilo lipidico di integratori a base di olio di pesce.
- Analizzare i contenuti lipidici e la distribuzione degli acidi grassi.
- Fornire un metodo analitico rapido e robusto senza un'estesa preparazione del campione.
Metodi Utilizzati
- Estrazione dell'olio di pesce da capsule dietetiche.
- Preparazione dei campioni per l'analisi NMR di protoni e carbonio.
- Utilizzo della soluzione madre di BHT per la dissoluzione dei campioni.
- Registrazione del peso dell'olio di pesce estratto per un'analisi accurata.
Risultati principali
- Determinazione con successo dei profili lipidici in integratori a base di olio di pesce.
- Identificazione di vari acidi grassi e della loro distribuzione posizionale.
- Dimostrazione dell'efficienza della risonanza magnetica nucleare (NMR) nell'analisi dei lipidi.
- Informazioni sulla composizione degli integratori alimentari.
Conclusioni
- La spettroscopia NMR è efficace per l'analisi degli integratori di olio di pesce.
- Il metodo fornisce informazioni preziose per la ricerca nutrizionale.
- Un vantaggio significativo è l'analisi rapida senza passaggi di separazione.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La spettroscopia NMR consente un profilo rapido e non distruttivo dei lipidi negli integratori di olio di pesce, supportando il controllo della qualità e le decisioni di formulazione nello sviluppo di nutraceutici. Il metodo fornisce dati quantitativi sui principali acidi grassi e sulla loro distribuzione posizionale senza necessità di purificazione, riducendo i tempi analitici. Questa capacità facilita la selezione precoce degli ingredienti e la valutazione della coerenza tra diversi lotti per prodotti a base di omega-3.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Convalida del Target
- Valore scientifico: Permette l'analisi della composizione lipidica per supportare ipotesi meccanicistiche nella ricerca nutraceutica.
- Valore operativo: Fornisce un profilo lipidico diretto da matrici complesse senza fasi di estrazione o cromatografia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Fornisce profili quantitativi di acidi grassi per la standardizzazione dei saggi nella valutazione di integratori a base lipidica.
- Valore operativo: Consente la pronta esecuzione di screening ad alto rendimento grazie all'acquisizione rapida di spettri 1H NMR in meno di un minuto.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Supporta la continuità traslazionale collegando i dati strutturali sui lipidi a risultati funzionali in modelli preclinici.
- Valore operativo: Facilita un profilo lipidico riproducibile nei flussi di lavoro di scoperta e preclinici mediante protocolli NMR standardizzati.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nei flussi di lavoro iniziali di scoperta per l'analisi dei lipidi, consentendo un profilaggio rapido prima dell'identificazione del composto capostipite nello sviluppo di nutraceutici. Supporta lo sviluppo del saggio fornendo letture quantitative e riproducibili dei lipidi senza necessità di derivatizzazione. La tecnica potenzia il riutilizzo aziendale come piattaforma analitica standardizzata per formulazioni contenenti lipidi.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica di ipotesi riguardo alla composizione lipidica e alla distribuzione degli acidi grassi nelle matrici di integratori.
- Screening: Permette la prontezza del saggio attraverso un profilo lipidico quantitativo e riproducibile con minima preparazione del campione.
- Analisi: Fornisce misurazioni quantitativa dirette mediante integrazione del segnale negli spettri di NMR 1H e 13C per analisi comparativa.
- Ricerca traslazionale: Collega i dati strutturali dei lipidi al significato biologico nei percorsi di sviluppo di nutraceutici privi di doxorubicina.
- Riutilizzo aziendale: Funziona come piattaforma scalabile e flessibile rispetto allo strumento, applicabile su sistemi NMR a 500 MHz e 850 MHz per controlli di qualità di routine.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella caratterizzazione dei lipidi attraverso misurazioni NMR dirette e quantitative.
- Valore operativo: Garantisce standardizzazione e riproducibilità mediante un riferimento interno (BHT) e un'acquisizione spettrale costante.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione consentendo una rapida valutazione del profilo lipidico durante lo screening delle formulazioni.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione degli ingredienti omega-3 in base a dati compositivi verificati, adeguata al rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nell'interpretazione degli spettri NMR e nell'assegnazione dei segnali lipidici.
- È subordinato all'accesso a spettrometri NMR (500 MHz o 850 MHz) e a materiali di consumo di laboratorio standard.
- Necessita di una standardizzazione condivisa tra i gruppi di lavoro per le procedure di preparazione dei campioni, di riferimento e di integrazione.
- Le considerazioni per l'adattamento includono la compatibilità del solvente e la scelta dello standard interno in diverse matrici lipidiche.
- I limiti pratici comprendono tempi di acquisizione più lunghi per la NMR del 13C rispetto a quella del 1H e la sensibilità all'omogeneità del campo magnetico.
