Corticale multistrato Ca ²⁺ Imaging nei mouse con movimento libero con sonde a prisma e microscopia a fluorescenza miniaturizzata

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di consentire la visualizzazione simultanea dell'attività neuronale su più strati di neuroni corticali utilizzando indicatori di calcio in un topo che si comporta liberamente e di comprendere il funzionamento del circuito neurale utilizzando un microscopio a fluorescenza miniaturizzato montato sulla testa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze dei sistemi, come ad esempio come si propaga l'informazione attraverso più strati della corteccia. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente di visualizzare grandi popolazioni di neuroni geneticamente codificati su più strati corticali in animali che si comportano liberamente, in modo affidabile nel tempo.

Al fine di visualizzare neuroni geneticamente codificati da più strati corticali in un animale che si comporta liberamente, è necessario eseguire le seguenti procedure e questo protocollo evidenzia l'impianto della sonda a prisma, l'installazione della piastra di base e l'imaging in vivo in un topo che si comporta liberamente. Per iniziare questa procedura, una o due settimane dopo l'iniezione del virus, posizionare l'animale nell'apparato stereotassico e prepararsi per l'intervento chirurgico di impianto della sonda prismatica, disinfettandolo in etanolo al 70% e pulendolo con carta per lenti. Successivamente, apri una craniotomia rotonda, utilizzando un micro trapano con una fresa da 0,5 millimetri.

Assicurarsi che il diametro della craniotomia sia appena maggiore del diametro del prisma. Quindi, posizionare la craniotomia in modo tale che quando il prisma viene inserito nella corteccia, il suo bordo piatto sia rivolto verso il sito di iniezione del virus e si trovi entro un raggio da 150 a 200 micron. Dopodiché, rimuovere la dura madre con una pinza fine.

Mantenere sempre il tessuto umido con soluzione fisiologica sterile, una volta che il tessuto cerebrale è esposto. Questo manterrà anche la pressione sul tessuto. Per alleviare la pressione nel tessuto cerebrale durante l'inserimento della sonda a prisma, creare un tratto di inserimento collegando un coltello di dissezione a lama diritta al braccio portaelettrodo dell'apparato stereotassico.

Montarlo ad angolo, in modo tale che la piastra del coltello sia perpendicolare alla curvatura del cranio e su un piano parallelo alla colonna di iniezione del virus. Posizionare con cura il coltello sopra la craniotomia, lungo il bordo interno del terreno e a circa 200 micron lateralmente al sito di iniezione del virus con il bordo tagliente rivolto posteriormente. Azzerare l'asse Z quando la punta del coltello tocca la pia.

Quindi, abbassarlo gradualmente fino a una profondità tale da quella in cui verrà inserita la sonda a prisma. Successivamente, spostare il coltello di un millimetro posteriormente, per creare un percorso per il bordo d'attacco del prisma. Ritrarre lentamente il coltello utilizzando il micromanipolatore stereotassico del braccio con incrementi di 10 micron al secondo e posizionare un pezzo di spugna in schiuma gel imbevuta di soluzione fisiologica sterile sull'incisione.

Successivamente, fissare il supporto dell'obiettivo al braccio del manipolatore stereotassico con la stessa angolazione del coltello nel passaggio precedente. Allineare il prisma in modo che il lato piatto del prisma sia sopra l'incisione e parallelo alla colonna di iniezione del virus. Una volta che il prisma è all'angolo corretto, abbassarlo gradualmente nel cervello con incrementi di 10 micron fino a un livello Z finale di 1,1 millimetri dalla superficie del cervello, per questa sonda.

Coprire qualsiasi tessuto esposto attorno al prisma nella craniotomia, con un livello protettivo molto sottile di adesivo elastomerico, utilizzando un ago calibro 25. Per evitare che la lente si muova all'interno della craniotomia, dopo che l'adesivo elastomerico è indurito, utilizzare un ago calibro 25 per applicare un po' di adesivo cianoacrilato per fissare il vetro della lente del prisma, al cranio adiacente sopra lo strato di adesivo elastomerico. Una volta indurito l'adesivo cianoacrilato, svitare il supporto dell'obiettivo e rimuovere con cautela il microscopio.

Quindi, ritrarre lentamente il braccio del manipolatore stereotassico, per lasciare la sonda del prisma saldamente impiantata. Applicare uno strato di adesivo acrilico dentale o cianoacrilato attorno all'impianto, per coprire la superficie esposta del cranio senza toccare il tessuto muscolare retratto circostante. Coprire una vasta area del cranio con questa calotta cranica, aiuterà in seguito nell'attacco della piastra di base.

Successivamente, miscelare la base terminale del catalizzatore da una siringa adesiva in silicone e inserire una goccia di elastomero all'interno del bracciale della sonda a prisma, per coprire la parte superiore della lente della sonda, al fine di evitare danni e depositi di polvere. Da una settimana a 10 giorni dopo l'impianto della sonda a prisma, verificare l'espressione del virus nel tessuto attraverso la sonda a prisma impiantata. A tal fine, rimuovere il cappuccio adesivo in silicone sulla superficie della lente della sonda prismatica impiantata.

Esaminare la superficie della lente della sonda e pulire delicatamente eventuali detriti, con carta per lenti ed etanolo al 70%, per assicurarsi che la superficie di imaging sia pulita. Quindi, collegare una piastra di base al microscopio e serrare la vite di fermo della piastra di base per tenerla in posizione. Quindi, fissare il microscopio nella pinza del microscopio sul braccio del micromanipolatore stereotassico.

Fissare la pinza a un'asta che può essere montata sul braccio del micromanipolatore stereotassico. Successivamente, posizionare il microscopio sopra la lente della sonda a prisma, utilizzando il braccio micromanipolatore stereotassico. Ispezionare visivamente l'orientamento osservando la lente del prisma dal lato e dal retro del palco dell'animale.

L'asse ottico dell'obiettivo del microscopio e della sonda a prisma deve essere allineato. Successivamente, avviare il software di acquisizione, selezionare il progetto e accendere il LED del microscopio tramite il software. Valutare la qualità dell'allineamento del microscopio concentrandosi sulla fase superiore della lente della sonda prismatica impiantata nel software di acquisizione, muovendo il braccio manipolatore della stereotassa.

Se allineati correttamente, i bordi della lente della sonda a prisma dovrebbero apparire nitidi. Regolare la distanza fisica del microscopio sopra la sonda prismatica impiantata, utilizzando il braccio manipolatore stereotassico per ottenere il piano focale desiderato all'interno del tessuto. Quindi, utilizzare acrilico dentale o cianoacrilico per fissare in modo permanente la piastra di base al cappuccio acrilico per colmare lo spazio.

È fondamentale non applicare l'adesivo su nessuna parte del corpo del microscopio o sulla vite di fermo mentre si incolla la piastra di base alla testa dell'animale. A questo punto, rilasciare il microscopio dalla pinza e ritrarla dal microscopio. Se è stato utilizzato cianoacrilico o un altro adesivo trasparente, coprirlo con smalto nero o uno strato di cemento dentale nero per evitare perdite di luce ambientale nel cappuccio della testa, che possono contaminare le immagini future acquisite durante gli esperimenti.

Quindi, proteggere la sonda a prisma impiantata con il coperchio della piastra di base. In questa procedura, collegare il microscopio alla sua scatola di acquisizione dati collegata al computer e avviare il software di acquisizione. Quindi, rimuovere il coperchio della piastra di base, ruotando la vite di fermo della piastra di base in senso antiorario ed estraendo il coperchio della piastra di base.

Semina il microscopio nella piastra di base sull'animale. Il microscopio deve scattare in posizione con l'aiuto dei magneti sulla piastra di base. Quindi, far avanzare la vite di fermo della piastra di base fino a quando non si avverte una leggera resistenza.

Successivamente, seleziona le impostazioni di acquisizione da utilizzare per raccogliere i dati, che includono la frequenza dei fotogrammi per l'acquisizione dei dati. Controllare l'istogramma dell'immagine quando si selezionano le impostazioni per garantire un buon rapporto segnale/rumore. Quindi, inizia ad acquisire i dati.

Al termine della registrazione, allentare la vite di fermo della piastra di base e staccare il microscopio dalla piastra di base, tirando delicatamente verso l'alto il microscopio. Successivamente, riposizionare il coperchio della piastra di base e serrare delicatamente la vite di fermo della piastra di base. Ecco una dimostrazione di un animale montato con il microscopio, che interagisce liberamente con gli oggetti nell'arena del comportamento.

Durante l'imaging del comportamento da sveglio con il sistema, l'attività dei neuroni corticali somatosensoriali è stata registrata quando il topo è stato esposto a tre diversi ambienti. Campo aperto il primo giorno, familiarizzazione con l'oggetto dal secondo al quarto giorno e con un nuovo oggetto il quinto giorno. Dopo l'estrazione delle cellule utilizzando il software di analisi dei dati delle immagini del calcio, i filtri spaziali corrispondenti alle posizioni delle cellule sono stati sovrapposti alla proiezione dell'intensità media di fluorescenza dei dati di registrazione del microscopio.

Una linea tratteggiata bianca separa gli strati due, tre e cinque celle. Le corrispondenti tracce di calcio provenienti da cinque cellule di ciascuno degli strati, mostrano il modello di allevamento delle cellule in due diversi contesti comportamentali: familiarizzazione dell'oggetto ed esposizione a nuovi oggetti. Le cellule del secondo strato erano più attive rispetto alle celle del quinto strato il giorno in cui il topo è stato esposto a un nuovo oggetto.

Ecco il resto delle trame delle attività cellulari dai giocatori di entità superficiali, quando l'animale era in campo aperto, la familiarizzazione con gli oggetti e l'esplorazione di nuovi oggetti. Una volta padroneggiata, ogni tecnica può essere completata entro un'ora se eseguita correttamente. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica apre la strada ai ricercatori di neuroscienze dei sistemi, per esplorare tipi di cellule specifiche in diverse aree del cervello, sfruttando diversi paradigmi comportamentali nel droning e altri modelli di neurofisiologia nella malattia.

Da questo protocollo, si dovrebbe avere una buona comprensione di come etichettare più strati di corteccia somatosensoriale, impiantare una sonda a prisma e collegare un microscopio miniaturizzato montato sulla testa.