Frazione di membrana del cervello: An Ex Vivo Approccio per valutare la localizzazione della proteina subsynaptica
May 12th, 2017
Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per isolare le proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici.
L'obiettivo generale di questa procedura è quello di isolare proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici dal cervello di topo. Descrivere la distribuzione dei componenti della trasmissione cinetica è essenziale per comprendere la funzione sinaptica sia in condizioni normali che patologiche. Prove sempre più numerose dimostrano che le sinapsi in vivo sono estremamente dinamiche e possono subire drammatici cambiamenti strutturali che sostengono la trasmissione sinaptica aperta.
Le sinapsi sono state studiate classicamente mediante microscopia elettronica. Questo metodo di frazionamento a membrana si basa sulla combinazione di obliterazione laser con detergenti delicati in diverse condizioni di pH, seguita da una centrifugazione in una frazione di secondo. In breve, il cervello del topo viene rimosso e il suo ippocampo viene accuratamente sezionato in un bel piatto freddo seduto su ghiaccio tritato.
Gli ippocampi vengono raccolti in un tubo di vetro Potter-Elvehjem contenente un tampone di isolamento ghiacciato. Successivamente, il tessuto raccolto viene omogeneizzato utilizzando un agitatore omogeneizzatore. Successivamente, il tessuto omogeneizzato viene miscelato con una soluzione di saccarosio e calcio.
Quindi l'estratto di tessuto viene ricoperto con una soluzione concentrata di saccarosio calcico. I campioni vengono quindi centrifugati. La frazione di membrana contenente i sinaptosomi è facilmente riconoscibile come un anello denso che galleggia all'interno dell'interfaccia della soluzione di saccarosio.
Successivamente l'isolamento dei diversi compartimenti sub-sinaptici, vale a dire le frazioni extra, pre e post sinaptiche, si ottiene combinando la solubilizzazione leggera con detergenti delicati in condizioni di pH differenziato. Infine, l'arricchimento proteico nei diversi compartimenti è convalidato dall'analisi immunoblot. Il giorno dell'esperimento preparare soluzioni fresche e raffreddarle con ghiaccio.
Metti il cervello in una capsula di Petri seduta su ghiaccio tritato e contenente 10 millilitri di tampone di isolamento ghiacciato. Seziona con cura l'ippocampo con l'aiuto di un paio di pinze. Trasferisci l'ippocampo in una provetta di vetro Potter-Elvehjem da cinque millilitri contenente un millilitro di tampone isolante ghiacciato.
E poi omogeneizzare utilizzando un agitatore omogeneizzante. Trasferire il tessuto omogeneizzato in una provetta Falcon da 15 millilitri contenente la soluzione di saccarosio e calcio e mescolarla lentamente capovolgendo la provetta. Mettere la soluzione in una provetta da centrifuga ultra trasparente e aggiungere sopra ogni provetta 2,5 millilitri di saccarosio contenente cloruro di calcio.
E calibrare le provette con una soluzione tampone di isolamento e centrifugare per tre ore a 100.000 G a quattro gradi in un'ultra centrifuga. Rimuovere con cautela la provetta dal supporto in acciaio da centrifuga e identificare l'anello denso all'interno dell'interfaccia saccarosio che contiene i sinaptosomi. Scartare lo strato superiore di mailing con l'aiuto di una punta blu.
Con una pipetta Pasteur, raccogliere l'anello denso contenente le frazioni di sinaptosomi e trasferirlo in una provetta da centrifuga ultra trasparente e conservare con ghiaccio tritato. Diluire i sinaptosomi con nove volumi di tampone di isolamento ghiacciato e centrifugare per 30 minuti a 15.000 G a quattro gradi. Dopo la centrifugazione, rimuovere la provetta.
Scartare il surnatante. Dovrebbe essere visto un pellet contenente i sinaptosomi. Risospendere il pellet con 1,1 millilitri di tampone isolante e tenerlo su ghiaccio tritato per il passaggio successivo.
Preparare soluzioni fresche con il pH corrispondente regolato a quattro gradi. Aggiungere lentamente un millilitro di pellet sinaptosomiale risospeso in cinque millilitri di cloruro di calcio in un becher su ghiaccio sotto agitazione continua. Successivamente a cinque millilitri di tampone di solubilizzazione concentrato pH 6.
Dopo 50 minuti in ghiaccio, trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga ultra trasparente e centrifugare a 40.000 G per 30 minuti a quattro gradi. Dopo la centrifugazione, rimuovere la provetta. Deve essere osservato un pellet contenente la frazione pre e post-sinaptica.
Il surnatante contenente la frazione sinaptica extra viene raccolto in una provetta di concentrazione da 15 millilitri. Lavare accuratamente il pellet con il tampone di solubilizzazione da due millilitri pH sei. Evitare di rompere il pellet e scartare il tampone.
A 10 millilitri di tampone solubilizzante pH otto al pellet e titolare con l'aiuto di una pipetta Pasteur. Incubare un becher con ghiaccio in continua agitazione per 50 minuti. Trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga ultra trasparente e centrifugare a 40.000 G per 30 minuti a quattro gradi.
Dopo la centrifugazione, rimuovere la provetta. Deve essere osservato un pellet contenente la frazione post-sinaptica. Il surnatante contenente la frazione presinaptica viene raccolto in una provetta di concentrazione da 15 millilitri.
Il pellet contenente la frazione post-sinaptica viene risospeso con 200 microlitri di soluzione STS. Sonicare il pellet risospeso. Valutare la quantità di proteine in ciascuna frazione mediante un saggio di determinazione delle proteine.
Prelevare 20 microgrammi di proteine da ciascuna frazione e trattare con il tampone per campioni di elettroforesi su gel di poliacrilammide STS. Separare le proteine mediante elettroforesi su gel di poliacrilammide STS e analizzarle mediante immunoblot. GPR37 è un altro recettore globale di proteine fantasiose principalmente nel cervello dei roditori.
Implicato in diverse patologie come il morbo di Parkinson o la depressione maggiore, la sua funzione rimane anormale. Studiare la presenza di questo recettore nelle sinapsi può aiutare a decifrare il suo ruolo nel sistema nervoso centrale. I sinaptosomi di topi wild type e GPR37 knockout sono stati isolati e successivamente frazionati.
La purezza di ciascun compartimento subsinaptico era garantita dalla segregazione dei rispettivi marcatori sinaptici. Il marcatore vescicolare extra sinaptico sinaptofisina è stato arricchito in questa frazione extra sinaptica. La proteina BSD 95, un classico marcatore di densità post-sinaptica, è stata arricchita nella corrispondente frazione postsinaptica.
Infine, la purezza della frazione presinaptica è stata convalidata dalla presenza di SNAP 25, un marcatore presinaptico della zona attiva. È interessante notare che, mentre l'immunoreattività del GPR 37 era più abbondante nella frazione extra sinaptica, ha anche mostrato una preferenza significativa per la frazione postsinaptica rispetto alla frazione presinaptica. La valutazione della composizione proteica subsinaptica è una sfida importante nelle neuroscienze.
Tuttavia, questo non è un compito facile poiché è altamente regolato dai nastri di interazione proteica e proteica. Qui presentiamo un protocollo di frazionamento della membrana cerebrale che rappresenta una procedura robusta per selezionare proteine appartenenti a diversi compartimenti sinaptici. In altre parole, viene descritta la tua tecnologia chimica per eseguire l'arricchimento proteico da compartimenti presinaptici, postsinaptici ed extra sinaptici.
Arrivederci e buona fortuna con i tuoi esperimenti di frazionamento.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo di frazionamento delle membrane cerebrali progettato per isolare le proteine da diversi compartimenti sinaptici nel cervello del topo. Comprendere la distribuzione di queste proteine è fondamentale per studiare la funzione sinaptica sia in condizioni di salute che di malattia.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Neuroscienza
- Biologia cellulare
- Funzione sinaptica
Sfondo
- Le sinapsi in vivo sono dinamiche e possono subire significativi cambiamenti strutturali.
- Lo studio delle sinapsi viene tradizionalmente effettuato utilizzando la microscopia elettronica.
- Comprendere i componenti cinetici della trasmissione è vitale per la funzione sinaptica.
- Questo protocollo mira a migliorare l'isolamento delle proteine sinaptiche.
Scopo dello studio
- Isolare proteine da diversi compartimenti sinaptici.
- Fornire un metodo robusto per studiare le dinamiche sinaptiche.
- Facilitare la comprensione della funzione sinaptica in varie condizioni.
Metodi utilizzati
- Il cervello del topo viene rimosso e l'ippocampo viene dissezionato.
- Utilizza l'obliterazione laser e detergenti delicati.
- Impieghi diverse condizioni di pH per la frazionamento.
- Comporta una centrifugazione istantanea per l'isolamento delle proteine.
Risultati principali
- Isolamento di successo delle proteine dai compartimenti sinaptici.
- Migliore comprensione della distribuzione delle proteine sinaptiche.
- Dimostrato l'efficacia del metodo di frazionamento delle membrane.
- Fornito intuizioni sulle dinamiche della trasmissione sinaptica.
Conclusioni
- Il protocollo offre un approccio affidabile per l'isolamento delle proteine sinaptiche.
- Contribuisce alla comprensione della funzione sinaptica.
- Questo metodo può essere applicato sia in studi normali che patologici.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Assessing synaptic protein localization is critical for target validation in neuroscience drug discovery, where mislocalization can confound mechanistic interpretation. This fractionation approach enables subcellular resolution of target engagement, supporting predictive confidence in lead identification. By isolating pre-, post-, and extrasynaptic compartments, the method aids in de-risking targets with synaptic mechanisms of action.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by resolving subcellular protein distribution in synaptic compartments.
- Operational Value: Provides biochemical isolation of synaptic proteins to clarify target localization and mechanism of action.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by distinguishing synaptic from non-synaptic target engagement, reducing false positives in target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares enriched subcellular fractions for downstream assays requiring compartment-specific protein detection.
- Operational Value: Standardizes synaptic membrane preparation via sucrose gradient and differential solubilization, enhancing reproducibility across experiments.
- Assay Readiness: Generates validated fractions using immunoblot markers (SNAP-25, PSD-95, synaptophysin) to qualify systems for screening campaigns.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Links discovery-phase subcellular localization to preclinical validation by maintaining synaptic protein integrity.
- Disease-Relevant System: Applicable to pathological models (e.g., GPR37 in Parkinson’s) to assess altered synaptic distribution in disease states.
- Mechanistic De-risking: Clarifies whether target modulation affects specific synaptic compartments, informing safety and efficacy predictions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to preclinical workflows, enabling subcellular resolution of target proteins before functional screening and lead optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating synaptic compartments to assess target localization and interaction partners.
- Screening: Enables assay development using fractionated membranes for quantitative, compartment-specific readouts.
- Analytics: Generates immunoblot-based quantitative outputs to compare protein enrichment across conditions and genotypes.
- Translational Research: Connects subcellular targeting to phenotypic outcomes in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for synaptic target validation across multiple projects and therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by resolving synaptic protein localization and reducing mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible subcellular fractionation suitable for multi-lab implementation.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by confirming subcellular target engagement, reducing late-stage attrition due to off-target synaptic effects.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated synaptic compartmentalization.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neurobiology, biochemical fractionation, and immunoblot analysis.
- Depends on ultracentrifugation equipment, sucrose gradients, and mild detergents for subcellular separation.
- Necessitates standardized protocols for tissue dissection, homogenization, and fractionation to ensure consistency.
- Must account for variability in synaptic yield across brain regions and disease models.
- Limited to ex vivo applications; not suitable for live-cell or in situ dynamic imaging of protein trafficking.
