Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da

L'obiettivo generale di questa procedura è ottenere registrazioni in voltage clamp su cellule intere da un singolo fotorecettore per misurare le correnti indotte dalla luce derivanti dall'assorbimento di un singolo fotone e dalle risposte ripetute a luce intensa. Questo metodo può contribuire a chiarire argomenti fondamentali nel campo della trasduzione sensoriale, come la trasduzione visiva, sia per quanto riguarda i meccanismi fisici che quelli ionici alla base della fototrasduzione e le proprietà dei canali TRP. I vantaggi dell'utilizzo di questa tecnica includono il completo controllo del potenziale di membrana, un rapporto segnale-rumore estremamente elevato e la possibilità di introdurre indicatori specifici per misurazioni ottiche.

Generalmente, le persone nuove a questo metodo incontreranno difficoltà a causa delle piccole dimensioni del campione e della necessità di eseguire la dissezione rapidamente, a seguito di una vulnerabilità metabolica temporale. Per questa procedura, allevare le mosche a una densità di circa 20 per provetta. Al momento dell'esperimento, avere a disposizione alcune provette con pupe che stanno per chiudersi e che sono state mantenute al buio costante per almeno 24 ore.

Due ore prima di raccogliere gli adulti, rimuovere tutti gli adulti già schiusi. Manipolare sempre le mosche adattate al buio con tessuti sotto illuminazione rossa. Durante l'attesa delle mosche appena schiuse, preparare la camera di registrazione.

Fissare il coprivetrino alla base della camera utilizzando paraffina fusa o grasso siliconico ad alto vuoto per completare il bagno. Quindi montare il bagno sul tavolino del microscopio invertito. All'interno del bagno, posizionare il tubo del sistema di perfusione, il tubo del sistema di aspirazione e il cavo di messa a terra per l'allestimento di elettrofisiologia.

Prima di iniziare la dissezione, preparare alcune soluzioni sul retro di una piastra di Petri da 60 millimetri. Depositare quattro gocce separate di ES priva di calcio e una goccia di TS. Ora, utilizzando pinzette grossolane, afferrare una mosca appena schiusa per le ali o per il corpo. Successivamente, usando pinzette fini, staccare la testa e trasferire rapidamente la testa nella prima goccia di ES priva di calcio. Sotto uno stereomicroscopio, dissezionare la testa a metà lungo il piano sagittale utilizzando una seconda coppia di pinzette fini.

Assicurarsi che entrambi gli occhi rimangano integri. Trasferire ora metà della testa nella seconda goccia di ES priva di calcio e l'altra metà della testa nella terza goccia di ES priva di calcio. Procedere quindi con la dissezione di uno dei due occhi.

Utilizzando pinzette fini, rimuovere il più possibile il tessuto circostante l'occhio per assicurarsi che non venga arrecato alcun danno alla retina. Successivamente, afferrare saldamente il bordo della cornea con pinzette fini e estrarre delicatamente la retina. Il risultato dovrebbe essere una cornea intatta e vuota, separata da una retina intatta.

Le pipette sono conservate in etanolo; pertanto, quando si utilizza una nuova pipetta per triturazione, è necessario sciacquarla sempre prima con acqua. Riempire ora la pipetta sciacquata con un piccolo volume di ES privo di calcio dalla quarta goccia. Quindi, utilizzando un'aspirazione delicata con la bocca, aspirare la retina isolata all'interno della pipetta.

Evitare con estrema cautela la formazione di bolle d'aria. Successivamente, depositare la retina nella goccia di TS. Ripetere quindi l'isolamento della retina sul secondo occhio in modo che entrambe siano ora nella goccia di TS. Poi, rimuovere delicatamente soltanto l'ES priva di calcio dalla piastra di Petri e aggiungere altre sei gocce di TS sulla superficie della piastra.

Trasferire entrambe le retine in nuove gocce di TS. Quindi sostituire la pipetta per triturazione con una che abbia un'apertura di piccolo diametro. Dopo averla risciacquata, riempire la pipetta con una goccia di TS. Utilizzando questa pipetta, aspirare ed espellere ripetutamente ed in modo rapido entrambe le retine per separare alcuni ommatidi dalle cellule del pigmento. Il TS diventerà torbido durante questo processo.

Successivamente, trasferire i resti di entrambe le retine in un'altra goccia di TS. Poi, caricare la pipetta con la goccia torbida di TS contenente gli ommatidi isolati ed espellere la soluzione nella camera del bagno. Ripetere questa procedura utilizzando pipette per triturazione di diametro sempre più piccolo fino a quando la retina non si sarà completamente dissolta.

Ora, attendere un minuto. Durante questa pausa, gli ommatidi isolati si attaccheranno al fondo della camera. Dopo un minuto, iniziare a far fluire la soluzione ES contenente calcio 1,5 millimolare utilizzando il sistema di perfusione.

Mentre la camera viene riempita, assicurarsi che il cavo di messa a terra e il tubo di aspirazione siano immersi. Lasciare scorrere la soluzione per 60-90 secondi prima di procedere. Per iniziare, utilizzare l'obiettivo 40x per ispezionare attentamente gli ommatidi nel bagno.

Si noti che i corpi cellulari allungati dei fotoricettori che formano l'ommatidio sono staccati dai loro assoni ma rimangono vitali. A questo punto, selezionare un ommatidio adatto per l'esperimento. La scelta deve avvenire quando sono soddisfatti i seguenti criteri.

La membrana esterna deve essere liscia e integra. L'asse maggiore deve essere quasi perpendicolare rispetto all'avvicinamento dell'elettrodo dal lato distale. Inoltre, l'ommatidio non deve essere circondato da tessuto in eccesso.

Dopo aver effettuato la selezione, posizionare l'ommatidio al centro del campo visivo. Riempire ora una pipetta con la soluzione intracellulare appropriata per l'esperimento. Inserire quindi la pipetta nel porta-elettrodo.

Quindi soffiare nel tubo della pipetta per creare una pressione positiva e bloccare la pressione chiudendo la valvola del tubo. Successivamente, inserire la pipetta nella camera del bagno e guidarla vicino alla sezione distale dell'ommatidio finché non si osserva una piccola fossetta nella membrana, causata dalla pressione positiva della pipetta sigillata. A questo punto, aprire il modulo di test della membrana nel software di registrazione per applicare impulsi quadrati di tensione continui di due millivolt a una frequenza di 100 hertz.

Successivamente, utilizzando i controlli dell'amplificatore per il patch clamp, impostare il potenziale di giunzione a zero in modo da portare la base dell'impulso quadrato a corrente zero. Quindi aprire la valvola per rilasciare la pressione nella pipetta ed aspirare delicatamente per creare una pressione negativa. La pipetta dovrebbe quindi attaccarsi alla membrana cellulare.

Dopo che ciò si verifica, chiudere la valvola per bloccare la pressione. A questo punto, verificare la resistenza dell'elettrodo. Dovrebbe essere aumentata tra 100 e 150 megaohm.

Quindi rilasciare la pressione negativa nella pipetta riaprendo la valvola. La resistenza ora dovrebbe aumentare bruscamente tra uno e due gigaohm, indicando che si è formato un C tra la pipetta e la cellula. Successivamente, utilizzando l'amplificatore per la tecnica del patch clamp, compensare la corrente capacitiva della pipetta.

Per ottenere la configurazione whole-cell, rompere la membrana cellulare mediante aspirazione orale. Applicare brevi e rapidi impulsi di pressione negativa nell'elettrodo. Dopo aver ottenuto la configurazione whole-cell, si verificherà un improvviso aumento della capacità elettrica.

Quindi, utilizzando l'amplificatore per patch clamp, impostare il potenziale di clamping al voltaggio richiesto e compensare le correnti capacitive nella resistenza in serie. Ora chiudere la tenda nera francese della gabbia di Faraday e iniziare l'esperimento. Dopo aver ottenuto la configurazione whole-cell con una pipetta per patch contenente il colorante fluorescente, giallo di lucifero, si può osservare che solo uno dei fotoricettori che formano l'ommatidio è stato caricato con il colorante.

Questo fotorecettore sarà inoltre isolato elettricamente dai suoi vicini nell'ommatidio. Ommatidi in configurazione whole-cell voltage clamp prelevati da moscerini di tipo selvaggio e da moscerini con mutazioni nei geni InaC o InaD hanno mostrato risposte quantistiche in seguito a luce fioca continua. In entrambi i mutanti è stata osservata una terminazione lenta delle risposte rispetto ai moscerini di tipo selvaggio.

Risposte normalizzate a impulsi luminosi di 500 millisecondi somministrati a 150.000 fotoni al secondo, le fisiologie alterate sono chiaramente illustrate. Utilizzando il preparato, è stato persino possibile misurare risposte quantistiche di tipo "bump" in condizioni di voltage clamp su cellule intere a luce debole di durata di un millisecondo. Tali risposte a singolo fotone sono state confrontate in moscerini di tipo selvatico, mutanti per l'arrestina e mutanti per ninaC.

Entrambi i mutanti hanno risposto con una serie di picchi. Risposte normalizzate a un impulso luminoso di 500 millisecondi somministrato a 15.000 fotoni al secondo. Pertanto, la lenta terminazione della risposta macroscopica viene osservata nei mutanti arrestina-2 e ninaC.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come effettuare registrazioni su cellule intere dai fotorecettori di Drosophila. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in un'ora se realizzata correttamente. Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori per comprendere meglio i canali TRP e il segnaling dei lipidi inositolo, nonché il ruolo dei neuroni gangliari retinici intrinsecamente fotosensibili presenti nei mammiferi, coinvolti in attività dipendenti dalla luce non legate alla formazione di immagini.