Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di Staphylococcus aureus

L'obiettivo generale di questo metodo di campionamento è quello di raccogliere campioni di metaboliti da Staphyococcus aureus per la successiva quantificazione mediante cromatografia liquida tandem-spettrometria di massa. Il nostro laboratorio è interessato a studiare l'intersezione tra metabolismo e patogenesi nei batteri rilevanti per la salute umana. Attualmente, stiamo utilizzando il patogeno opportunista umano Staphylococcus aureus come organismo modello.

Una domanda chiave a cui vogliamo rispondere è come i batteri regolano la loro fisiologia e patogenicità di fronte all'esaurimento dei nutrienti durante l'infezione dell'ospite. Questa tecnica è vantaggiosa perché fornisce un'istantanea della distribuzione di metaboliti specifici tra le molte vie metaboliche nelle cellule in crescita attiva, con una minima perturbazione del loro stato fisiologico. Per iniziare, striare i ceppi di S.aureus di interesse per l'isolamento su agar di soia triptica dal ceppo di glicerolo congelato.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Il giorno successivo, inoculare 4 ml di brodo di soia triptico, o TSB, in provette di incubazione di vetro sterili con singole colonie di ciascun ceppo. Incubare le colture, inclinate con rotazione, a 37 gradi Celsius per 16-20 ore.

Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture a 600 nanometri, abbreviato in OD600. Utilizzando questa misurazione, diluire le cellule a un OD600 di 0,05 in 50 mL di terreno TSB sterile, in 250 mL di palloni Delong. Incubare le colture a 37 gradi Celsius in un bagno caldo con agitazione a 280 giri/min.

Ogni 30 minuti, eseguire le misurazioni OD600. Con l'aumentare delle densità ottiche, può essere necessario diluire le colture con TSB in modo che rimangano all'interno dell'intervallo di assorbanza lineare dello spettrofotometro. Mentre le cellule crescono, preparare nuovamente le soluzioni tampone di estrazione utilizzando i reagenti di massima purezza disponibili, come descritto nel protocollo di testo.

Quando le colture raggiungono un OD600 compreso tra 0,8 e 1,0, sottocoltivarle in 50 ml di TSB fresco preriscaldato a un OD600 compreso tra 0,01 e 0,05 e ripetere le fasi di incubazione e misurazione. Prepara un letto di ghiaccio secco tritato in un recipiente appropriato, come un piatto di vetro, un secchiello per il ghiaccio o un refrigeratore. Quando le densità ottiche delle colture si avvicinano al punto di raccolta desiderato, aggiungere 1 mL di soluzione di tempra a una capsula di Petri non trattata da 35 mm e pre-raffreddare su ghiaccio secco per almeno 5 minuti.

Per i nostri scopi, il punto di raccolta desiderato è una densità ottica di circa 0,4-0,5. Ma questo può essere variato, a seconda degli obiettivi sperimentali. Quindi, posiziona una fritta filtrante in acciaio inossidabile in un tappo di gomma e posizionala sopra un pallone da vuoto collegato a un aspirapolvere domestico o a una pompa per vuoto.

Applicare il vuoto e posizionare sopra una membrana mista di estere di cellulosa. Utilizzare un filtro con lo stesso diametro della fritta per assicurarsi che tutte le celle siano raccolte. È fondamentale raccogliere le cellule e arrestare l'attività metabolica il più rapidamente possibile, in modo da fornire un'istantanea delle abbondanze metaboliche in una determinata condizione.

Anche piccoli ritardi possono influenzare la fisiologia dello stato stazionario delle cellule. Con un OD600 compreso tra 0,4 e 0,5, utilizzare una pipetta sierologica per rimuovere 13 ml di coltura dal pallone. Applicare immediatamente il campione al filtro.

Dopo che l'intero campione è stato filtrato, lavare immediatamente il filtro con non più di 5 ml di PBS ghiacciato per lavare via i metaboliti associati al mezzo. Quindi scollegare l'aspirapolvere e utilizzare un paio di pinzette sterili per rimuovere il filtro dalla fritta. Capovolgere il filtro nella soluzione di tempra pre-raffreddata.

Incubare il filtro in soluzione di quench su ghiaccio secco per almeno 20 minuti. Utilizzando le pinzette sterili, capovolgere il filtro nella capsula di Petri e utilizzare una micropipetta per sciacquare le cellule dalla membrana nella soluzione di spegnimento. Risospendere le cellule in soluzione di quench, quindi trasferire la sospensione cellulare in una provetta sterile da 2 ml resistente agli urti contenente circa 100 microlitri di perle di silice da 0,1 mm.

Conservalo su ghiaccio secco o a 80 gradi Celsius. Per iniziare l'estrazione del metabolita, scongelare prima i campioni su ghiaccio umido. Quindi disgregare le celle in un omogeneizzatore con quattro raffiche di 30 secondi a 6000 giri/min, con periodi di raffreddamento di due minuti su ghiaccio secco tra i cicli.

Chiarificare i lisati per 15 minuti in una provetta da microcentrifuga refrigerata pre-raffreddata alla massima velocità. Dopo la centrifugazione, trasferire il surnatante in una provetta da microcentrifuga pulita. Utilizzando una micropipetta, trasferire una piccola parte del campione in una provetta da microcentrifuga per la quantificazione del contenuto di peptidi residui come descritto nel protocollo di testo.

Conservare il resto del campione a 80 gradi Celsius. Fare riferimento al protocollo di testo per l'analisi dei metaboliti tramite cromatografia liquida e spettrometria di massa. Il mutante nullo CodY è stato utilizzato per studiare la deplezione degli amminoacidi a catena ramificata, poiché la proteina CodY regola l'espressione di dozzine di geni in risposta al calo della concentrazione di questi nutrienti.

La mutazione codY ha scarso effetto sul tasso di crescita delle cellule di S.aureus. Il calo della densità ottica al segno delle 3 ore indica la fase di diluizione inversa, che aumenta il numero di raddoppi cellulari prima del raccolto e diluisce varie molecole che si accumulano durante la crescita notturna. Un'analisi della sequenza di RNA dei trascrittomi dei due ceppi mostra cambiamenti significativi nell'espressione di geni coinvolti nella sintesi della famiglia degli amminoacidi aspartato.

Qui, i numeri sotto i nomi dei geni indicano il cambiamento di piega nell'espressione in un mutante null codY, rispetto al ceppo wild type. Dopo la quantificazione LC-MS dei metaboliti estratti, sono state confrontate le abbondanze tra i due ceppi. Concentrandosi su alcuni composti legati alla famiglia degli amminoacidi dell'aspartato, l'abbondanza di precursori, come l'aspartato e l'O-acetilomoserina, sono diminuite nel mutante codY.

Al contrario, i prodotti finali come la treonina e l'isoleucina sono aumentati. Qui, la linea tratteggiata indica il limite per le variazioni di abbondanza per questo esperimento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere metaboliti da Staphylococcus aureus per la quantificazione tramite spettrometria di massa cromatografica liquida.

Questo protocollo è adatto anche con modifiche per la raccolta di metaboliti da altre specie batteriche. Poiché i batteri rispondono agli ambienti dinamici, è importante eseguire rapidamente le fasi di filtraggio e lavaggio per ridurre al minimo i potenziali cambiamenti fisiologici indotti dal campionamento. Le modifiche possono anche essere ridotte al minimo mantenendo la fritta e il PBS freddi durante il campionamento.