Un test a blot di 5 mc quantificando il livello di metilazione del DNA della dedifferentiation di condrociti In vitro

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare i livelli di 5-metilcitosina durante la dedifferenziazione dei condrociti. Questo metodo mostra che può aiutare a rispondere a domande chiave nel trattamento dei difetti della cartilagine basati su cellule, come l'impianto di condrociti autologhi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si tratta di un metodo affidabile, semplice e rapido per rilevare il livello generale di metilazione del DNA per valutare il fenotipo dei condrociti.

L'implicazione di questa tecnologia è standard per la nostra quota di impianto di condrociti autologhi perché la metilazione del DNA durante la dedifferenziazione dei condrociti è un ostacolo importante per il trattamento di impianto di condrociti autologhi per i difetti della cartilagine. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sui livelli di metilazione del DNA nella dedifferenziazione dei condrociti, può essere applicato anche ad altri studi su malattie, come l'osteoartrite. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando abbiamo letto i protocolli nei riferimenti di un metodo dot blot.

Si prega di mostrare la dimostrazione di questo metodo è fondamentale in quanto gli stati di punto blot sono difficili da nominare. Il DNA genomico deve essere denaturato e quindi diluito in serie. Quindi essere supportato su una membrana di nylon caricata positivamente.

A dimostrare le procedure sarà Zhaofeng Jia, uno studente laureato del nostro laboratorio. I tessuti della cartilagine articolare utilizzati in questo studio sono stati isolati dalle articolazioni del ginocchio di pazienti donatori dopo un trauma. Usando un bisturi sterile, taglia la cartilagine in pezzi da uno a due millimetri cubi.

Quindi aggiungere un milligrammo per millilitro di collagenasi II e DMEM alla cartilagine tritata. E incubare a 37 gradi Celsius per 12-16 ore per digerire i condrociti. Il giorno seguente, filtrare la sospensione cellulare risultante attraverso un filtro cellulare da 40 micrometri.

Gira le cellule. Scartare il surnatante, aggiungere PBS e ridurre di nuovo la centrifuga. Contare le cellule con un emocitometro.

E seme a una densità di 20.000-30.000 cellule per centimetro quadrato e DMEM integrato con il 10% di FBS e l'1% di penicillina streptomicina. Coltura in incubatrice a 37 gradi Celsius per 48 ore. Raccogliere cellule subconfluenti utilizzando lo 0,25% di tripsina EDTA.

E riplaccare a una densità di 6.600 celle per centimetro quadrato. Coltivare i condrociti in monostrati per un massimo di sei passaggi e valutare ai passaggi uno, due, tre, quattro e cinque. Per iniziare questa procedura, raccogliere le cellule mediante tripsinizzazione e centrifugazione.

Quindi risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di lisi per 10 milioni di cellule mediante pipettaggio e inversione rapida. Incubare per un'ora a 37 gradi Celsius. Aggiungere la proteinasi K a una concentrazione di 160 microgrammi per millilitro di lisato cellulare e capovolgere energicamente la miscela.

Incubare per sei ore a 55 gradi Celsius. Aggiungere a ciascun campione un volume di fenolo saturo Tris pH 7.9 al cloroformio all'alcol isoamilico. Agitare accuratamente il campione a mano per circa 20 secondi.

Centrifugare i campioni a temperatura ambiente a 13.000 volte G per cinque minuti. Rimuovere la fase acquosa superiore e trasferirla in una nuova provetta. Per rimuovere il fenolo, aggiungere un volume uguale di cloroformio a ciascun tubo.

Agitare con la mano e girare verso il basso. Trasferire la fase acquosa superiore in una provetta nuova. Aggiungere 0,1 volume di campione di tre molari di acetato di sodio a pH otto e due volumi di etanolo al 100%.

Conservare le provette a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius durante la notte per far precipitare il DNA genomico. Il giorno seguente, centrifugare i campioni a quattro gradi Celsius per 10 minuti a 16.000 volte G per pellettare il DNA genomico. Lavare i campioni con etanolo al 70%.

E centrifugare a quattro gradi Celsius per due minuti a 13.000 volte G.Rimuovere con cura il surnatante e asciugare all'aria il pellet di DNA. Risospendere il DNA in 10 millimolari tris pH otto EDTA 0,1 millimolari. Inizia questa procedura denaturando il DNA isolato in idrossido di sodio molare 0,1 per 10 minuti a 95 gradi Celsius.

Neutralizzare il DNA con un molare di acetato di ammonio su ghiaccio. E poi diluire due volte con doppia acqua distillata. La fase più critica nei saggi di dot blot è l'individuazione dei campioni, e ricordate di farlo lentamente e con attenzione.

Cerca di ridurre al minimo ogni matrice macchiata a tre o quattro millimetri di diametro. Utilizzando un puntale per pipetta a bocca stretta, individuare con cura due microlitri di DNA genomico diluito in serie su una membrana di nylon caricata positivamente al centro della griglia. Tamponare la membrana a 80 gradi Celsius per 30 minuti.

Successivamente, bloccare i siti di legame degli anticorpi non specifici immergendo la membrana in 5% BSA in TBST in una capsula di Petri di 10 centimetri per un'ora a temperatura ambiente con agitazione delicata. Dopo un'ora, lavare la membrana tre volte in TBST per cinque minuti ogni volta. Incubare la membrana con un anticorpo monoclonale di topo anti-5-metilcitosina in TBST a quattro gradi Celsius durante la notte.

Il giorno seguente, lavare la membrana tre volte in TBST per cinque minuti ogni volta. Quindi incubare con un anticorpo secondario, l'immunoglobulina G di pecora coniugata con perossidasi di rafano in TBST per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato la membrana in TBST come prima, aggiungere il substrato enzimatico alla membrana e incubare per cinque-10 minuti.

Infine, visualizzare il segnale dell'anticorpo secondario utilizzando un kit di chemiluminescenza secondo le istruzioni del produttore. I condrociti coltivati in un monostrato fino al passaggio sei hanno mostrato cambiamenti fenotipici progressivi, diventando altamente pizzicati e appiattiti con i passaggi successivi. Questo cambiamento morfologico è tipico del processo di dedifferenziazione dei condrociti.

Il DNA genomico è stato isolato dai condrociti dopo un numero variabile di passaggi e i livelli di metilazione del DNA sono stati valutati mediante un test dot blot specifico per 5-metilcitosina. Le intensità dei punti sono state quindi analizzate mediante l'immagine J. Livelli progressivamente elevati di cinque metilcitosina sono stati osservati con una subcoltura prolungata, suggerendo un'associazione tra livelli di metilazione generalmente aumentati e dedifferenziazione dei condrociti. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 24 ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di massimizzare la concentrazione e la purezza del DNA genomico. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la profilazione genomica del DNA, per rispondere a ulteriori domande, come i condrociti della dedifferenziazione in monocoltura. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'impianto autologo di condrociti per valutare la lavorazione del DNA dei condrociti e determinare il fenotipo dei condrociti nel trattamento dei difetti della cartilagine.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare il dot blot 5-metilcitosina per rilevare la leva di lavorazione degenerata per valutare il fenotipo dei condrociti. Non dimenticare che lavorare con il fenolo può essere estremamente pericoloso e i guanti devono essere sempre indossati durante l'esecuzione di questa procedura.