Un approccio Tandem HPLC-MS-based per analisi dei metaboliti di

L'obiettivo generale di questo metodo di campionamento è raccogliere campioni di metaboliti da Staphylococcus aureus per la successiva quantificazione mediante Cromatografia Liquida in Tandem-Spettrometria di Massa. Il nostro laboratorio è interessato allo studio dell'intersezione tra metabolismo e patogenesi nei batteri rilevanti per la salute umana. Attualmente, stiamo utilizzando il patogeno opportunistico umano Staphylococcus aureus come organismo modello.

Una domanda fondamentale che desideriamo affrontare è in che modo i batteri adattano la propria fisiologia e patogenicità quando si trovano di fronte alla carenza di nutrienti durante l'infezione dell'ospite. Questa tecnica presenta il vantaggio di fornire un'istantanea sulla distribuzione di specifici metaboliti tra i numerosi percorsi metabolici nelle cellule in crescita attiva, con minimo disturbo del loro stato fisiologico. Per iniziare, effettuare lo streaking dei ceppi di S.aureus di interesse su agar tripticaso-soia per l'isolamento, partendo dalla riserva glicerolata congelata.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 16-24 ore. Il giorno successivo, inoculare 4 mL di brodo triptico di soia, o TSB, in provette sterili per incubazione con singole colonie di ciascun ceppo. Incubare le colture, posizionate in modo inclinato con rotazione, a 37 gradi Celsius per 16-20 ore.

Utilizzare uno spettrofotometro per misurare la densità ottica delle colture a 600 nanometri, indicata come OD600. Utilizzando questa misurazione, diluire le cellule fino a un OD600 di 0,05 in 50 mL di mezzo TSB sterile, in fiaschi Delong da 250 mL. Incubare le colture a 37 gradi Celsius in un bagno termico con agitazione a 280 rpm.

Ogni 30 minuti, effettuare misurazioni dell'OD600. Con l'aumento delle densità ottiche, potrebbe essere necessario diluire le colture con TSB in modo che rimangano entro il range lineare di assorbanza dello spettrofotometro. Mentre le cellule crescono, preparare frescamente le soluzioni tampone per l'estrazione utilizzando reagenti della massima purezza disponibile, come descritto nel protocollo testuale.

Quando le colture raggiungono un OD600 compreso tra 0,8 e 1,0, effettuare un'immersione in 50 mL di TSB fresco preriscaldato fino a un OD600 di 0,01-0,05 e ripetere i passaggi di incubazione e misurazione. Preparare uno strato di ghiaccio secco tritato in un contenitore adeguato, come una capsula di vetro, un secchiello per ghiaccio o un contenitore isotermico. Mentre le densità ottiche delle colture si avvicinano al punto desiderato di raccolta, aggiungere 1 mL di soluzione di arresto in una piastra di Petri non trattata da 35 mm e pre-raffreddare sul ghiaccio secco per almeno 5 minuti.

Per i nostri scopi, il punto ottimale di raccolta corrisponde a una densità ottica di circa 0,4-0,5. Tuttavia, questo valore può variare in base agli obiettivi sperimentali. Successivamente, posizionare un disco filtrante in acciaio inox in un tappo di gomma e inserirlo sulla sommità di un matraccio collegato al vuoto di rete o a una pompa per vuoto.

Applicare il vuoto e posizionare sopra una membrana in estere di cellulosa mista. Utilizzare un filtro con lo stesso diametro del frit per garantire che tutte le cellule vengano raccolte. È fondamentale raccogliere le cellule e interrompere l'attività metabolica nel modo più rapido possibile, al fine di ottenere un'istantanea delle abbondanze metaboliche in una determinata condizione.

Anche piccoli ritardi possono influenzare la fisiologia stazionaria delle cellule. A un OD600 compreso tra 0,4 e 0,5, utilizzare una pipetta serologica per prelevare 13 mL di coltura dal flacone. Applicare immediatamente il campione sul filtro.

Dopo aver filtrato l'intero campione, lavare immediatamente il filtro con non più di 5 mL di PBS freddo ghiacciato per rimuovere i metaboliti associati al mezzo. Quindi disconnettere il vuoto e utilizzare un paio di pinzette sterili per rimuovere il filtro dalla frittura. Capovolgere il filtro nella soluzione di quench pre-raffreddata.

Incubare il filtro nella soluzione di arresto su ghiaccio secco per almeno 20 minuti. Utilizzando pinze sterili, capovolgere il filtro nella piastra di Petri e usare una micropipetta per risciacquare le cellule dalla membrana nella soluzione di arresto. Ri-sospendere le cellule nella soluzione di arresto, quindi trasferire la sospensione cellulare in un tubo sterile resistente agli urti da 2 mL contenente circa 100 microlitri di microsfere di silice da 0,1 mm.

Conservare su ghiaccio secco o a 80 gradi Celsius. Per iniziare l'estrazione dei metaboliti, scongelare prima i campioni su ghiaccio bagnato. Quindi rompere le cellule in un omogeneizzatore con quattro impulsi di 30 secondi ciascuno a 6000 giri/min, con intervalli di raffreddamento di due minuti su ghiaccio secco tra un ciclo e l'altro.

Centrifugare i lisati per 15 minuti in una provetta microcentrifuga pre-raffreddata a velocità massima. Dopo la centrifugazione, trasferire il sopranatante in una provetta microcentrifuga pulita. Utilizzando una micropipetta, trasferire una piccola porzione del campione in una provetta microcentrifuga per la quantificazione del contenuto residuo di peptidi, come descritto nel protocollo testuale.

Conservare il resto del campione a 80 gradi Celsius. Fare riferimento al protocollo testuale per l'analisi dei metaboliti mediante cromatografia liquida e spettrometria di massa. Il mutante nullo di CodY è stato utilizzato per studiare l'esaurimento degli amminoacidi a catena ramificata, poiché la proteina CodY regola l'espressione di dozzine di geni in risposta alla diminuzione della concentrazione di questi nutrienti.

La mutazione codY ha un lieve effetto sulla velocità di crescita delle cellule di S.aureus. L'abbassamento della densità ottica al tempo di 3 ore indica il passaggio di re-diluzione, che aumenta il numero di duplicazioni cellulari prima del raccolto e diluisce diverse molecole accumulate durante la crescita notturna. Un'analisi della sequenza dell'RNA dei trascrittomi delle due ceppi mostra cambiamenti significativi nell'espressione dei geni coinvolti nella sintesi della famiglia di aminoacidi derivati dall'aspartato.

Qui, i numeri riportati sotto i nomi dei geni indicano il fold change nell'espressione in un mutante nullo per codY, rispetto al ceppo di tipo selvatico. Dopo la quantificazione mediante LC-MS dei metaboliti estratti, sono state confrontate le abbondanze tra i due ceppi. Concentrandosi su alcuni composti appartenenti alla famiglia degli aminoacidi derivati dall'aspartato, le abbondanze di precursori, come l'aspartato e l'O-acetilomoserina, risultano ridotte nel mutante codY.

Al contrario, i prodotti finali come la treonina e l'isoleucina aumentano. In questo caso, la linea tratteggiata indica la soglia per le variazioni nell'abbondanza in questo esperimento. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come raccogliere i metaboliti da Staphylococcus aureus per la quantificazione mediante spettrometria di massa con cromatografia liquida.

Questo protocollo è adatto, con alcune modifiche, anche per la raccolta di metaboliti da altre specie batteriche. Poiché i batteri rispondono a condizioni ambientali dinamiche, è importante eseguire rapidamente i passaggi di filtrazione e lavaggio per ridurre al minimo i potenziali cambiamenti fisiologici indotti dal campionamento. Tali cambiamenti possono essere ulteriormente ridotti mantenendo la frittura e il PBS freddi durante il campionamento.