Name: 的多孔冷冻管省去冻结工件时肌肉组织在液氮中直接浸入 (视频) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: 学习使用多孔冷冻管将肌肉组织直接浸入液氮的快速冷冻方法，有效消除冰晶伪影并避免氮气毯效应，确保样本完整性，为神经科学和生物学研究提供可靠的低温保存技术。

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本项目由国家自然科学基金委员会（NSFC）资助：&#160;31301950 和 31671288。

本方法已在本实验室建立并验证，可用于收获和保存超过1,000份肌肉样本以进行组织学染色。所有涉及动物护理和使用的操作均遵循中国农业部制定的指导方针。
1. 样本采集设备
<ol>
	<li>在每个冻存管上标记样品编号。 
	注意：冻存管专为冷冻新鲜组织样本以进行冷冻切片而设计（图1A）。这些冻存管由聚丙烯材料在模具工厂中制成（图1C）。</li>
	<li>准备以下设备：液氮（置于合适的液氮罐中）、护目镜或面罩、冷冻手套、10 cm 镊子、25 cm 镊钳、泡沫塑料保温箱（内径：20 cm 长 × 12 cm 宽 × 13.5 cm 高；外径：24 cm 长 × 16 cm 宽 × 15 cm 高）、塑料薄膜（2.5 cm 长 × 0.8 cm 宽 × 0.1 mm 厚）、手术刀片和 A4 PVC 装订封皮（21 cm × 29.5 cm）（图1B）。</li>
</ol>
2. 肌肉样品的制备
<ol>
	<li>在取样前5分钟，将液氮注入聚苯乙烯泡沫箱中。 
	注意：液氮柱必须足够高，因为当新鲜样品接触液氮时，部分液氮会迅速汽化。为了减少因液氮挥发而需频繁补充的次数，应根据样品数量提前准备合适尺寸的聚苯乙烯泡沫箱。</li>
	<li>获取组织样本后，将其轻轻放置在一张A4尺寸的PVC装订封面上，观察肌纤维走向。 
	注意：本实验中采用猪第一至最后腰椎段的背最长肌横截面样本，样本尺寸约为长12 cm、宽8 cm、高5 cm。</li>
	<li>使用解剖刀沿肌纤维方向在样本上做两条平行切口，切口长约3 cm，间距约0.6 cm。将切取的肌肉修整成约0.6 cm宽 × 0.6 cm高 × 1.5 cm长的矩形块。 
	注意：肌纤维横截面积测量的可靠性主要取决于切取肌肉中肌纤维的方向是否正确。</li>
	<li>用10 cm镊子将样本轻轻放置于塑料薄膜上，使切取肌肉的长轴与薄膜的长边平行（图2A）。 
	注意：塑料薄膜具有两个功能：一是固定作用，有助于保持肌纤维的方向；二是粘附作用，可防止样本因快速冷冻而产生裂纹。</li>
	<li>用镊子将肌肉组织放入已标记的冻存管底部中央位置，正好位于进气孔之间，然后拧紧管盖（图2B）。</li>
</ol>
3. 冻存与储存肌肉样本
<ol>
	<li>使用25 cm的镊子，迅速将整个冷冻管浸入预冷的泡沫箱中的液氮中，等待液氮停止沸腾（约10-20秒）。 
	注意：当液氮沸腾时，冷冻管会漂浮，因此需小心地将冷冻管浸入沸腾的液氮中10-20秒。</li>
	<li>将肌肉样本转移至液氮储存罐或-80 °C超低温冰箱中进行长期保存。</li>
</ol>
4. 载玻片制备
<ol>
	<li>将冷冻切片机预冷至 -20 °C 至 -22 °C 之间。</li>
	<li>取下并丢弃旧的切片刀片，清洁冷冻切片机内的刀架和防卷板，安装新的切片刀片，并将切片厚度设置为 8 µm。</li>
	<li>将装有肌肉样本的冻存管从液氮罐或 -80 °C 冰箱中取出，通过液氮或干冰运输至冷冻切片机。</li>
	<li>等待 30 分钟，使样本温度与冷冻切片机达到平衡。 
	注意：所有可能接触样本的器械均需预先冷却，因为高温可能导致样本中形成冰晶。</li>
	<li>在水溶性乙二醇和树脂混合物（OCT）包埋剂中将样本固定于样本夹上，进行切片，切片厚度为 8 µm。 
	注意：应调整切片角度，使其垂直于肌纤维走向，因为肌纤维横截面积（CSAF）是指肌纤维的横截面面积。</li>
	<li>将切片转移至室温载玻片中央位置，立即将载玻片放入 -80 °C 冰箱中的玻片盒内。切勿让载玻片在室温下干燥。</li>
</ol>

<ol><li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li>
<li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li>
<li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Muscling+in+Cattle%3A+Genes%2C+Husbandry%2C+Carcasses+and+Meat%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li>
<li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Sel+Evol%22%5BJournal%5D)">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).</li>
<li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RYR1+g.1843C%3ET+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G%3EA+mutation+on+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li>
<li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li>
<li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793(2015).</li>
<li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li>
<li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500156343">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li>
<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).</li>
<li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.elsevier.ca/ISBN/9780702042263/Bancrofts-Theory-and-Practice-of-Histological-Techniques">Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e</a>. , Elsevier. (2008).</li>
<li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222964817_Bubble_Size_in_Coalescence_Dominant_Regime_of_Turbulent_Air-Water_Flow_Through_Horizontal_Pipes">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li>
<li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/kikaib1979/53/496/53_496_3516/_article">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li>
<li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500029141">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li>
</ol>

作者声明不存在任何利益冲突，无论是财务方面还是其他方面。

本文介绍了一种用于冷冻和储存肌肉组织以进行肌肉功能组织学评估的新型多孔冻存管。本方案中的关键改进步骤是将多孔冻存管中的样品直接浸入液氮中。据我们所知，与其他现有冷冻方法相比，这是获得优质肌肉冷冻切片样品最简单且最快的方法（参见代表性结果）。
肌肉研究人员面临的技术难题在于，使用冷冻方法使肌肉组织硬化以进行切片时，最容易形成冰晶。如代表性结果所示，有三个因素在决定肌肉组织适合病理学研究的冷冻效果方面起着重要作用，包括选择合适的冷源、尽量减少样本的水分以及增加与冷源接触的总表面积比例。首先，冷冻速率至关重要，以避免在制备冷冻组织切片过程中造成损伤。当冷冻速度较慢时，肌肉组织会表现出众所周知的 &#34;瑞士奶酪&#34; 因为细胞外会形成大的冰晶。当冷冻速度较快但不够迅速时，单个肌细胞内会形成大量细小的针状冰晶。这些针状冰晶不会造成明显的结构损伤，但会引起以下效应：线粒体受损10，肌纤维的尺寸被人为增大11，且纤维结构的完整性遭到破坏11因此，...

从营养和加工角度来看，骨骼肌是产肉动物最有价值的组成部分。在肉类工业中，有两个尤为关键的方面：肌肉生长效率和最终肉品的质量。作为肌肉的主要组成部分，肌纤维与动物的生长性能和鲜肉品质直接相关1。例如，肌纤维总数（TNF）和肌纤维横截面积（CSAF）主要决定了肌肉质量与肉品品质；此外，肌纤维类型组成（FTC）对鲜肉品质具有显著影响2。因此，调控动物肌纤维特性是提高养殖场核心盈利能力和竞争力的有效手段1。
迄今为止，已发现多种内在和外在因素可调控肌纤维特性1。这种调控可通过选择具有特定基因的动物来实现，例如牛的Myostatin基因3、羊的Callipyge基因4以及猪的RYR1和IGF2基因5。此外，饮食调控及特定激素处理在肌纤维特性形成中也发挥重要作用6。因此，结合遗传与营养因素的方法可能有助于提高瘦肉含量和肉类品质。然而，由于肌纤维结构的解析仍具挑战性，肉类工业中关于肌纤维的研究仍较为有限。
肌纤维特性可通过组织化学方法鉴定，例如肌球蛋白三磷酸腺苷酶（ATPase）检测法。该方法基于以下原理：位于肌纤维薄切片（6–8 µm）中的酶可与特定化学试剂发生反应。然而，无论部位如何（即背部、腹部或后肢），猪、兔、小鼠和人类肌肉的含水量均超过75%7。肌肉中如此高的水分含量在冰冻切片制备过程中常导致一个普遍问题——冷冻假象，如先前所述8,9。根据我们的经验，在屠宰场生产线上几乎不可能适当地冷冻肌肉组织。
本文介绍了一种在本实验室用于高通量冷冻肌肉组织以进行冰冻切片的简单且高效的方法。该方法的亮点在于使用一种专为在液氮中快速冷冻肌肉组织而设计的新型冻存管。当前的工作流程可同时实现组织的冷冻与处理，从而获得高质量的肌肉冰冻切片，其细胞质区室清晰可见，肌纤维与周围组织紧密贴合。此外，由于液氮不与组织发生混合，该方案可广泛适用于多种组织学分析方法。

<table><tbody><tr><td>冷冻切片机</td><td>&amp;nbsp;Leica</td><td>Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>数码显微镜&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;冷冻管&amp;nbsp;&amp;nbsp; 塑料薄膜</td><td></td><td></td><td>自行设计</td></tr><tr><td>液氮</td><td></td><td></td><td>常用</td></tr><tr><td>手术刀</td><td></td><td></td><td>常用</td></tr><tr><td>10 cm 镊子</td><td></td><td></td><td>常用</td></tr><tr><td>25 cm 镊子</td><td></td><td></td><td>常用</td></tr><tr><td>防护眼镜</td><td></td><td></td><td>常用</td></tr><tr><td>冷冻手套</td><td></td><td></td><td>常用</td></tr></tbody></table>

一种多孔冻存管可消除肌肉组织直接浸入液氮时产生的冷冻伪影

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

骨骼肌生理学研究面临的技术挑战之一是如何恰当地处理样本，以获得细胞质区室清晰可见的切片。另一个难题是肌纤维与周围组织紧密结合。由于组织固定和石蜡包埋过程会导致肌纤维收缩，因此冷冻是用于切片前硬化肌肉组织的理想方法。然而，在制备冰冻切片时，由于肌肉组织含水量高，常会出现冰晶形成的问题。本文所述方案首先介绍了一种简单且高效的方法，通过将肌肉组织浸入液氮中实现适当冷冻。单独使用液氮存在的问题是，会在组织附近形成一层氮气屏障，起到隔热作用，从而抑制组织的冷却。为避免这种“气化层”效应，设计了一种新型冷冻管，通过在管壁上总共打14个进液孔，以加快液体在组织表面的流动速度。根据气泡动力学原理，液体流速越高，产生的气泡越小，形成气体屏障的可能性也越低。当液氮通过进液孔流入冷冻管时，组织周围的流速足以消除气体屏障。与使用预冷异戊烷冷冻肌肉组织的方法相比，本方案更简便、高效，可用于高通量地冷冻肌肉组织。此外，对于无法获取异戊烷（室温下极易燃）的机构而言，该方法尤为适用。

制备冷冻切片过程中用于冷冻肌肉组织的冻存管示意图及常用实验设备如图1所示。这些冻存管由聚丙烯材料在模具工厂中制成。每支冻存管共有14个进液孔：一个位于管盖上，一个位于管底，其余12个孔以四排平行排列，每排四个孔，彼此成90°角分布。这些进液孔可加快液氮在组织周围的流动速度，避免液氮接触组织时产生“汽膜”效应，从而显著减少冷冻样品中冰晶的形成。重要的是，本方法无需使用沸点为28 °C、极易挥发且易燃的异戊烷。
为了进一步突出该方法的优势，我们采用五种不同的冷冻方法对猪的背最长肌（longissimus dorsi）进行冷冻，随后使用苏木精/伊红（HE）染色观察其染色特性及组织学细节（图3）。在肌肉冷冻切片制备过程中，一个常见问题是冰晶的形成。当样本直接放入-80 °C冰箱中冷冻时（图3A），会形成较大的冰晶，从而在肌肉冷冻切片中产生众所周知的“...

本方案描述了一种将肌肉组织直接浸入液氮中进行冷冻的方法。本方案还介绍了一种新型冻存管，可在液氮接触样品组织表面时避免氮气的&#34;隔热效应&#34;。

骨骼肌生理学研究面临样本处理的技术难题，需通过适当方法制备切片，以获得横纹结构清晰可见的……

本实验的总体目标是通过将肌肉组织直接浸入液氮中进行冷冻，同时消除冷冻过程中产生的假象。我实验室的学生何茂章将与黄一中共同演示该操作步骤。首先，在每个冻存管上标记样品编号。然后，准备好以下设备：液氮罐、护目镜或面罩、防冻手套、10 厘米长的镊子和 25 厘米长的镊子。同时准备好聚苯乙烯泡沫箱、塑料薄膜、手术刀和 A4 PVC 装订封套。为制备肌肉样本，首先用液氮充满泡沫箱。获取标本后五分钟内，将样本轻轻放置在一张A4尺寸的PVC装订封面上，观察肌纤维走向。接着，使用解剖刀沿肌纤维方向在标本上做两条平行切口，切口长约3厘米，间距约0.6厘米。将切开的肌肉修整成一个长约1.5厘米、宽约0.6厘米、高约0.6厘米的矩形块状。然后，使用10厘米的镊子，将样本轻轻放置在一块塑料膜上，使切开的肌肉长轴与塑料膜的长边平行。将肌肉组织放入已标记的冷冻管的下中部，正好位于进样孔之间，并拧紧管盖。为冷冻组织样本，使用25厘米的镊子迅速将整个冷冻管浸入预冷的泡沫箱中的液氮里，等待直至液氮不再沸腾。液氮应足以浸没整个冻存管，且冻存管应完全位于液面以下。将肌肉样本转移至液氮储存罐或-80摄氏度冰箱中进行长期保存。必须避免冷冻肌肉与室温容器或仪器发生意外接触。制备切片时，先将冷冻切片机预冷至-20摄氏度至-22摄氏度之间。取出并丢弃旧的切片刀片，并用清洁布擦拭切片机内的刀架和防卷板。然后，在冷冻切片机中安装新的切片刀片，并将切片厚度设置为8 µm。从液氮罐或-80摄氏度冰箱中取出装有肌肉样本的冻存管，置于液氮或干冰中。随后将样本转移至冷冻切片机，静置30分钟，使样本温度与冷冻切片机环境温度达到平衡。使用OCT包埋样本后，将样本安装至样本夹持器中。然后，切取八微米厚的切片。将切片置于室温载玻片中央。立即将载玻片放入载玻片盒中。然后，将载玻片盒放入 -80 摄氏度冰箱中。切勿使载玻片在室温下干燥。如图所示，当猪背最长肌样本直接放入 -80 摄氏度冰箱时，形成了冰晶，导致肌肉冷冻切片出现典型的“瑞士奶酪”效应。当肌肉组织直接浸入液氮时，也会形成冰晶。采用另一种方法时，将组织以适当方向浸入OCT包埋介质，然后在异戊烷悬浊液中快速冷冻，肌纤维的细胞质区室内会形成许多针状冰晶。将组织冷冻至多孔冷冻管中，可实现优异的样本完整性，细胞质区室清晰可见，且肌纤维与周围组织紧密贴合。采用该方法，分析了快收缩肌纤维和慢收缩肌纤维中的ATP酶活性。在相同染色时间下，快收缩纤维呈浅色，着色程度为两级，而慢收缩纤维呈深黑色。在此处展示的标准冷冻方法中，将肌肉组织浸入异戊烷悬浮液中，且不与OCT包埋介质直接接触；然而，异戊烷悬浮液的固液状态难以维持超过一小时，且异戊烷并非随时可得。

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的多孔冷冻管省去冻结工件时肌肉组织在液氮中直接浸入

在本视频中，我们演示了一种用于保存生物样本的超快速冷冻玻璃化方法。该方法通过使用多种冷冻保护剂的组合，防止细胞内冰晶形成，从而保护生物组织免受冷冻损伤。...

基于玻璃化法的冷冻保存：一种超快速冷却技术，用于在极低温度下长期保存生物样本

本视频介绍了快速冷冻肌肉组织并获取其薄切片的操作步骤。该技术有助于研究结肠癌小鼠模型中与癌症相关的恶病质。...

肌肉组织切片的速冻方法：一种获取快速冷冻小鼠肌肉组织超薄切片的实验方案

通过适当的制备方法，可极大地方便对骨骼肌组织进行结构、功能和生化特性的分析。本方案描述了适用于多种表型研究的骨骼肌组织制备的适当方法。...

组织分拣与冷冻：骨骼肌疾病模型的制备

获得高质量的透射电子显微镜图像具有挑战性，尤其是在植物细胞中，因其含有大量充满水的液泡和通气空间。串联的高压冷冻与快速冷冻置换技术可显著缩短植物样品透射电镜制样的时间，同时获得超微结构保存极为良好的样品。...

植物组织的串联高压冷冻与快速冷冻置换透射电子显微镜制样技术

本文展示了冷冻、包埋、冷冻切片及染色肌肉活检组织的最高效方法，以避免产生冷冻假象。...

用于组织学分析的肌肉冷冻切片制备中的注意事项

本文描述了一种简便且低成本的冷冻固定方法，用于通过透射电子显微镜观察悬浮细胞。...

冷冻蚀刻：用于透射电子显微镜下悬浮细胞超微结构与免疫定位研究的工具

收集连续的冷冻切片，以实现组织学应用，并利用单个小鼠骨骼肌的相邻区域富集RNA，用于基因表达检测。从20 - 30 mg...

单只小鼠骨骼肌连续区域的冷冻切片用于基因表达与组织学分析

本文介绍了一种将冷冻样品低温转移至动态核极化（DNP）魔角旋转（MAS）核磁共振（NMR）探头的实验方案。该方案包括实验前转子的储存方法，以及实验前后样品活性检测的操作步骤。...

将低温样品装入魔角旋转核磁共振波谱仪并保持细胞活性的方法

本文概述了用于手动冷冻生物样品以进行单颗粒冷冻电子显微镜观察的印迹-投入法。...

生物样品单颗粒冷冻电镜观测的手动印迹- plunge 冷冻制备方法

本方案描述了一种利用酪胺交联透明质酸水凝胶包封并培养小鼠卵巢前腔卵泡的新型三维（3-D）培养模型。我们还详细介绍了通过玻璃化冷冻法进行卵巢卵泡冷冻保存的两种方法。...

一种新型透明质酸水凝胶在卵泡三维培养中的应用及小鼠卵巢卵泡冷冻保存方法

学习使用多孔冷冻管将肌肉组织直接浸入液氮的快速冷冻方法，有效消除冰晶伪影并避免氮气毯效应，确保样本完整性，为神经科学和生物学研究提供可靠的低温保存技术。

一种多孔冻存管可消除肌肉组织直接浸入液氮时产生的冷冻伪影

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