Name: Frazione di membrana del cervello: An Ex Vivo Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 49 s
Description: Impara la frazione di membrana cerebrale per isolare proteine sinaptiche dal cervello di topo. Questo metodo es vivo consente di studiare la distribuzione delle proteine in condizioni normali e patologiche.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Ministero dell&#39;Economia e della Compagnia / Instituto de Salud Carlos III (SAF2014-55700-P, PCIN-2013-019-C03-03 e PIE14 / 00034), Institutional Catalonia de Recerca i Estudis Avançats (ICREA Academia-2010 (SBO-140028) a FC Inoltre, X. M, VF-D e FC appartengono al gruppo di ricerca accreditato &quot;Neuropharmacology and Pain&quot; (Generalitat de Catalunya, 2014 SGR 1251) . Il lavoro è stato sostenuto anche dal &quot;Programa Pesquisador Visite Especial-Ciência sem Fronteiras&quot; da CAPES (Brasile) a FC

Tutte le procedure sperimentali animali sono state approvate dal Comitato di Barcellona per l&#39;Uso e la Cura degli Animali (CEEA), conformemente alle linee guida descritte nella Guida per la cura e l&#39;uso degli animali da laboratorio11 e seguendo la Comunità Europea, la legge 86/609 / CCE, FELASA e ARRIVE. Così, i topi sono alloggiati in gabbie standard, con accesso ad libitum all&#39;alimentazione e all&#39;acqua e vengono mantenute in condizioni standard controllate (ciclo scuro / leggero da 12 ore a partire da 7:30 AM, temperatura di 22 ° C e umidità del 66%). 1. Ottenere Synaptosomes del cervello del mouse usando un Gradiente Discontinuo di Sucroso Nota: Questo metodo è stato segnalato in precedenza 10 . <ol><li> Preparare tampone di isolamento fresco (IB), pH 7,4; 2 M saccarosio; 1 M saccarosio / 0,1 mM CaCl2; E 0,1 mM CaCl2 (vedi tabella 1 ). Chill le soluzioni sul ghiaccio. </li><li> SaCrizione di cinque topi per dislocazione cervicale. Decapitate e rimuovete rapidamente il cervello di ogni animale. Disciogliere la regione cerebrale di interesse (cioè l&#39;ippocampo, 0,25-0,35 g di tessuto fresco) e metterlo in un tubo di vetro Potter-Elvehjem da 5 ml su ghiaccio con 1 ml di IB. </li><li> Homogenizzare il tessuto utilizzando un agitatore omogeneizzante (10 colpi a 700-900 rotazioni al minuto), preferibilmente in un bagno di ghiaccio per evitare il riscaldamento del campione. </li><li> Posizionare il tessuto omogeneizzato (1 mL) in un tubo da 15 mL contenente 6 mi di saccarosio da 2 M e 2,5 mL di 0,1 mM CaCl2 a 4 ° C. Mescolare lentamente invertendo il tubo. Nota: l&#39;aggiunta di calcio è essenziale per mantenere le interazioni adesive tra gli organelli e quindi per preservare la struttura delle diverse &quot;densità&quot;. </li><li> Posizionare la soluzione in un tubo da centrifuga da 12 ml e aggiungere lentamente 2,5 ml di saccarosio di 1 M / 0,1 mM CaCl2 sopra ogni tubo per formare il gradiente di saccarosio. Nota: contrassegnare la posizione oF l&#39;interfaccia di gradiente sul tubo centrifuga utilizzando un indicatore permanente. </li><li> Pesare e equilibrare i tubi di centrifuga con soluzione IB all&#39;interno dei rispettivi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura. </li><li> Centrifugare i tubi per 3 ore a 100.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a pozzo. Riempire completamente il rotore con tutti i supporti in acciaio (anche vuoto, se necessario). </li><li> Scartare il livello superiore contenente mielina. Con una pipetta Pasteur raccogliere l&#39;anello bianco tra l&#39;interfaccia di saccarosio 1,25-M e 1-M corrispondente alla frazione sinaptosoma. </li><li> Diluire i sinaptosomi con 9X il loro volume usando IB in un tubo di centrifuga. </li><li> Pesare e equilibrare i tubi di centrifuga con soluzione IB all&#39;interno dei rispettivi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura. </li><li> Centrifugare i tubi per 30 minuti a 15.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a pozzo. </li><li> Scartare il surnatante e riposizionareE con 10 ml di soluzione IB. Raccogliere 100 μL di questa soluzione sinaptosomica e centrifugare per 5 minuti a 11.000 x g e 4 ºC. </li><li> Riposizionare il pellet sinaptosomico in sodio dodecil solfato (SDS) al 5% e memorizzare questo campione a -20 ° C. Nota: Questo campione corrisponderà alla frazione totale di sinaptosomi per ulteriori analisi Western blot. La restante frazione sinaptosomica (~ 1 ml) può essere congelata a -20 ° C fino all&#39;uso o elaborata per la successiva frazionamento subsintattico. I sinaptosomi o le sinapsi purificati rappresentano tra il 1 e il 2% del volume totale ippocampale 12 . </li></ol> 2. Isolamento pre-, post- ed extrasinaptico <ol><li> Preparare un tampone di solubilizzazione fresco 2x, pH 6,0; 1x tampone di solubilizzazione, pH 6,0; Tampone di solubilizzazione, pH 8,0; E 0,1 mM CaCl2 (vedi tabella 1 ). Chill le soluzioni sul ghiaccio. Nota: il pH di queste soluzioni dovrebbe essere accuratelY regolato per ottenere una buona frazionamento subsynaptic. </li><li> Diluire lentamente la frazione sinaptosomale resuspendente da 1 mL (vedere la fase 1.12) con 5 mL di 0,1 mM CaCl2. </li><li> Aggiungere lo stesso volume (5 mL) di tampone di solubilizzazione 2x a ghiaccio freddo, pH 6,0 e incubare per 50 minuti su ghiaccio sotto agitazione elevata in un bicchiere su ghiaccio. Nota: mentre l&#39;1% di Triton X-100 a pH 6.0 solubilizza tutte le proteine ​​della membrana plasmatica, conserva le proteine ​​all&#39;interno dei contatti o dei giunti sinaptici ( vale a dire, strutture pre e postsynaptiche). </li><li> Mettere la soluzione in un tubo di centrifuga. Pesare e equilibrare i tubi con volumi equivalenti di 0,1 mM CaCl2 e 2x soluzione tampone di solubilizzazione, pH 6,0, all&#39;interno dei rispettivi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura. </li><li> Centrifugare i tubi per 30 minuti a 40.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a pozzo. Il supernatante risultante rappresenta la frazione extrasinaptica,E il pellet corrisponde alle giunzioni sinaptiche ( cioè, frazioni pre- e postinaptiche). </li><li> Concentrare il supernatante contenente la frazione extrasinaptica a un volume finale di 200 μL usando un tubo filtrante da 15 mL di 10K centrifugato a 4.000 xg e 4 ºC. </li><li> Precipitare la frazione extrasinaptica risultante risultante (200 μL) con 5 volumi (1 ml) di acetone pre-refrigerato (-20 ° C) per una notte a -20 ° C. </li><li> Il giorno dopo, centrifuga la frazione extrasinaptica per 30 minuti a 18.000 x g e -15 ° C. Dopo la centrifugazione, scartare il supernatante di acetone e asciugare il pellet per rimuovere qualsiasi traccia di acetone. </li><li> Infine, risospendere il pellet contenente le proteine ​​extrasinaptiche con 200 μL di 5% SDS. Sonicare il pellet, se necessario. </li><li> Senza interromperla, lavare attentamente il pellet contenente le frazioni pre- e postsinaptiche con 2 mL di tampone di solubilizzazione 1x, pH 6,0. Scartare il buffer. </li><li> RisospendereIl pellet con 10 ml di tampone di solubilizzazione 1x, pH 8,0, utilizzando una pipetta di vetro Pasteur. Nota: mentre l&#39;1% di Triton X-100 a pH 8,0 solubilizza la specializzazione presinaptica, conserva la densità postinaptica insolubile 4 . </li><li> Incubare la sospensione per 50 minuti su ghiaccio sotto agitazione elevata in un bicchiere su ghiaccio. </li><li> Mettere la soluzione in un tubo di centrifuga. Pesare e equilibrare i tubi con una soluzione di tampone di soluzione solubilizzazione, pH 8,0, all&#39;interno dei relativi supporti in acciaio e con i loro coperchi di chiusura. </li><li> Centrifugare i tubi per 30 minuti a 40.000 x g e 4 ° C utilizzando una centrifuga a rotore a cilindro oscillante; Il supernatante risultante corrisponde alla frazione presinaptica e al pellet alla frazione postsinaptica. </li><li> Processare il surnatante contenente la frazione presinaptica, come descritto nei passaggi 2.6-2.9. </li><li> Resuspendere la pellicola contenente la frazione postsinaptica con 200 μL di SDS al 5%. Sonicare il pellet, iF richiesto. </li></ol> 3. Analizzare i campioni mediante immunoblot per convalidare la frazionamento della membrana <ol><li> Determinare la quantità di proteine ​​in ciascuna frazione ( cioè le frazioni totali, extra-, pre- e post-sinaptiche) utilizzando il saggio della proteina dell&#39;acido bicinconico. </li><li> Prendere 20 μg di proteine ​​da ciascuna frazione e diluire fino ad un volume finale di 50 μl di SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Bollite per 5 min a 100 ºC. </li><li> Separare le proteine ​​mediante elettroforesi SDS-PAGE 10%, con un gel di concentrazione del 4% in condizioni riducenti. Elettroforesi a tensione costante di 80 V fino a quando il colorante entra nel gel inferiore e quindi aumenta la tensione a 120 V. </li><li> Trasferire le proteine ​​in una membrana PVDF e bloccare con IB soluzione di bloccaggio per 45 minuti a temperatura ambiente a scuotimento continuo. </li><li> Incubare la membrana durante la notte a 4 ºC con l&#39;anticorpo primario indicato ( cioè anti-SNAP-25,Anti-PSD-95, anti-sinaptofisina o anti-GPR37) diluita nella soluzione di blocco IB sotto scosse continue. </li><li> Lavare la membrana tre volte (10 min ciascuno) con la soluzione di lavaggio IB per eliminare l&#39;anticorpo primario non legato. </li><li> Incubare con l&#39;anticorpo secondario indicato per 90 min in condizioni scure a temperatura ambiente sotto scosse continue. </li><li> Lavare la membrana tre volte (10 min ciascuna) con la soluzione di lavaggio IB per eliminare l&#39;anticorpo secondario non legato. </li><li> Incubare la membrana con substrato chemiluminescente (preparare il miscuglio in condizioni scure e seguire la proporzione 1: 1 della soluzione A e B fornita dal produttore). </li><li> Analizzare la membrana in un dispositivo di rilevamento chemiluminescente. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Il protocollo qui presentato costituisce un potente strumento biochimico per lo studio della distribuzione subsinaptica di specifiche proteine all'interno di qualsiasi regione del cervello. Tuttavia, ci sono alcuni inconvenienti inerenti alla tecnica che meritano di essere evidenziati qui. Ad esempio, uno dei principali limiti è la quantità relativamente grande di tessuto necessaria per purificare una quantità ragionevole di proteine al fine di eseguire l'analisi immunoblot di tutte le frazioni subsinaptiche. Questo prob...

La trasmissione sinaptica si basa sull&#39;integrità fisica della sinapsi, un concetto che era stato previsto già nel 1897 da Foster e Sherrington 1 . Così, la comprensione della distribuzione dei componenti chiave di neurotrasmissione ( es. Canali ionici, recettori, ecc. ) È essenziale per chiarire la funzione sinaptica, sia in condizioni normali che patologiche. La microscopia elettronica (EM) ha contribuito enormemente all&#39;attuale nozione ultrastrutturale delle sinapsi prototipali del sistema nervoso centrale (CNS). In tal modo, EM ha stabilito finemente le differenze tra densità pre- e postinaptica, che sono separate da una fessura di una distanza piuttosto uniforme (~ 25 nm) 2 . È interessante notare che l&#39;apparato postinaptico presenta un ispessimento relativamente continuo, elettrone-denso, sotto la sua membrana plasmatica, la cosiddetta densità postinaptica o PSD 2 . Al contrario, all&#39;apparato presinaptico, un avvisoLa rete cytomatica discontinua è disposta appena sotto la membrana plasmatica, che è essenziale per l&#39;allineamento e l&#39;ancoraggio delle vescicole sinaptiche alla zona attiva della membrana plasmatica 3 . Quindi, EM costituisce l&#39;approccio sperimentale d&#39;oro per studiare la distribuzione delle proteine ​​all&#39;interno di sinapsi CNS strutturalmente conservati. Tuttavia, le informazioni fornite da microscopi elettronici sono statici. Infatti, le evidenze accumulate mostrano che le sinapsi in vivo sono estremamente dinamiche, provando quindi drammatiche modifiche strutturali alla trasmissione sinaptica sostenuta. Inoltre, la morfologia e la composizione delle sinapsi possono cambiare in diverse regioni del CNS e su sviluppo, maturazione, invecchiamento e sviluppo di condizioni neuropatologiche. Nel complesso, un protocollo focalizzato sull&#39;isolamento di proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici in condizioni fisiologiche rappresenta uno strumento prezioso per uno studio più completo del funzionamento sinaptico. <p cQui descriviamo questo tipo di approccio sperimentale complementare, che consente l&#39;arricchimento biochimico preparatorio dei diversi compartimenti sinaptici della membrana, vale a dire domini a membrana extra-, pre- e postsynaptici. Questo metodo di frazionamento della membrana, descritto per la prima volta da Philips et al . (2001) 4 , si basa su un cambiamento di pH che indebolisce le interazioni adesive che si verificano all&#39;interno dell&#39;apparato pre- e postinaptico. In primo luogo, utilizzando detergenti delicati a pH 6,0, è possibile distinguere la giunzione aderente che contiene l&#39;apparato pre- e postsinaptico e che viene mantenuto dal dominio della membrana extrasynaptica, che è solubilizzato e quindi può essere estratto dai contatti sinaptici. Successivamente, sollevando il pH da 6,0 a 8,0 in presenza di detergenti delicati, indebolisce la forza della giunzione aderente che mantiene la zona attiva presinaptica strettamente legata alla densità postinaptica. Quindi, lo scompartimento presinaptico è cosìLubrificata e può essere separata dalla densità postsinaptica, che è per lo più conservata perché la concentrazione del detergente utilizzato non promuove la sua solubilizzazione 4 . È interessante notare che l&#39;efficienza di frazionamento, eventualmente superiore al 90%, può essere confermata da diversi marcatori sottosintesi: i ) la proteina associata alla sinaptosoma 25 (SNAP-25), dalla zona attiva presinaptica; Ii ) sinaptofisina, dalla frazione extrasinaptica ( cioè, al di fuori della zona attiva e microsomi inclusi); E iii ) proteina densità postinaptica 95 (PSD-95), dalla densità postinaptica. In particolare, questo metodo di frazionamento della membrana cerebrale è stato utilizzato con successo. Di conseguenza, è stato possibile determinare con precisione la localizzazione subsynaptica di diversi recettori, quali i recettori 5 dell&#39;acido alfa-ammino-3-idrossi-5-metil-4-isossazolepropionico (AMPA), il recettore dell&#39;adenosina A1 (A 1 R) 6 ,Adenosina A 2A (A 2A R) 7 , adenosine trifosfato (ATP) P2, 8 recettori recettori del acetilcolino nicotinico 9 e recettore GPR3710 associato alla malattia di Parkinson. Tuttavia, una serie di limitazioni può ostacolare la corretta valutazione della distribuzione sinaptica di una particolare proteina neuronale. Quindi, in questa procedura, non solo descriviamo completamente l&#39;intero protocollo, ma evidenziamo anche alcuni punti critici da prendere in considerazione, come la quantità piuttosto elevata di tessuti necessari, la bassa resa proteica e il requisito obbligatorio per convalidare l&#39;efficienza Ogni separazione prima di eseguire l&#39;esperimento definito.

<table><tbody><tr><td>Saccarosio</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.316.211.211</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>2.112.211.210</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&middot; 6H2O</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.313.961.210</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi Set III</td><td>Millipore, Darmstadt, Germania</td><td>535140</td><td></td></tr><tr><td>Trizma Base</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.236.541.209</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Blu Pancreas Bromofenolo</td><td>Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.311.651.604</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitolo</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma, St. Louis, MO, USA</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Latte</td><td></td><td></td><td></td>secco scremato</tr><tr><td>NaCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.216.591.211</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.314.941.210</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Merck</td><td>4873</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Pancreac Qu&iacute; mica SL, Barcellona, Spagna</td><td>1.316.781.211</td><td></td></tr><tr><td>Basic 20 pH</td><td>Crison, Alella, Spagna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polytron VDI 12 Omogeneizzatore adattabile</td><td>VWR, Radnor, PA, USA.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Provette ultratrasparenti (14x89 mm)</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcellona</td><td>344059</td><td>Le provette devono essere riempite quasi completamente quando vengono utilizzate per evitare collassi dovuti all'ultracentrifugazione.</td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra-15 Ultracel -10K</td><td>Merck Millipore, Darmstadt, Germania</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga 5430R</td><td>Eppendorf, Amburgo, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K Ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter, Hospitalet de Llobregat, Barcellona</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonifier 250</td><td>Branson, Danbury, Connecticut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amersham Imager 600</td><td>GE Healthcare Europe GmbH, Barcellona, Spagna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vetro monouso Pasteur Pippetes 230 mm</td><td>VWR, Radnor, PA, USA</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>Bilancia compatta EK-610</td><td>A& D, Tokyo, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pierce&commercio; Kit per il dosaggio delle proteine BCA</td><td>Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato chemiluminescente SuperSignal west pico</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GR 200 Bilancia di precisione</td><td>A& D, Tokyo, Giappone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-GPR37</td><td>Anticorpo anti-GPR37 fatto in casa prodotto e convalidato nel laboratorio Francisco Ciruela.</td><td></td><td>Anticorpi primari utilizzati a una concentrazione finale di 0,250 &mu; g/mL</td></tr><tr><td>Anti-SNAP-25, anti-PSD-95, anti-sinaptofisina</td><td>Abcam, Cambridge, Regno Unito</td><td></td><td>Anticorpi primari diluiti 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP-coniugati capra anti-topo IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Anticorpo secondario diluito 1:10.000</td></tr><tr><td>HRP-coniugato capra anti-coniglio IgG</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA.</td><td></td><td>Anticorpo secondario diluito 1:30.000</td></tr></tbody></table>

frazione di membrana del cervello: an<em&gt; ex vivo</em&gt; approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

Brain Membrane Fractionation: An Ex Vivo Approach to Assess Subsynaptic Protein Localization

La valutazione della composizione e della funzione sinaptica della proteina costituisce una sfida importante nella neuroscienza. Tuttavia, non è facile valutare la neurotrasmissione che si verifica all&#39;interno delle sinapsi perché è altamente regolata da interazioni proteiche-proteiche dinamiche e eventi di fosforilazione. Di conseguenza, quando uno qualsiasi metodo viene utilizzato per studiare la trasmissione sinaptica, un obiettivo principale è quello di preservare queste modifiche fisiologiche transitorie. Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici. In altre parole, il protocollo descrive una metodologia biochimica per realizzare arricchimento proteico dai compartimenti presinaptici, postinaptici e extrasinaptici. In primo luogo, sinaptosomi o terminali sinaptici vengono ottenuti da neuroni che contengono tutti i compartimenti sinaptici mediante un gradiente discontinuo di saccarosio. Da notare, la qualità di questa preparazione iniziale della membrana sinaptica è critical. Successivamente, l&#39;isolamento dei diversi compartimenti sottinaptici viene raggiunto con la solubilizzazione leggera usando detergenti delicati a condizioni di pH differenziali. Ciò consente la separazione mediante gradiente e centrifughe isopiche. Infine, l&#39;arricchimento delle proteine ​​nei differenti compartimenti subsintaptici ( cioè frazioni di membrana pre-, post- ed extrasinaptiche) viene convalidato mediante analisi di immunoblot mediante marcatori proteici sinaptici ben caratterizzati ( cioè SNAP-25, PSD-95 e sinaptofisina, Rispettivamente), consentendo così una valutazione diretta della distribuzione sinaptica di qualsiasi particolare proteina neuronale.

La metodologia descritta è stata ampiamente utilizzata per l&#39;analisi subsynaptica delle proteine ​​neuronali in generale e per l&#39;isolamento e la caratterizzazione biochimica dei ricercatori sinaptici 5 , 6 , 7 , 8 , 9 in particolare. È interessante notare che il risultato rappresentativo mostrato qui mostra l&#39;utili...

Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine ​​appartenenti a diversi compartimenti sinaptici.

Frazione di membrana del cervello: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica

Assessing the synaptic protein composition and function constitutes an important challenge in neuroscience. However, it is not easy to evaluate ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici dal cervello di topi. Descrivere la distribuzione dei componenti della trasmissione cinetica è essenziale per comprendere la funzione sinaptica sia in condizioni normali che patologiche. Diverse evidenze mostrano che le sinapsi in vivo sono estremamente dinamiche e possono subire cambiamenti strutturali drammatici pur mantenendo la trasmissione sinaptica.Le sinapsi sono state classica­mente studiate mediante microscopia elettronica. Questo metodo di fraziona­mento delle membrane si basa sulla combina­zione di ablazione laser utilizzando detergenti blandi in condizioni di pH diversi, seguita da una centrifuga­zione di breve durata. In breve, il cervello del topo viene asportato e l'ippocampo viene accurata­mente disse­cato in una bella piastra fredda posizionata su ghiaccio tritato.Gli ippocampi vengono raccolti in un tubo di vetro Potter-Elvehjem contenente tampone di isolamento freddo di ghiaccio. Successivamente, il tessuto raccolto viene omogeneizzato utilizzando un agitatore omogeneizzatore. In seguito, il tessuto omogeneizzato viene mescolato con una soluzione di saccaros

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In situ frazionamento subcellulare delle cellule di mammifero su vetrini microscopio permette la visualizzazione della localizzazione delle proteine.

In situ Frazionamento subcellulare di cellule di mammifero aderenti e non aderenti

Questa procedura illustra come isolare dal cervello di topo adulto i mitocondri associate membrane ER o MAMS e glicosfingolipidi-arricchiti frazioni microdomini di MAMs e preparati mitocondriali.

I mitocondri associati Membrane ER (MAMs) e glicosfingolipidi microdomini arricchiti (GEM): Isolamento dal cervello di topo

Traffico di membrana neuronale controlla dinamicamente la membrana plasmatica disponibilità di proteine ​​e gli impatti in modo significativo la neurotrasmissione. Ad oggi, è stato impegnativo per misurare neuronale traffico endocitico in neuroni adulti. Qui, descriviamo un metodo quantitativo altamente efficace per misurare rapidi cambiamenti nell'espressione della proteina superficie ex vivo in fettine cerebrali acute.

Slice Cervello biotinilazione: An<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Approccio alla Misura Regione-specifica proteina Tratta plasma membrana in neuroni adulti

Questo articolo descrive l'arricchimento di proteine ​​associate con la membrana plasmatica sinaptica da ultracentrifugazione su gradiente di saccarosio discontinuo. La successiva preparazione di proteine ​​di densità post-sinaptica è anche descritto. Preparati proteici sono adatti per western blotting o l'analisi 2D DIGE.

Preparazione di Synaptic membrana plasmatica e Proteine ​​densità postsinaptica Utilizzo di un gradiente di saccarosio discontinuo

L'identificazione di molecole e percorsi che controllano la plasticità sinaptica e la memoria è ancora una grande sfida nelle neuroscienze. Qui, viene descritto un flusso di lavoro che affronta la quantificazione relativa delle proteine sinaptiche presumibilmente coinvolte nella riorganizzazione molecolare delle sinapsi durante l'apprendimento e nel consolidamento della memoria in un paradigma di apprendimento uditivo.

Alta risoluzione Quantitative Synaptic Proteome profiling di cervello di topo Regioni Dopo uditiva discriminazione Learning

Endocitosi delle vescicole sinaptiche sono rilevato da microscopia chiara di pHluorin fuso con proteine delle vescicole sinaptiche e da microscopia elettronica dell'assorbimento della vescicola.

Endocitosi delle vescicole sinaptiche in colture di neuroni ippocampali di misura

Sequestro di electroconvulsive (ECS) è un modello sperimentale animale della terapia electroconvulsive per la depressione grave. ECS globalmente stimola l'attività nell'ippocampo, che conduce a sinaptogenesi e plasticità sinaptica. Qui, descriviamo i metodi per induzione ECS in ratti e per frazionamento subcellulare dei loro ippocampi per esaminare le modifiche grippaggio-indotto proteine sinaptiche.

Sequestri di Electroconvulsive in ratti e frazionamento dei loro ippocampi di esaminare grippaggio-indotto cambiamenti nella densità postsinaptica proteine

Qui, presentiamo un protocollo per eseguire un'analisi quantitativa del livello di associazione di membrana plasmatica per etichetta fluorescente marginalmente-collegata della proteina. Il metodo si basa sulla decomposizione computazionale della membrana e citoplasmatico componente del segnale osservato in cellule identificate con marcatore fluorescente della membrana plasmatica.

Determinazione della membrana plasmatica di partizionamento per marginalmente-associated Proteins

Qui, descriviamo un approccio quantitativo per determinare la distribuzione di una proteina sinaptica rispetto una proteina marker mediante immunofluorescenza, microscopia confocale e analisi computerizzata.

Quantificare la distribuzione eterogenea di una proteina sinaptica nel cervello del Mouse mediante immunofluorescenza

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Questo protocollo presenta un metodo robusto e dettagliato per ottenere sinaptosomi altamente puri, vescicole sinaptiche e altre frazioni sinaptiche dal cervello del topo. Questo metodo consente la valutazione dei processi sinaptici, compresa l'analisi biochimica della localizzazione e della funzione delle proteine con risoluzione compartimentale.

Frazionamento subcellulare per l'isolamento di componenti sinaptici dal cervello murino

Impara la frazione di membrana cerebrale per isolare proteine sinaptiche dal cervello di topo. Questo metodo es vivo consente di studiare la distribuzione delle proteine in condizioni normali e patologiche.

Frazione di membrana del cervello: An

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