Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da Drosophila Fotorecettori

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di ottenere registrazioni di voltage clamp di intere celle da una singola cella fotorecettrice per misurare le correnti indotte dalla luce derivanti dall'assorbimento di un singolo fotone e dalle risposte ripetute alla luce intensa. Questo metodo può aiutare ad affrontare argomenti chiave del campo della trasduzione sensoriale, come la trasduzione visiva per i meccanismi fisici e ionici che sono alla base della fototrasduzione e le proprietà dei canali TRP. I vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica includono il pieno controllo della tensione della membrana e un rapporto segnale/rumore estremamente elevato e la possibilità di introdurre indicatori specifici per le misure ottiche.

In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà con le dimensioni minime del preparato e la necessità di eseguire rapidamente la dissezione a causa di una vulnerabilità metabolica del tempo. Per questa procedura, allevare mosche a una densità di circa 20 per fiala. Al momento dell'esperimento, avere alcune fiale con pupe che stanno per essere chiuse e sono state sotto costante oscurità per almeno 24 ore.

Due ore prima del ritiro degli adulti, rimuovere tutti gli adulti chiusi. Maneggiare sempre le mosche regolate al buio nei fazzoletti sotto l'illuminazione a luce rossa. In attesa delle mosche appena chiuse, preparare la camera di registrazione.

Sul fondo della camera, fissare il vetrino coprioggetti utilizzando paraffina fusa o grasso siliconico ad alto vuoto per completare il bagno. Quindi montare il bagno sul tavolino del microscopio invertito. Nella vasca, posizionare il tubo del sistema di perfusione, il tubo del sistema di aspirazione e il filo di terra per la configurazione dell'elettrofisiologia.

Prima di iniziare la dissezione, preparare alcune soluzioni sul retro di una capsula di Petri da 60 millimetri. Depositare quattro gocce separate di ES senza calcio e una goccia di TS. Ora, usando una pinzetta ruvida, cattura una mosca che si è recentemente chiusa per le ali o per il corpo. Quindi, utilizzando una pinzetta fine, staccare la testina e trasferire rapidamente la testina sulla prima goccia di ES senza calcio. Sotto uno stereoscopio, sezionare la testa a metà lungo il piano sagittale usando un secondo paio di pinzette sottili.

Assicurati che entrambi gli occhi rimangano intatti. Ora trasferisci 1/2 della testa alla seconda goccia di ES senza calcio e l'altra metà della testa alla terza goccia di ES senza calcio. Quindi procedere con la dissezione di uno dei due occhi.

Usando una pinzetta sottile, rimuovi il più possibile il tessuto che circonda l'occhio per assicurarti che non vengano causati danni alla retina. Quindi afferrare saldamente il bordo della cornea con una pinzetta sottile e scavare la retina. Il risultato dovrebbe essere una cornea intatta vuota separata da una retina intatta.

Le pipette sono conservate in etanolo, quindi, quando si utilizza una nuova pipetta per triturazione, sciacquarla sempre prima con acqua. Ora riempi la pipetta risciacquata con un piccolo volume di ES privo di calcio dalla quarta goccia. Quindi, utilizzando una delicata aspirazione della bocca, aspirare la retina isolata nella pipetta.

Evitare di intrappolare le bolle d'aria con estrema cautela. Quindi depositare la retina nella goccia di TS. Quindi, ripeti l'isolamento della retina sul secondo occhio in modo che entrambi siano ora nella goccia TS. Quindi rimuovere delicatamente solo l'ES privo di calcio dalla capsula di Petri e aggiungere altre sei gocce di TS sulla superficie della piastra.

Trasferisci entrambe le retine in nuove gocce di TS. Quindi sostituire la pipetta per triturazione con una che abbia un'apertura di piccolo diametro. Dopo averlo risciacquato, riempire la pipetta con una goccia di TS. Usando questa pipetta, aspirare ed espirare rapidamente e ripetutamente entrambe le retine per separare alcuni ommatidi dalle cellule del pigmento. Il TS si annebbia mentre ciò accade.

Quindi, trasferisci i resti di entrambe le retine in un'altra goccia di TS. Quindi, caricare la pipetta con la goccia torbida TS contenente gli ommatidi isolati. Espirare la soluzione nella camera del bagno. Ripetere questa procedura con pipette di triturazione di diametro inferiore decrescenti fino a quando la retina non si è completamente dissolta.

Ora, aspetta un minuto. Durante questa pausa, gli ommatidi isolati si legheranno al fondo della camera. Dopo un minuto, iniziare a far scorrere ES contenente 1,5 millimolari di calcio utilizzando il sistema di perfusione.

Quando la camera è piena, assicurarsi che il filo di terra e il tubo di aspirazione siano sommersi. Lasciare scorrere la soluzione per 60-90 secondi prima di procedere. Per iniziare, utilizzare l'obiettivo 40x per ispezionare attentamente gli ommatidi nella vasca da bagno.

Si noti che i corpi cellulari fotorecettori allungati che formano l'ommatidio sono staccati dai loro assoni ma rimangono vitali. Ora scegli un ommatidium adatto per l'esperimento. Selezionare questa opzione quando soddisfa i seguenti criteri.

La membrana esterna deve essere liscia e integra. L'asse lungo deve essere quasi ad angolo retto rispetto all'approccio dell'elettrodo dal lato distale. E l'ommatidium non dovrebbe essere circondato da alcun tessuto in eccesso.

Una volta selezionato, centrare l'ommatidium nel campo visivo. Ora riempi una pipetta con la soluzione intracellulare appropriata per l'esperimento. E arrotondare la pipetta al portaelettrodo.

Quindi soffiare nel tubo della pipetta per creare una pressione positiva e bloccare la pressione chiudendo la valvola del tubo. Quindi, inserire la pipetta nella camera del bagno e guidarla vicino alla sezione distale dell'ommatidium fino a quando non si osserva una piccola fossetta nella membrana, dovuta alla pressione positiva della pipetta patchata. Aprire ora il modulo di test a membrana nel software di registrazione per applicare impulsi di tensione quadra continua di due millivolt a una velocità di 100 hertz.

Successivamente, utilizzando i controlli dell'amplificatore patch clamp, impostare il potenziale di giunzione su zero per impostare la base dell'impulso quadrato su zero corrente. Quindi aprire la valvola per rilasciare la pressione nella pipetta e aspirare delicatamente per creare una pressione negativa. La pipetta deve quindi attaccarsi alla membrana cellulare.

Una volta che ciò si verifica, chiudere la valvola per bloccare la pressione. Ora controlla la resistenza dell'elettrodo. Dovrebbe essere elevato tra 100 e 150 megaohm.

Quindi rilasciare la pressione negativa nella pipetta aprendo nuovamente la valvola. La resistenza dovrebbe ora salire fino a un numero compreso tra uno e due gigaohm, il che indica che si è formata una C tra la pipetta e la cella. Quindi, utilizzando l'amplificatore patch clamp, compensare la corrente capacitiva della pipetta.

Per effettuare la configurazione dell'intera cellula, rompere la membrana cellulare utilizzando l'aspirazione della bocca. Crea rapidi, brevi e forti attacchi di pressione negativa nell'elettrodo. Dopo aver ottenuto la configurazione a cella intera, si verificherà un improvviso aumento della capacità.

Quindi, utilizzando l'amplificatore patch clamp, impostare il potenziale di tenuta sulla tensione richiesta e compensare le correnti capacitive in resistenza in serie. Ora chiudi la tenda nera francese della gabbia di Faraday e inizia l'esperimento. Dopo aver ottenuto la configurazione a cellula intera con una pipetta patch contenente il colorante fluorescente, il giallo Lucifero, si può vedere che solo uno dei fotorecettori che formano l'ommatidio è stato caricato con il colorante.

Questo fotorecettore sarà anche isolato elettricamente dai suoi vicini nell'ommatidio. Gli ommatidi con tensione bloccata a cellula intera da mosche di tipo selvatico e mosche con mutazioni nei geni InaC o InaD hanno mostrato urti quantici in risposta alla luce fioca continua. Una lenta terminazione delle protuberanze è stata osservata in entrambi i mutanti rispetto ai moscerini di tipo selvatico.

Risposte normalizzate a impulsi luminosi di 500 millisecondi erogati a 150.000 fotoni al secondo, le fisiologie alterate sono illustrate in modo chiaro. Utilizzando la preparazione, è stato anche possibile misurare le risposte all'urto quantico con tensione bloccata a una breve luce fioca di un millisecondo. Tali risposte a singolo fotone sono state confrontate in mosche mutanti con arresto di tipo selvatico e in mosche mutanti ninaC.

Entrambi i mutanti risposero con una serie di urti. Risposte normalizzate a un impulso di luce di 500 millisecondi erogato a 15.000 fotoni al secondo. Quindi la lenta terminazione della risposta macroscopica si osserva nei mutanti arrestina-2 e ninaC.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare registrazioni di cellule intere da cellule fotorecettrici di Drosophila. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se eseguita correttamente. Questa tecnica ha spianato la strada ai ricercatori per comprendere meglio i canali TRP e la segnalazione lipidica dell'inositolo, nonché il ruolo delle cellule gangliari retiniche intrinsecamente fotosensibili presenti nei mammiferi che sono coinvolte in attività dipendenti dalla luce non formatrici di immagini.