Name: Un metodo per la produzione di proteine ricombinanti mCD1d in cellule di insetto. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-12-10T22:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Impara a produrre proteine ricombinanti mCD1d in cellule di insetto tramite infezione con baculovirus. Questo metodo consente di generare tetrameri mCD1d per lo studio delle cellule NKT in immunologia.

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I. Scongelare le cellule Prendere il flacone ghiacciato di TN5 cellule, e scongelare in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Aggiungere 5 ml di media insetti Express (Invitrogen, numero di catalogo-10486) a 25 centimetri 2 fiasco TC. Si noti che cinque viene espresso senza Glutammina; bisogno di aggiungere 10 ml di streptococco penna 100X glutammina o glutammina da sola a 1 lt dei media. Aggiungi TN5 cellule in esso e incubare per 30 minuti in un incubatore 27 ° C. Poi, aspirare il terreno con DMSO delicatamente senza disturbare le cellule attaccato al fondo del pallone. Aggiungere 5 ml di terreno fresco. II. Crescita ed espansione delle Cellule Monitorare le cellule ogni giorno. Quando pallone viene quasi il 70% confluenti, portare le cellule in sospensione da sbattere il pallone su entrambi i lati e il trasferimento alle cellule di 175 centimetri 2 fiasco con l&#39;aggiunta di 21 ml di insetti medio espresso e 5 ml di coltura cellulare. Ogni T175 fiasco dovrebbe avere circa 25-30ml mezzo come un volume finale. Split fiasco confluenti (circa 1 milioni / ml conc.) 1 / 4 o 1 / 5, se necessario. Non lasciate proliferare cellule. Contare il numero di passaggi che avete dividere le celle. Non crescere nel passaggio numero 30, perché può provocare l&#39;invecchiamento delle cellule con conseguente lisi cellulare. Quando si raggiunge il volume desiderato alla concentrazione di 1 milioni / ml, infettare le cellule. Io generalmente crescere fino a 2 a 2,5 litri, il che equivale di solito a settanta 175 centimetri 2 palloni e ca. 25 a beuta 30ml /, o cinque beute 1 litro e ca. 400 ml a 500 ml in ogni contenitore Nota: Si può crescere sia le cellule di T-175 fiasco guarnizione o Corning beuta. Le cellule crescono in beute è più veloce e più facile. III. Titolazione del virus con i metodi di diluizione End Point <ol><li> Piastra 3000-5000 cellule per bene in fondo piatto 96 pozzetti in 200ul di Express cinque medio SFM. Lasciate che le cellule stabilirsi a 27 ° C per almeno 30 minuti. </li><li> Fai la diluizione seriale di magazzino baculovirus. Si dovrebbe fare diluizione 1 / 10 in una sola riga di 96 pozzetti fondo a U, con 250ul per bene. Diluizioni sono realizzati in Express Five medio SFM. </li><li> Utilizzando una pipetta multicanale, il trasferimento di un importo fisso (di solito 20 ul) di diluizioni diverse per le cellule. </li><li> Cultura a 27 ° C per 7 giorni. Per evitare l&#39;evaporazione dalle righe bordo, avvolgono i bordi del piatto con parafilm. </li><li> Dopo 7 giorni, controllare il piatto e determinare quale diluizione del virus dà una infezione del 50% - la metà dei pozzi a questa concentrazione sono infetti da virus). Quindi utilizzare una formula per calcolare il titolo, che si esprime in pfu / ml (PFU-placca unità formanti). La formula si trova nei manuali più baculovirus. </li></ol> IV. Infettare le cellule E &#39;molto importante conoscere il titolo esatto del virus. Aggiungi quantità di virus. Validità per la preparazione virale delle cellule infette dovrebbero essere a molteplicità di infezione (MOI) di non più di 1 (1pfu a 1High Cinque cella) superiore MOI porta alla produzione di mutazioni virali. Per la produzione delle proteine, la quantità usuale è MO1 5-10. Esempio: Il titolo di baculovirus mCD1d = 1X108 pfu / ml Aggiungi MOI = 1 (per amplificare il virus) = 20x10 ^ 6 cellule / fiasco / 1x10 ^ 8 pfu / ml = 200 ul / fiasco MOI = 5 a 10 (per la produzione di proteine) = 1 ml a 2 ml Per 20x10 ^ 6 cellule / fiasco Il 4 ° giorno dopo l&#39;infezione, guardare le cellule infette. Dovrebbero essere distaccato, galleggianti, salsicce gonfie e formatura. Surnatanti V. Recupero Prendete il medium da fiaschi infetti, e trasferimento in bottiglie da 250 ml tappo blu Falcon Spinning. Possono essere sterilizzati in autoclave e riutilizzati. Riempire le bottiglie in modo uniforme e centrifugare le cellule in Sorvall GSA rotore a 200gpm, 20 minuti, 4 ° C. Raccogliere il surnatante e proseguire per un&#39;ulteriore purificazione. VI. Purificazione di ricombinante mCD1d <ol><li> Dialisi e concentrazione in un tampone di 150mm fosfato di sodio (pH 7,4) </li><li> Da Ni-NTA Agarosio cromatografia, eluire la proteina mCD1d + B2M con 150mm Fosfato di sodio 200 mM Immidazole </li><li> Esegui colonna Desalificazione con 20 mM Tris HCl pH8 tampone per sbarazzarsi di Immidazole </li><li> Esegui cromatografia a scambio anionico utilizzando colonna MonoQ per eliminare le sostanze contaminanti rimanenti. </li><li> Concentrato di 1mg/ml con YM 30 concentratore (Millipore) </li><li> Biotynlation Bira enzimatica della mCD1d secondo il protocollo del produttore (Avidità) </li><li> La biotina libera è eliminato da colonna S200 (esclusione Chromatograpy dimensione) con tampone fosfato (PBS), pH7.4. Una media di 2 a 3 mg di proteina biotynlated potrebbe essere ottenuto da 2 litri di surnatante </li><li> Produzione di un-Galcer CD1d tetramero. </li></ol> Per caricare molecola CD1d con-Galcer, solubile biotynlated CD1d-b2m è incubato per una notte a temperatura ambiente con tre volte l&#39;eccesso molare di un-Galcer, disciolti in 0,5% di Tween -20 in PBS, cloruro di sodio O.9%. Tetrameri sono generati mediante miscela di a-Galcer monomeri caricato CD1d a 4 volte l&#39;eccesso molare di PE - streptavidina coniugato e incubazione per 4 ore a temperatura ambiente. Conservare a 48 ° C.

<ol><li>Benlagha, K., Weiss, A., Beavis, A., Teyton, L., Bendelac, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+identification+of+glycolipipd+antigen-specific+T+cells+using+fluorecent+CD1d+tetramers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo identification of glycolipipd antigen-specific T cells using fluorecent CD1d tetramers.</a> J. Exp. Med. 191, 1895-1903 (2000).</li>
<li>Kinjo, Y., Wu, D., Kim, G., Xing, G. W., Poles, M. A., Ho, D. D., Tsuji, M., Kawahara, K., Wong, C. H., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recognition+of+bacterial+glycosphingolipids+by+natural+killer+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Recognition of bacterial glycosphingolipids by natural killer T cells.</a> Nature. 434, 520-525 (2005).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+and+antigen+presentation+of+ceramide-containing+glycolipids+by+soluble+mouse+and+human+CD1d+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Binding and antigen presentation of ceramide-containing glycolipids by soluble mouse and human CD1d molecules.</a> J. Exp. Med. 190, 1069-1080 (1999).</li>
<li>Porcelli, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD1+family%3A+A+third+lineage+of+antigen-+presenting+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Immunol%22%5BJournal%5D)">The CD1 family: A third lineage of antigen- presenting molecules.</a> Adv. Immunol. 59, 1-98 (1995).</li>
<li>Sidobre, S., Kronemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD1+tetramers%3A+A+powerful+tool+for+the+analysis+of+glycolipid-reactive+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD1 tetramers: A powerful tool for the analysis of glycolipid-reactive T cells.</a> J. Immunol. 169, 1340-1348 (2002).</li>
</ol>

In questa procedura, viene mostrato come iniziare, crescere, infettare cellule di insetto e come titolo il baculovirus utilizzando queste cellule. Gli aspetti più importanti di questa procedura sono la manutenzione delle celle e di conoscerne il titolo esatto del baculovirus. Una volta che avete generato CD1 tetrameri, possono essere utilizzati come un potente strumento per l&#39;analisi dei glicolipidi cellule T reattive. Baculovirus sistemi sono ampiamente utilizzati anche per la produzione di proteine ​​ricombinanti, compresa tetrameri M...

<table><tbody><tr><td>Express Five SFM</td><td> Mezzo privo di siero</td><td>Invitrogen</td><td>10486025</td><td></td></tr><tr><td>High Five TM</td><td> Cellule di insetto</td><td>Invitrogen</td><td>B855-02</td><td></td></tr><tr><td>Glutamine Pen strep</td><td>Antibiotici</td><td>Invitrogen</td><td>10378-016</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 TC Flask</td><td> Flacone in plastica</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-28</td><td></td></tr><tr><td>175 cm2 TC Flask</td><td> Flacone con tappo sigillante</td><td>Fisher Scientific</td><td>10-126-8</td><td></td></tr><tr><td>Beuta di Erlenmeyer</td><td> Flacone per coltura cellulare</td><td>Fisher Scientific</td><td>07 200 672</td><td></td></tr><tr><td>Concentratore YM 30</td><td>30,000 MWCO</td><td>EMD Millipore</td><td>UFC 903096</td><td></td></tr><tr><td>Attrezzatura FPLC</td><td></td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Enzima BrA e tampone</td><td> Kit per biotinilazione</td><td>Avidity</td><td>BIRA500</td><td></td></tr><tr><td>Colonna Ni-NTA Agarosio</td><td>Colonna per purificazione proteine con tag His</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna di desalazione</td><td> Per rimuovere il sale dalla proteina</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna MonoQ</td><td>Cromatografia a scambio anionico</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonna S200</td><td> Cromatografia di esclusione molecolare</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>alpha-Galcer</td><td> Glicolipide</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Streptavidina-PE</td><td> Per coniugare la proteina</td><td>Molecular Probes, Life Technologies</td><td>S-866</td><td></td></tr></tbody></table>

un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mcd1d in cellule di insetto.

A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.

CD1 proteine ​​costituiscono una terza classe di molecole presentanti l&#39;antigene. Si tratta di glicoproteine ​​della superficie cellulare, espresso in circa 50-kDa glicosilata catene pesanti che sono associati con noncovalently beta2-microglobulina. Si legano i lipidi piuttosto che peptidi. Anche se la loro struttura conferma la somiglianza dei CD1 proteine ​​MHC di classe I e molecole di classe II che presentano l&#39;antigene, il groove mCD1d è relativamente stretta, profonda e altamente idrofoba e ha due tasche vincolanti anziché le tasche diverse superficiale descritto per la classica MHC- codificati che presentano l&#39;antigene molecole. In base al loro sequenze di aminoacidi, come un solco hydrobphobic fornisce un ambiente ideale per il legame di antigeni lipidici. Il Natural Killer T (NKT) le cellule utilizzano per riconoscere il loro TCR glicolipidi legato o presentato da CD1d. Cellule T reattive di lipidi presentati da CD1 sono stati coinvolti nella protezione contro le malattie autoimmuni e infettive e nel rifiuto del tumore. Così, la capacità di identificare, purificare e tenere traccia la risposta del CD1-reattiva delle cellule NKT è di grande importanza. La generazione di tetrameri di alfa galattosiltransferasi ceramide (a-Galcer) con CD1d ha una visione significativa sulla biologia delle cellule NKT. Tetrameri costruite da altre molecole CD1 sono stati generati e questi nuovi reagenti hanno notevolmente ampliato la conoscenza delle funzioni di lipidi cellule T reattive, con un potenziale utilizzo nel monitoraggio della risposta ai vaccini a base di lipidi e nella diagnosi delle malattie autoimmuni e di altre trattamenti.

Un metodo per preparare le cellule degli insetti e infettare con baculovirus per la produzione di ricombinante proteinand mCD1d generare tetrameri mCD1d.

Un metodo per la produzione di proteine ​​ricombinanti mCD1d in cellule di insetto.

Le proteine CD1 costituiscono una terza classe di molecole presentanti l'antigene. Sono glicoproteine di superficie cellulare, espresse come forme glicosilate di circa 50 kDa...

Ciao, sono Ashra Corona del laboratorio del Dottor Mitch Kronenberg del Dipartimento di Immunologia dello Sviluppo presso il La Jolla Institute for Allergy and Immunology. Oggi vi mostrerò come preparare cellule di insetto High Five e infettarle con VIR allo scopo di generare tetrameri di MA CD1D. I tetrameri di CD1D sono utilizzati dal nostro laboratorio e da altri per il riconoscimento delle cellule NKT.I sistemi VIR sono utilizzati ampiamente per produrre proteine ricombinanti, inclusi i tremori di classe MS C due TE. Pertanto, la procedura che verrà mostrata ha un'ampia applicabilità. Questa procedura prevede l'avvio e la coltivazione di cellule di insetto High Five, l'infezione delle cellule con reovirus portatore del cDNA CD1D, la raccolta del soprannatante mediante centrifugazione dopo quattro giorni di infezione, la lisi e la concentrazione della proteina in un buffer di fosfato di sodio 150 millimolare, pH 7,4, la purificazione della proteina murina CD1D mediante cromatografia su resina al nichel e scambio ionico, la concentrazione della proteina CD1D murina a 1 mg per mL utilizzando un concentratore YM30, seguita da biotinilazione enzimatica della proteina murina CD1D secondo il protocollo AvidD e l'eliminazione della biotina libera mediante colonna S200.E infine, la produzione del gel alfa CD1D Tet. Sebbene l'intero procedimento comprenda tutti questi passaggi, oggi vi mostreremo soltanto come manipolare queste cellule e infettarle con il virus allo scopo di generare ulteriori tremori CD1D. Cominciamo.Prima di tutto, vorrei mostrarle come coltivare le cellule di insetto TN five; la linea cellulare High Five deriva da cellule ovariche dell'insetto *Trichoplusia ni*. Queste cellule vengono utilizzate in questo protocollo perché crescono in assenza di siero, sono adattabili a colture in sospensione e producono elevate quantità di proteina ricombinante in cinque ml di mezzo di coltura per insetti in un fiasco da 25 centimetri quadrati. Si noti che il mezzo Insect Express five non contiene glutammina.Quindi dobbiamo aggiungere 10 ml di una soluzione 100x di glutammina e penicillina/streptomicina, oppure solo glutammina, in un litro di mezzo. Ora prenderò la provetta congelata contenente cellule di insetto High Five, scongelerò immediatamente in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius, aggiungerò le cellule di insetto High Five nel flacone e incuberò per 30 minuti a 27 gradi Celsius nell'incubatrice. Successivamente, aspirerò il mezzo per rimuovere il mezzo contenente DMSO delicatamente, senza disturbare le cellule aderenti al fondo del flacone.Ora è necessario aggiungere cinque ml di mezzo fresco nel flacone dopo l'incubazione; a questo punto, dobbiamo espandere le cellule prima dell'infezione con vir. Monitorare le cellule ogni giorno finché il flacone non è quasi al 70% di confluenza. Portare le cellule in sospensione battendo il flacone su entrambi i lati.Trasferire le cellule in un flacone quadrato da 75 centimetri aggiungendo 25 ml di mezzo insettivo e 5 ml di flacone per suddivisione della coltura cellulare. Diluire da 1 a 4 o da 1 a 5 secondo necessità. Non permettere alle cellule di sovraproliferare; contare il numero di passaggi effettuati durante la suddivisione delle cellule.Non superare il numero di passaggio 30 poiché potrebbe causare l'invecchiamento delle cellule con conseguente lisi cellulare. Le cellule devono essere suddivise ogni due giorni. Se si effettua la suddivisione, il rapporto è uno a cinque.Quando si raggiunge il volume desiderato alla concentrazione di 1 milione di cellule per ml per infettare le cellule, di solito coltivo fino a due litri, il che corrisponde generalmente a 7-10 fiasche da 75 cm² con circa 25 ml per fiasca oppure a quattro fiasche ER da un litro con circa 500 ml per fiasca. Coltivare le cellule in fiasche ER è molto più rapido: utilizzare 100 ml di coltura e 400 ml di mezzo Express Five SFM e far crescere in agitazione a 125 giri al minuto (RPM) a una temperatura di 27 gradi Celsius, fino a raggiungere 1 milione di cellule per ml al volume desiderato. Prima di infettare le cellule, vorrei mostrarvi come titolare il virus belo e lo faremo subito dopo. Per titolare il virus, piastrare da 3000 a 5000 cellule per pozzetto.Piastrina in una piastra a 96 pozzetti con fondo piatto in 200 microlitri di mezzo SFM Insect Express Five. Lasciare sedimentare le cellule a 27 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Preparare la diluizione seriale del ceppo avius.Si deve effettuare un'opportuna diluizione in una singola linea di una piastra a 96 pozzetti. La piastra inferiore utilizza 250 microlitri per pozzetto. Le diluizioni vengono eseguite nel mezzo SFM express five.Utilizzando una pipetta multicanale, trasferire una quantità fissa, solitamente 20 microlitri di diverse diluizioni, sulle colture cellulari in un incubatore a 27 gradi Celsius per sette giorni per evitare l'evaporazione dalle file periferiche. Dopo sette giorni, sigillare i bordi della piastra con pellicola. Esaminare la piastra e determinare quale diluizione del virus determina un'infezione al 50%.Quindi utilizzare una formula per calcolare il titolo, espresso in PFU per ml. La formula è riportata nella maggior parte dei manuali sui virus belo. Dopo il ting, il virus, una quantità necessaria di virus per infettare le cellule finalizzata alla produzione di proteine, la molteplicità di infezione dovrebbe essere compresa tra cinque e dieci.Ad esempio, se il titolo dei virus belo di CD1D murino è di cento milioni di unità formanti placche per ml e abbiamo venti milioni di cellule per fiasco, dobbiamo aggiungere da uno a due ml di virus belo per infettare le cellule. Le cellule devono essere infettate per quattro giorni. Al quarto giorno dall'infezione, le cellule dovrebbero staccarsi, galleggiare, apparire gonfie e formare aggregati simili a salsicce.Ora è il momento di recuperare il sopranatante. Prelevare il mezzo dal flacone infetto e trasferirlo in bottiglie Falcon da 250 ml con tappo blu per la centrifuga. Possono essere autoclavate e riutilizzate.Riempire uniformemente le bottiglie e inviarle per centrifugare le cellule con un rotore GSA a 2000 giri/min, per 20 minuti a quattro gradi Celsius. Raccogliere il sopranatante ed eseguire ulteriori passaggi di purificazione. Vi ho appena mostrato come avviare, coltivare e infettare le cellule di insetto High Five e determinare la titolazione del virus baculovirale.Utilizzando queste cellule, gli aspetti più importanti di questa procedura riguardano come mantenere le cellule e come determinare il titolo esatto dei baus. Una volta generati i tremori CD 1D, questi possono essere utilizzati come uno strumento potente per l'analisi delle cellule T reattive ai glicolipidi. Questa procedura per la manipolazione e la colorazione del virus balo può essere utilizzata anche per molte altre proteine ricombinanti.Ecco fatto. Grazie per aver guardato e buona fortuna con i vostri esperimenti.

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