Name: Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Impara a misurare il segnalatore del recettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio. Questo metodo semplice e rapido caratterizza le proprietà farmacologiche dei GPCR per studi di biologia cellulare.

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Questo lavoro è stato sostenuto da National Institutes of Health grant DA-000266 e dal programma di addestramento del medico scientifico T32 (CV, NWZ e PCS). Gli autori vorrebbero anche riconoscere somersault18: 24 (somersault1824.com) per la Biblioteca di Scienza e Illustrazioni Mediche.

1. Espressione di HA-MOR1 ricombinante nelle cellule coltivate NOTA: seguire tutti i protocolli della cultura cellulare in un cappuccio flusso laminare sterile. <ol><li> Sterilizzare la cappa di flusso laminare della coltura cellulare con il 70% di etanolo e mantenere la tecnica sterile in tutta la coltura cellulare. </li><li> Preparare le cellule embrionali di origine umana 293 (HEK293), media completa di Eagle Medium modificata da Dulbecco (DMEM): DMEM, pH 7,4, integrata con 2 mM L-glutammina, 1% penicillina / streptomicina e 10% siero fetale bovino (FBS ). </li><li> Piattare 2,5 x 10 6 cellule HEK293 su una piastra di coltura tissutale da 10 cm in 10 ml di DMEM completo e incubare a 37 ° C e 5% CO 2 fino al raggiungimento della confluenza del 70-80% (O / N). NOTA: Per raccogliere proteine ​​sufficienti per un esperimento completo di legame GTP, piastra almeno 3 x 10 cm di piastre di cellule. </li><li> Trasfettare le cellule con HA-MOR1 usando un reagente di transfection di scelta e seguendo le istruzioni del produttore; S orientamenti. Incubare per 36-48 h. NOTA: Il cDNA umano MOR-1 (NCBI Sequenza di riferimento: NM_000914.4) è stato un dono generoso di Gavril Pasternak ed è stato clonato in pCMV-HA. </li></ol> 2. Frazionamento cellulare e raccolta delle membrane <ol><li> Preparare i seguenti buffer di lisi: <ol><li> Tampone 1: 10 mM 4- (2-idrossietil) -1-piperazinattanesolfonico (HEPES), pH 7,4; 1 mM etilen glicol-bis (β-aminoetil etere) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraacetico (EGTA); 10% di saccarosio; Cocktail inibitore della proteasi; E 1 mM dithiothreitol (DTT). Aggiungere il DTT fresco al giorno dell&#39;isolamento della membrana. </li><li> Tampone 2: 10 mM HEPES, pH 7,4; 1 mM EGTA; 1 mM MgCl2; E 1 mM DTT. Aggiungere il DTT fresco al giorno dell&#39;isolamento della membrana. </li></ol></li><li> Rimuovere le cellule trasfettate dall&#39;incubatore (fase 1.4), aspirare il mezzo e sciacquare le cellule con 5 ml di freddo fosfato-tamponato Saline (PBS). Aspirare il PBS e il liquido in eccesso dail piatto. </li><li> Aggiungere 600 μl di Tampone 1 alle cellule. Utilizzando un raschiatore di celle, scollegare le celle dalla superficie del piatto e pipettare la sospensione cellulare in un tubo da microcentrifuga da 1,6 ml. </li><li> Immediatamente congelare il tubo di microcentrifuga in azoto liquido. Una volta che i campioni sono congelati, scongelare i lisati sul ghiaccio o collocarli a -80 ° C per conservare a lungo termine. </li><li> Ripetere i passaggi 2.3 e 2.4 con tutte le piastre delle celle. </li><li> Una volta che i lisati hanno scongelato, utilizzare un omogenizzatore a micro-tubo a singolo impulso per aprire le cellule. Impulsi l&#39;omogeneizzatore 3-5 volte per 10 s, ponendo il tubo sul ghiaccio per 30 s tra impulsi. <ol><li> Raccogliere 20 μL come frazione di cellule intere. </li></ol></li><li> Centrifugare il campione rimanente per 10 min a 1.000 xg e 4 ° C. Raccogliere il surnatante e collocare in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,6 ml sul ghiaccio. </li><li> Resuspendere il pellet in 100 μl di Tampone 1 e reomomogenizzare con un pestello. Impara l&#39;homoGener 3-5 volte per 5 s, ponendo il tubo sul ghiaccio per 30 s tra impulsi. <ol><li> Centrifugare il campione una seconda volta per 10 min a 1.000 xg e 4 ° C. Combinare il supernatante con il surnatante dal punto 2.7. NOTA: il pellet rimanente contiene proteine ​​nucleari e di membrana. </li></ol></li><li> Centrifugare i supernatanti combinati per 20 minuti a 11.000 xg e 4 ° C. Separare il supernatante (la frazione citosolica) in un nuovo tubo di microcentrifuga da 1,6 ml. </li><li> Resuspendere il pellet in 200 μl di Tampone 2. Homogenizzare il pellet triturandolo 3-5 volte. Centrifugare il campione per 20 minuti a 21.100 xg e 4 ° C. Aspirare il surnatante. Resuspendere il pellet contenente la frazione della membrana grezzo in 50 μl di Tampone 2. </li><li> Procedere immediatamente agli esperimenti di legame GTPγS (sezione 3) o snap-freeze in azoto liquido e conservare a -80 ° C. </li></ol> 3. [ 35 S] GTPγS Binding </p&gt; NOTA: Utilizzare il protocollo di sicurezza radiochimico standard quando si utilizza [ 35 S] GTPγS e quando conduce esperimenti di binding di [ 35 S] GTPγS. Indossare guanti protettivi e un cappotto di laboratorio in qualsiasi momento. Controllare il materiale di imballaggio per perdite o crepe. Smaltire i rifiuti e reagenti in eccesso secondo protocolli istituzionali. <ol><li> Preparare un buffer di rilascio incompleto (IBB) mescolando 50 mM HEPES, pH 7,4; 5 mM MgCl2; 100 mM NaCl; E 1 mM di acido etilendiammina-tetraacetico (EDTA) in acqua distillata. </li><li> Diluire il titolo [ 35 S] GTPγS a 50 nM in 10 mM Tris-HCl, pH 7,6 e 10 mM DTT. Formare aliquote da 500 μL e conservarle a -80 ° C. Utilizzare solo una aliquota appena scongelata immediatamente prima di iniziare l&#39;esperimento. Scongelare le aliquote sul ghiaccio. </li><li> Preparare GTPγS non marcato da etanolo, sciogliendo 1 mg di polvere di GTPγS in 177,62 μl di acqua pura per una concentrazione di 10 mM. Crea aliquote da 10 μl e li memorizza-20 ° C. </li><li> Preparare il buffer di rilascio completo (CBB) completando IBB per includere una concentrazione finale di 1 mM DTT, 0,1% (wt / vol) albumina bovina serba (BSA), 10 μM PIL e 0,1 nM [ 35 S] GTPγS. NOTA: la CBB ora contiene GTP radiomarcato. Prendere opportune precauzioni di sicurezza durante il lavoro con soluzioni radioattive. </li><li> Sciogliere la frazione della membrana dal punto 2.11 sul ghiaccio. </li><li> Quantificare la concentrazione proteica della frazione della membrana mediante un test di proteina Bradford utilizzando uno spettrofotometro a 595 nm. <ol><li> Preparare una serie di diluizioni di standard proteici BSA con il tampone 2, alla concentrazione finale di 0, 250, 500, 750, 1500, 2500 e 5.000 μg / mL. </li><li> Aggiungere 2 μL di ciascuna norma o membrana a 1 ml di reagente Bradford in una cuvetta. Mescolare accuratamente vorticando. </li><li> Regolare lo spettrofotometro a una lunghezza d&#39;onda di 595 nm e in bianco utilizzando la cuvetta con 0 μg / mL proteina. </li><li> Attendi 5 min e rCiascuno dei campioni e ciascuno dei campioni ad una lunghezza d&#39;onda di 595 nm. </li><li> Tracciare l&#39;assorbanza degli standard rispetto alla concentrazione. Utilizzando la legge Beer-Lambert (A = εcl, dove ε = coefficiente di estinzione, l = lunghezza della cuvetta e c = concentrazione), calcolare la concentrazione dei campioni di membrana. </li></ol></li><li> Diluire le frazioni di membrana ad una concentrazione di 100 μg di proteine ​​/ mL in IBB. NOTA: Un piatto da 10 cm di cellule HEK293 produce tipicamente tra 1 e 3 mg di proteine ​​/ ml. </li><li> Preparare le seguenti condizioni sperimentali in singoli tubi di microcentrifuga da 1,6 ml: una serie di diluizione ligandi, una condizione di attività basale per misurare il legame GTP basale e una condizione non vincolante per misurare il legame non specifico di GTP. <ol><li> Per la serie di diluizione ligandi, preparare una serie di diluizione del ligando di interesse in un volume finale di 100 μL di CBB. Preparare la serie di ligandi a 2x il concentrato finale desideratoons. Spazio le concentrazioni del ligando per coprire adeguatamente una gamma di risposte. <ol><li> Per analizzare l&#39;effetto di DAMGO sul legame GTP attraverso MOR1, preparare DAMGO diluizioni di 2 mM, 200 μM, 20 μM, 2 μM, 200 nM, 20 nM, 2 nM, 200 pM, 20 pM e 2 pM in CBB Volume: 100 μL). NOTA: ad esempio, se il ligando di interesse ha un valore EC 50 previsto di 10 μM, preparare le diluizioni di ligandi di 200 nM, 2 μM, 20 μM, 200 μM e 2 mM. Queste cinque condizioni coprono un&#39;ampia gamma di concentrazioni e sono 2x la concentrazione desiderata per il dosaggio. </li></ol></li><li> Per il legame basale, preparare un tubo solo con 100 μL di CBB. </li><li> Per un legame non specifico, preparare un tubo con 99 μL di CBB integrato con 1 μL di 2 mM GTPγS non-radioterminato. </li></ol></li><li> Aggiungere 100 μL della soluzione di membrana diluita (punto 3.7) ad ogni condizione sperimentale. </li><li> Incubare le membrane con i vari esperimentiIn 1.6 ml di microcentrifuga per 30 minuti a 25 ° C in un termomexer o su un agitatore orbitale. </li></ol> 4. Filtrazione a membrana <ol><li> Preparare il tampone di lavaggio combinando 50 mM Tris-HCl, pH 7,4; 5 mM MgCl2; E 50 mM NaCl in acqua distillata. </li><li> Prelevare i filtri in fibra di vetro in acqua per 10 min. NOTA: I filtri hanno una porosità di 1 μm, un diametro di 2,1 cm e uno spessore di 675 μm. </li><li> Rimuovere i campioni dal termomexer o dagli agitatori orbitali (passo 3.10). Inserire brevemente i campioni per 5 s per raccogliere ogni campione nella parte inferiore del tubo. </li><li> Rimuovere il coperchio dell&#39;apparecchio di filtrazione a vuoto. Posare i filtri presoccitati sui porti di vuoto dell&#39;apparato. Reinserire il coperchio dell&#39;apparecchio per formare una guarnizione a vuoto. Accendere il vuoto. </li><li> Pipettare 195 μL di ogni condizione sperimentale di 200 μL su filtri per ridurre al minimo l&#39;errore dall&#39;assorbimento alle pareti del tubo e / o da pipettating. </li><li> Lavare i filtri tre volte con 1 mL di tampone di lavaggio ghiacciato. </li></ol> 5. Conteggio liquido scintillante <ol><li> Posizionare 5 ml di flaconcini di scintillazione in un rack di conteggio. Aggiungere 5 ml di liquido di scintillazione a ciascuna fiala. </li><li> Spegnere il vuoto (passo 4.4). Rimuovere il coperchio dell&#39;apparecchio di filtrazione a vuoto. Usando le pinzette, raccogliete i filtri dalle porte di vuoto dell&#39;apparecchiatura di filtrazione e lasciate cadere ogni filtro in un singolo flaconcino da 5 ml di scintillazione. </li><li> Preparare una fiala con 195 μL di CBB per determinare il segnale massimo. </li><li> Bloccare ogni fiala in modo sicuro. Incubare le fiale su un agitatore orbitale a 25 ° C per 10 min. </li><li> Accendere il contatore di scintillazione. Programmare il contatore di scintillazione per misurare l&#39;emissione di isotopi da 35 S per 5 min per campione utilizzando il programma di scintillazione standard associato. </li><li> Premere &quot;Start&quot; per prendere un conteggio. </li><li> Al termine del conteggio, dispensare il flaconcino contatoCome rifiuti pericolosi. </li></ol> 6. Analisi dei dati <ol><li> Inserire i dati nelle statistiche e nel software di analisi. <ol><li> Sottrai il legame non specifico da ciascuna delle altre misurazioni per determinare il legame specifico. NOTA: Il grado di legame non specifico è determinato dal campione incubato con GTPyS non radiolabelled (fase 3.8.3). </li><li> Aprire le statistiche e il software di analisi e selezionare una voce del set di dati XY. </li><li> Inserisci i dati specifici di binding degli esperimenti di binding di [ 35 S] GTPγS in una tabella dati nel software delle statistiche e dell&#39;analisi. Immettere le concentrazioni agoniste, come concentrazioni molari, nella colonna &quot;X&quot;. Immettere i conteggi 35 S associati come valori &quot;Y&quot;. </li></ol></li><li> Trasformare i dati. <ol><li> Converti i valori X nel loro rispettivo logaritmo facendo clic su &quot;Analizza&quot;. Selezionare &quot;Trasforma&quot; dal built-iN analizza. </li><li> All&#39;interno della finestra di dialogo &quot;Trasforma&quot;, selezionare &quot;Trasforma valori X utilizzando&quot; e selezionare la funzione &quot;X = log (X)&quot;. Scegliere di creare un nuovo grafico dei risultati. </li><li> Fai clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Normalizzare i valori Y. <ol><li> Con i risultati trasformati visualizzati, fai clic su &quot;Analizza&quot;. Seleziona &quot;Normalizza&quot; dalle analisi incorporate. </li><li> All&#39;interno della finestra di dialogo &quot;Normalizza&quot;, selezionare il pulsante di opzione per definire il 0% come &quot;il valore più piccolo in ogni set di dati&quot; e il 100% come &quot;il valore più grande di ciascun set di dati&quot;. Seleziona la casella per presentare i risultati come percentuali. Seleziona la casella per creare un nuovo grafico dei risultati. </li><li> Fai clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Adattare le curve di regressione non lineare ai dati grafici. Esegui un&#39;analisi di regressione non lineare. <ol><li> Con i risultati normalizzati visualizzati, fare clic su &quot;Analizza&quot;. Dalle analisi integrate, Selezionare &quot;Regressione non lineare (curva fit)&quot;. </li><li> Se si esamina un agonista, selezionare &quot;log (agonist) vs risposta normalizzata - pendenza variabile&quot; dalla finestra di dialogo. </li><li> Se indagando su un antagonista, &quot;selezionare log (antagonista) contro risposta normalizzata - pendenza variabile&quot; dalla finestra di dialogo. </li><li> Fai clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Rivedere il grafico e i risultati per assicurare che l&#39;adattamento ei dati siano ragionevoli. Assicurarsi che la regressione corrisponda al modello generale dei dati elaborati e che i residui non siano così grandi che rendono piatta la curva dose-risposta. NOTA: Il software riassume i risultati della regressione non lineare e dettaglierà la concentrazione che determina la risposta half-maximal (EC 50 ), il coefficiente Hill (n H ) e la concentrazione inibitoria half-maximal (IC 50 ). </li><li> Deriva la potenza del parametro agonista / antagonista. <ol><li> Deriva l&#39;equatore agonistaCostanti di dissociazione del ilibrio (K b ) da uno dei seguenti esperimenti 16 , 17 , 18 <ol><li> Valutare lo spostamento della risposta dose-risposta di un agonista in concorrenza con una concentrazione fissa di antagonista. Qui, EC 50 &#39;= EC 50 (1 + [antagonista] / antagonista Kb ), dove EC 50 &#39; è la destra EC 50 sposta. </li><li> Valutare [ 35 S] GTPγS legame con varie concentrazioni di antagonisti in concorrenza con una concentrazione fissa di agonista. Qui Kb = IC50 / (2 + (agonista / agonista EC 50 ) n ) 1 / n - 1, dove n è il coefficiente Hill dell&#39;agonista. </li></ol></li></ol></li><li> A seconda della variabilità dei dati, ripetere l&#39;esperimento (fasi 3.8-5.6) per ciascun ligando circa 3-5 volte e mediare i risultati utilizzando una statistica e analisi softwsiamo. </li></ol>

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<li>Strange, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+the+GTP%CE%B3S+%28%5B35S%5DGTP%CE%B3S+and+Eu-GTP%CE%B3S%29+binding+assay+for+analysis+of+ligand+potency+and+efficacy+at+G+protein-coupled+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Br.+J.+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Use of the GTPγS ([35S]GTPγS and Eu-GTPγS) binding assay for analysis of ligand potency and efficacy at G protein-coupled receptors.</a> Br. J. Pharmacol. 161 (6), 1238-1249 (2010).</li>
</ol>

Gli autori non dichiarano interessi concorrenti.

Il presente protocollo descrive due metodi separati ma complementari: un approccio semplice per frazionare cellule e tessuti in compartimenti larghi ma distinti e un mezzo per indagare la segnalazione di GPCR misurando il legame di [ 35 S] GTPγS. La frazionamento cellulare efficace ha una vasta gamma di applicazioni, che vanno dall&#39;estrazione e dall&#39;arricchimento delle proteine, alla valutazione della localizzazione subcellulare delle proteine, allo studio della farmacolog...

I recettori G-Proteine-Coupled (GPCRs) sono una grande famiglia di recettori della superficie cellulare responsabile di una notevole serie di processi fisiologici, tra cui analgesia, olfazione e comportamento 1 . I GPCR agiscono rilevando segnali esterni specifici e successivamente stimolando la segnalazione intracellulare. Esse pertanto rappresentano una giunzione chiave tra gli ambienti esterni e interni di una cella. A causa del ruolo critico che i GPCR svolgono in biologia, sono diventati obiettivi principali sia per la ricerca di base che per la scoperta di droga 2 , 3 . A differenza di altre famiglie di recettori che legano ligandi discreti, i GPCRs possono legare tipi molto diversi di molecole. Mentre un GPCR può interagire con i peptidi, un altro può sentire i fotoni, le piccole molecole oi ioni 1 , 4 . Mentre i loro ligandi sono diversi, GPCRs sono unificati nel loro architetto globaleUre e funzione. I GPCR individuali sono costituiti da sette proteine ​​transmembrana a-elicoidali con terminali amino terminali extracellulari e terminali carbossilici intracellulari 5 , 6 . I GPCR sono accoppiati a complessi proteici intracellulari di proteine ​​G-eterotrimerici composti da subunità α, β e γ, che mediano diversi percorsi di segnalazione 7 . La subunità G α è una proteina legante nucleotidica guanina che è inattiva quando legata al guanosina difosfato (PIL) e attiva quando legata al guanosina trifosfato (GTP) 8 , 9 . Quando i GPCR legano i loro ligandi, subiscono una modifica conformazionale che consente di dissociare G α da G βγ , consentendo così G α di scambiare il PIL per GTP 7 . Il recettore stesso è fosforilato al suo terminale carbossilico da varie serine / treoneIne chinasi 10 , 11 e internalizzate per attenuare la segnalazione dei recettori 12 , 13 , 14 . Nel frattempo, il monomero G α attivato e il dimettore G βγ procedono ad attivare percorsi di segnalazione distinti 7 . Esistono diverse isoforme di ciascuna subunità di proteina G, e ogni isoforma si rivolge a particolari vie a valle e sistemi secondari di messaggistica. Le principali isoforme G α includono G s , G q , G i / o e G 12-13 . In genere, i GPCR individuali associano una particolare isoforma G α , collegando così uno stimolo esterno ad una risposta cellulare specifica 1 . Caratterizzare un&#39;interazione GPCR-ligand è fondamentale per comprendere la biologia del recettore. Poiché lo scambio di PIL / GTP è una delle prime vigilanzeNts che segue il binding ligand, monitoraggio del legame GTP può misurare l&#39;attivazione o l&#39;inibizione del GPCR. Analizzare più eventi a valle nella segnalazione GPCR non è spesso quantitativa o stoichiometrica, non può distinguere i full agonisti da quelli parziali e può richiedere costosi reagenti. Inoltre, un aumento del legame GTP alle proteine ​​G α è un evento quasi universale dopo l&#39;attivazione di GPCR, il che significa che la misurazione del legame GTP è un saggio generalmente applicabile per monitorare l&#39;attività della maggior parte dei GPCRs. La misurazione del legame GTP è un approccio semplice e rapido per monitorare la segnalazione GPCR nelle cellule che esprimono l&#39;espressione del recettore di interesse o nel tessuto nativo. Il presente protocollo specifica un test funzionale di legame GTP utilizzando un GPCR archetipo, il recettore μ-opioide (MOR1), per determinare quantitativamente l&#39;attività di un agonista e antagonista sulla segnalazione GPCR. Questo protocollo indica innanzitutto come isolare le membrane grezze dalle cellule che sovrasta l&#39;espressione MOR1. Nota thaQuesto protocollo non è limitato ai sistemi di sovraespressione e può essere applicato a molte fonti di membrana, compresi i tessuti nativi oi preparati che esprimono più recettori e proteine ​​G. Il protocollo spiega poi come misurare il legame di un analogo GTP radioattivo a queste membrane in risposta a varie concentrazioni di [D-Ala, N-MePhe, Glyol] -enkefalin (DAMGO) o naloxone, agonista e antagonista MOR1, rispettivamente. L&#39;analogo GTP, [35S] guanosina-5&#39;-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) non è idrolizzabile. Questa proprietà è critica perché le subunità G α presentano un&#39;attività intrinseca di GTPase 7 e eliminerebbero il gamma fosfato etichettato su una radiochimica GTP idrolizzabile. Le membrane vengono quindi intrappolate sui filtri in fibra di vetro e lavati, dopo di che il GTP radiomarcato viene quantificato mediante conteggio a scintilla liquida. Molti parametri farmacologici possono essere derivati ​​per caratterizzareL&#39;interazione del recettore-ligando, compresa la risposta half-maximal (EC 50 ) e il coefficiente Hill (n H ) per gli agonisti e la concentrazione inibitore half-maximal (IC50) e la costante di dissociazione di equilibrio (Kb) per gli antagonisti 16,17 , 18 .

<table><tbody><tr><td>DMEM, alto glucosio, piruvato, senza glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313021</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030081</td><td>Warm in a 37&deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td>Warm in un 37&deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Opti-MEM I Siero Ridotto Medio Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td>Caldo in 37 gradi C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>16000044</td><td>Caldo in un 37&deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>Coltura cellulare Piastra da 10 cm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Lipofectamina 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Provette per microcentrifuga da 1,6 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato (HEPES)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Tris( idrossimetil)amminometano (base Trizma)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>glicole etilenico-bis(&beta;-amminoetetere)-N,N,N',N'-acido tetraacetico (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA compresse, Mini, EASYpack Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiotreitolo (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DO632</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio (NaCl)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP358-1</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio (MgCl2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-1</td><td></td></tr><tr><td>Motore</td> <td>per pestelli a pelletSigma-Aldrich</td><td>Z359971</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Bel Art</td><td>F19923-0001</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Affymetrix</td><td>10857</td><td></td></tr><tr><td>[35S]guanosina-5'-O-(3-tio)trifosfato ([35S]GTP&gamma; S)&nbsp;</td><td>Perkin Elmer</td><td>NEG030H</td><td></td></tr><tr><td>guanosina-5'-O-(3-tio)trifosfato non radiomarcato (GTP&gamma; S)&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89378</td><td></td></tr><tr><td>guanosina difosfato (GDP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51060</td><td></td></tr><tr><td>reagente Bradford</td><td>Bio-Rad</td><td>5000006</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro UV/VIS</td><td>Beckman Coulter</td><td>DU640</td><td></td></tr><tr><td>spettrofotometro cuvette</td><td>USA Scientific</td><td>9090-0460</td><td></td></tr><tr><td>agitatore orbitale</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>2314</td><td></td></tr><tr><td>thermomixer</td><td>Eppendorf</td><td>535027903</td><td></td></tr><tr><td>filtri in fibra di vetro&nbsp;</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>1821-021</td><td></td></tr><tr><td>apparecchio di filtrazione sottovuoto</td><td>Millipore Corporation</td><td>XX2702550</td><td></td></tr><tr><td>microcentrifuga da tavolo</td><td>Eppendorf</td><td>65717</td><td></td></tr><tr><td>Contatore di scintillazione</td><td>Beckman Coulter</td><td>LS6500</td><td></td></tr><tr><td>fluido di scintillazione...</td><td>Ecoscint A</td><td>LS-273</td><td></td></tr><tr><td>fiale contatore a scintillazione</td><td>Beckman Coulter</td><td>592690</td><td></td></tr><tr><td>coperchi per fiale a scintillazione</td><td>Beckman Coulter</td><td>592928</td><td></td></tr><tr><td>Prism 6</td><td>Software GraphPad</td><td>PRISM 6</td><td></td></tr><tr><td>ATP1A1 anticorpo</td><td>Studi sullo sviluppo Ibridoma</td><td>a6F</td><td>1:1000 in 3% BSA</td></tr><tr><td>GAPDH anticorpo</td><td>EMD Millipore</td><td>CB1001</td><td>1:5000 al 3%</td></tr><tr><td>BSA H2B anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>2934S</td><td>1:2500 al 3%</td></tr><tr><td>BSA PDI Anticorpo</td><td>Segnalazione cellulare</td><td>3501S</td><td>1:1000 al 3% BSA</td></tr><tr><td>HA Anticorpo</td><td>Roche</td><td>11867423001</td><td>1:2000 al 3% BSA</td></tr></tbody></table>

misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con g-proteina mediante la legatura gtp con etichetta radio

Measuring G-protein-coupled Receptor Signaling via Radio-labeled GTP Binding

I recettori G-Proteine-Coupled (GPCRs) sono una grande famiglia di recettori transmembranti che svolgono un ruolo critico nella normale fisiologia cellulare e costituiscono un importante obiettivo farmacologico per molteplici indicazioni, tra cui l&#39;analgesia, la regolazione della pressione arteriosa e il trattamento delle malattie psichiatriche. Su legame vincolante, i GPCR catalizzano l&#39;attivazione delle proteine ​​G intracellulari, stimolando l&#39;incorporazione di guanosina trifosfato (GTP). Le proteine ​​G attivate stimolano quindi i percorsi di segnalazione che provocano risposte cellulari. La segnalazione di GPCR può essere monitorata misurando la incorporazione di GTP, [35S] guanosina-5&#39;-O- (3-tio) trifosfato ([ 35 S] GTPγS) in proteine ​​G, di una forma radiolabelata e non idrolizzabile. A differenza di altri metodi che valutano più processi di segnalazione a valle, il binding di [ 35 S] GTPγS misura un evento prossimale nel segnale GPCR e, cosa importante, può distinguere l&#39;agonisTs, antagonisti e agonisti inversi. Il presente protocollo descrive un metodo sensibile e specifico per studiare la segnalazione GPCR utilizzando preparazioni a membrana grezze di un GPCR archetipo, il recettore μ-opioide (MOR1). Anche se esistono approcci alternativi a frazionamento di cellule e tessuti, molti sono cost-prohibitive, noiosi e / o richiedono apparecchiature di laboratorio non standard. Il metodo presente fornisce una procedura semplice che arricchisce le membrane grezze funzionali. Dopo l&#39;isolamento di MOR1, sono state determinate varie proprietà farmacologiche del suo agonista, [D-Ala, N-MePhe, Glyol] -enkephalin (DAMGO) e antagonista, naloxone.

La frazionamento cellulare può essere usata per isolare e arricchire le proteine ​​associate alle membrane dalle proteine ​​citosoliche e nucleari. La figura 1 è una macchia Western che dimostra il contenuto delle tre frazioni primarie che possono essere raccolte durante il processo di frazionamento subcellulare. In particolare, la figura 1 mostra che la frazionamento separa separatamente le proteine ​​della membrana ( ad es...

Il legame di guanosina trifosfato (GTP) è uno degli eventi più iniziali nell&#39;attivazione del GCR-Receptor (GPCR). Questo protocollo descrive come caratterizzare farmacologicamente interazioni specifiche GPCR-ligand monitorando il legame dell&#39;analogo GTP radio-etichettato, [35S] guanosina-5&#39;-O- (3-tio) trifosfato ([35S] GTPyS) Risposta a un ligando di interesse.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

G-Protein-Coupled Receptors (GPCRs) are a large family of transmembrane receptors that play critical roles in normal cellular physiology and constitute a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare membrane cellulari contenenti recettori accoppiati a proteine G, o GPCR, e studiare la farmacologia dei GPCR mediante un saggio funzionale di legame del GTP. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biochimica riguardo alle proprietà farmacologiche di recettori accoppiati a proteine G già noti o orfani. I principali vantaggi sono la semplicità, la rapidità e la capacità di misurare l'evento più prossimale nella segnalazione dei recettori accoppiati a proteine G.Prima di tutto, seminare cellule renali embrionali umane in una piastra per colture tessutali da 10 centimetri con 10 millilitri di DMEM completo. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica, fino al raggiungimento di una confluenza compresa tra il 70% e l'80%. Al termine dell'incubazione, trasfettare le cellule con HAMOR1 utilizzando un reagente di trasfezione appropriato seguendo le indicazioni del produttore.Quindi, incubare le cellule come descritto in precedenza per 36-48 ore. Dopo aver rimosso le cellule trasfettate dall'incubatore, aspirare il mezzo e risciacquare le cellule con cinque millilitri di PBS fr

measuring-g-protein-coupled-receptor-signaling-via-radio-labeled-gtp

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Qui, descriviamo dettagliati vivere metodi di imaging per lo studio delle cellule chemiotassi. Vi presentiamo fluorescenza metodi microscopici di monitorare le dinamiche spazio-temporali di segnalazione eventi nella migrazione delle cellule. Misurazione di eventi di segnalazione ci permette di capire meglio come un GPCR di segnalazione rete raggiunge gradiente di rilevamento di fattori chemiotattici e controlli migratori direzionale delle cellule eucariotiche.

Receptor Imaging proteina G accoppiata (GPCR)-mediata eventi di segnalazione che chemiotassi di controllo di Dictyostelium discoideum</em

Un metodo per la stima della costante di affinità di un agonista per lo stato attivo...

Quantificare attività agonista a G recettori accoppiati alla proteina

Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

La basato sulla fluorescenza calcio saggio mobilitazione qui descritto è un sistema di screening inversa farmacologia media produttività per l'identificazione di ligando funzionalmente attivazione (s) di orfani accoppiato a proteina G recettori (GPCR).

Caratterizzazione di G recettori accoppiati alla proteina da un calcio di Mobilitazione Assay Basato sulla fluorescenza

Semplici metodi per rilevare l'attivazione selettiva delle proteine G da parte dei recettori accoppiati a proteine G rimangono una sfida eccezionale nella segnalazione cellulare. Qui, i biosensori per il trasferimento di energia di risonanza Förster (FRET) sono stati sviluppati legando a coppie un GPCR a peptidi proteici G per sondare i cambiamenti conformazionali a concentrazioni controllate in cellule vive.

Conformazioni GPCR g di proteine-selettivi misurata utilizzando FRET sensori in un Fluorometer Assay Live Cell Suspension

Il saggio cellulare descritto è stato progettato per l'identificazione del recettore per chemochine CXC 4 (CXCR4)-agenti interagenti che inibiscono o stimolano, sia competitivo o allosterico, il Ca2 + rilascio intracellulare avviato dall'attivazione di CXCR4.

Un'analisi cinetica basata sulla fluorescenza Ca2 + mobilizzazione per identificare il G proteina-ha accoppiato il ricevitore agonisti, antagonisti e modulatori allosterici

Qui descriviamo un protocollo per studiare la prenilazione e guanosina-5'-trifosfato (GTP)-caricamento di Rho GTPasi. Questo protocollo è costituito da due metodi dettagliati, vale a dire del kit membrana frazionamento e un GTPase-collegata dell'immunosorbente. Il protocollo può essere utilizzato per misurare la prenilazione e GTP caricamento di diverse altre piccole GTPasi.

Rilevazione di piccolo GTPase prenilazione e GTP Binding mediante frazionamento di membrana e GTPase-collegata dell'immunosorbente

Dato che i GPCR sono interessanti obiettivi drogabili, lo screening dei ligandi GPCR è quindi indispensabile per l'identificazione dei composti di piombo e per gli studi di deorfanotrizzazione. A fronte di questi sforzi, descriviamo PRESTO-Tango, una piattaforma di risorse open source utilizzata per la profilazione simultanea del reclutamento transitorio di z-arrestin2 a circa 300 GPCR utilizzando un test reporter basato su TEV.

Interrogatorio parallelo del reclutamento di z-Arrestin2 per lo screening dei ligandi su una scala a livello GPCR utilizzando PRESTO-Tango Assay

S1P esercita i suoi diversi effetti fisiologici attraverso la sottofamiglia dei recettori S1P (S1PR). Qui viene descritta una pipeline per illustrare le strutture e la funzione degli S1PR.

Una pipeline per studiare le strutture e le vie di segnalazione dei recettori della sfingosina 1-fosfato

In questo lavoro, viene descritto un saggio di fluorescenza di calcio intracellulare ad alto rendimento per piastre a 384 pozzetti per lo screening di piccole librerie di molecole su recettori accoppiati a proteine G ricombinanti (GPCR). Il bersaglio, il recettore della chinina dalla zecca della febbre bovina, Rhipicephalus microplus, è espresso nelle cellule CHO-K1. Questo test identifica agonisti e antagonisti che utilizzano le stesse cellule in un test di "doppia addizione".

Un saggio di fluorescenza del calcio "a doppia aggiunta" per lo screening ad alta produttività dei recettori accoppiati a proteine G ricombinanti

Questo protocollo descrive l'uso di biosensori basati su BRET per la misurazione in tempo reale dell'attivazione della proteina G nelle cellule HEK293 viventi dopo stimolazione del ligando del recettore accoppiato alla proteina G. Qui, il recettore β2-adrenergico e il recettore dei cannabinoidi di tipo 1 servono come esempi per dimostrare l'efficienza dei sensori per diversi sottotipi di proteine G e in vari GPCR.

Biosensori a base di proteine G basati su BRET per la misurazione dell'attività del recettore accoppiato a proteine G in cellule vive

Impara a misurare il segnalatore del recettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio. Questo metodo semplice e rapido caratterizza le proprietà farmacologiche dei GPCR per studi di biologia cellulare.

Misurazione del segnalatore del ricettore accoppiato con G-proteina mediante la legatura GTP con etichetta radio

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