L'uso di un venoso Central Line per fluidi, farmaci e nutrienti Administration in un modello murino di malattia critica

L'obiettivo generale di questo metodo murino centralmente categorizzato di legatura e puntura del cieco, o CLP, è creare un modello riproducibile di malattia critica prolungata con misure di terapia intensiva per simulare la condizione clinica umana. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nei campi della medicina intensiva, riguardo alla patogenesi delle alterazioni endocrine e metaboliche durante malattie critiche acute e prolungate.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina la ben standardizzata tecnica CLP con l'uso di una linea venosa centrale per la somministrazione di fluidi, farmaci e nutrienti. La procedura sarà dimostrata da Thomas Dufour, un tecnico del nostro laboratorio. Per preparare l'estremità della linea venosa, immergere rapidamente la sezione centrale di un pezzo di tubo micro-renathane lungo 60 centimetri in olio di sesamo a 220 gradi Celsius o più caldo.

Tirare delicatamente le estremità del tubo per allungare la parte centrale, ottenendo un diametro centrale ridotto, e utilizzare una lama di bisturi per tagliare il tubo in due pezzi uguali di 30 centimetri. Collegare ora il tubo a un connettore in polietilene PE 50, a un giunto girevole e a un ago Luer, assemblando il catetere come illustrato, applicando una colla adesiva rapida e resistente a tutte le connessioni. Una volta indurita la colla, sciacquare il catetere con aria per verificare la presenza di perdite; successivamente, tagliare un pezzo di filo metallico di 80 centimetri da un filo di diametro 0,8 millimetri e piegare il filo su se stesso per formare un cappio.

Far scorrere tre perle sul filo doppio del cappio e guidare la punta del catetere sterilizzato attraverso le tre perle, per fissare il catetere al filo. Anestetizzare un topo maschio c57 black six del peso di 27-32 grammi e di 24 settimane di età, e confermare la sedazione verificando l'assenza di risposta alla compressione delle dita dei piedi. Utilizzare la pinzetta per estrarre delicatamente la lingua dalla bocca, al fine di evitare che venga ingerita.

Successivamente, rasare l'area chirurgica, quindi posizionare il topo in posizione prona su un tappetino riscaldante preriscaldato. Disinfettare la cute esposta con etanolo al 70% e applicare una piccola quantità di lubrificante oftalmico. Infiltrare i siti chirurgici con analgesia ed effettuare una piccola incisione alla base della parte dorsale della testa.

Esponi i muscoli cervicali posteriori e fai passare un pezzo di nylon 3.0 sotto i muscoli per fissare l'anello del filo di attacco al muscolo. Successivamente, con il topo posizionato sul fianco destro, pratica un piccola incisione verticale nella pelle del collo ventrale. Passa sottocute un ago da 18 gauge attraverso questa incisione ventrale in direzione dell'incisione dorsale ed inserisci il catetere attraverso l'ago per farlo uscire all'esterno dal lato ventrale.

Con il mouse supino, passare un filo di nylon tre zero dietro i denti incisivi superiori e fissare il nylon al tappetino riscaldante. Quindi, bloccare coda e arti anteriori in posizione estesa. A questo punto, mettere a fuoco il microscopio stereoscopico e utilizzare la pinzetta per rimuovere delicatamente il tessuto adiposo e le ghiandole dall'incisione ventrale finché non sarà possibile visualizzare la vena giugulare.

Posizionare la punta della pinza tra la vena e il tessuto connettivo, quindi aprire ripetutamente la pinza in modo parallelo alla vena per dissezionare in modo ottuso la vena giugulare dal tessuto connettivo e sottocutaneo circostante. Quando il vaso è isolato, posizionare la pinza ottusa sotto la vena giugulare ed inserire due pezzi di filo di seta 3-0 al di sotto della vena. Posizionare un pezzo, prossimale alla biforcazione della vena giugulare, per la legatura craniale, e un altro pezzo vicino al muscolo sternocleidomastoideo per la legatura caudale.

Stringere i legami craniale e caudale per distendere la vena e prevenire un sanguinamento eccessivo durante il posizionamento del catetere. Utilizzare un terzo filo per creare un legame lento, quindi, con forbici microchirurgiche, praticare un'incisione lungo la vena tra i legami craniale e caudale, di dimensioni sufficienti a far passare il catetere. Con la pinza, inserire il catetere di 11 millimetri nella vena e fissarlo in modo lento con il legame centrale.

Sciacquare delicatamente il catetere con soluzione salina sterile per confermare il corretto posizionamento. Successivamente, stringere saldamente la legatura caudale e quella mediale. Legare insieme le estremità della legatura caudale e di quella mediale per fissare il catetere.

Verificare che la vena non sia occlusa dai nodi, lavando il catetere dopo ogni legatura. Infine, legare anche la legatura craniale. Quindi, chiudere l'incisione con punti di sutura in seta numero cinque zero.

Per la Legatura e Puntura Cecale, effettuare un'incisione mediana di un centimetro attraverso la cute della metà inferiore dell'addome, avendo cura di non penetrare nella cavità peritoneale. Dopo aver identificato la linea alba della muscolatura addominale, praticare un'incisione intermuscolare per accedere alla cavità peritoneale.

Utilizzando pinze anatomiche ottuse, isolare ed estrarre il cieco. Legare il cieco alla metà della sua lunghezza con tre suture di seta numero zero, avendo cura di non ostruire la valvola ileocecale, in modo da mantenere la continuità intestinale. Successivamente, utilizzare un ago da 18 gauge per perforare il cieco con una singola puntura completa a metà strada tra la legatura e l'estremità del cieco, espellendo una piccola quantità di feci dal foro, per garantire la pervietà dopo la rimozione dell'ago.

Riposizionare l'intestino nella cavità addominale e chiudere il peritoneo e la pelle con suture in seta di calibro cinque zero. Con il topo in posizione supina, fissare il catetere al filo di ancoraggio utilizzando del nastro adesivo. Successivamente, posizionare il topo in una gabbia individuale con materiale per il nido e un blocco di legno.

Utilizzando un supporto con una pinza regolabile, posizionare il dispositivo girevole nella pinza e fissare saldamente con del nastro la parte libera del filo di attacco metallico al punto di rotazione del dispositivo girevole. Successivamente, posizionare la gabbia in un armadio per animali con temperatura controllata a 27 gradi Celsius e cicli di 12 ore di luce e 12 ore di buio. Collegare la siringa contenente la miscela appropriata di colloidi e cristalloidi bilanciati alla linea venosa e utilizzare una pompa di infusione precisa azionata da siringa per iniziare la rianimazione fluida a 0,3 millimetri all'ora.

Dopo sei ore, somministrare analgesia e antibiotici. L'analisi delle curve di sopravvivenza di un esperimento di legatura e punzionatura del ceco di cinque giorni e di uno di sette giorni rivela che i tassi di sopravvivenza non sono significativamente diversi tra i due studi fino al quinto giorno, evidenziando la riproducibilità della configurazione sperimentale. La legatura del 50% del ceco in combinazione con antibiotici, rianimazione liquida e nutrizione parenterale totale tramite un catetere venoso nella vena giugulare determina una mortalità del 13% dopo un giorno di malattia critica.

24% di mortalità dopo tre giorni di malattia critica e dal 27% al 31% di mortalità dopo cinque giorni di malattia critica e 36% di mortalità dopo sette giorni di malattia critica. I topi para-alimentati sani, sottoposti a restrizione calorica pari all'assunzione nutritiva dei topi gravemente malati, tuttavia, non hanno mostrato alcuna mortalità in nessuno dei due esperimenti. Dopo aver operato da 10 a 15 animali per padroneggiare la tecnica, il catetere può essere posizionato e la CLP può essere eseguita entro un periodo di 45 minuti, qualora le procedure vengano effettuate correttamente.

Quando si esegue questa procedura, ricordare di inserire il catetere nella vena con attenzione. Se il catetere viene inserito troppo in profondità nel cuore, può indurre aritmie cardiache. Se non viene inserito abbastanza in profondità, può essere facilmente estratto.

Verificare sempre che il catetere sia posizionato all'interno della cavità del vaso. Se il catetere viene posizionato tra i vari strati della parete vascolare, i liquidi fuoriusciranno nei tessuti circostanti. Questo modello potrebbe richiedere un intervento chirurgico esteso e cure intensive quotidiane dell'animale.

Ma produce un modello stabile e riproducibile che consente lo studio di molti aspetti delle malattie critiche acute e prolungate.