Name: Flash-e-Freeze: una tecnica innovativa per lacquisizione di membrana Dynamics con microscopia elettronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-01T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 1 s
Description: Scopri la tecnica flash-and-freeze per visualizzare la dinamica delle membrane neuronali con microscopia elettronica a risoluzione millisecondi. Questo metodo combina optogenetica e congelamento ad alta pressione per catturare eventi sinaptici rapidi.

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Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Johns Hopkins University (SO). Ringraziamo la Johns Hopkins School of Medicine Microscopio Fondo per il loro supporto tecnico. Ringraziamo Erik Jorgensen e Christian Rosenmund e dei membri delle loro laboratori per lo sviluppo della tecnica. Ringraziamo M. Wayne Davis per la progettazione del dispositivo iniziale. Ringraziamo Paul Wurzinger, Cveta Tomova e Delgermaa Luvsanjav per la loro assistenza tecnica. Ringraziamo anche Natalie R. Hamilton e Grant F. Kusick per la loro lettura critica del manoscritto.

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Pubblicazione Open Access di questo articolo è stato sponsorizzato da Leica Mikrosysteme GmbH.

L&#39;approccio &quot;flash-e-freeze&quot; visualizza dinamica delle membrane inducendo un particolare evento cellulari con optogenetics e congelando cellule in momenti definiti dopo stimolazione 19. In questa dimostrazione, abbiamo utilizzato channelrhodopsin, un canale cationico fotosensibile, per stimolare i neuroni e catturato la fusione e il recupero delle vescicole sinaptiche ai terminali sinaptici. Negli ultimi anni, molti strumenti optogenetic sono stati sviluppati 22, 23, che sono tutti compatibili con flash e rigelo. Ad esempio, il traffico organello può essere indotta utilizzando heterodimerization indotta dalla luce di cryptochrome e CIB1 24. Analogamente, la composizione lipidica della membrana plasmatica può essere alterata dalla traslocazione indotta dalla luce di fosfatasi fosfoinositide alla membrana plasmatica 25. Inoltre, piccole, composti sensibili alla luce come azobenzene chconformazione ange seconda delle lunghezze d&#39;onda di illuminazione. Questo cambiamento conformazionale può essere utilizzato per attivare canali ligando-dipendenti o per modificare la composizione dei lipidi nella membrana 26, 27. composti in gabbia può essere utilizzato anche per indurre l&#39;attività cellulare. Tuttavia, il LED utilizzato nella configurazione attuale non può produrre energia sufficiente per uncaging; quindi, ulteriori ottimizzazioni del sistema sono probabilmente necessarie. Tuttavia, le applicazioni di questi strumenti luce attivabili sono eventi cellulari flessibili-molti possono essere indotti da un lampo di luce. &quot;Flash-e-freeze&quot; in grado di catturare le dinamiche della membrana che ne derivano. Ci sono due principali limitazioni al metodo &quot;flash-e-freeze&quot;. In primo luogo, si coglie &quot;istantanee&quot; di un evento particolare da cellule diverse. In altre parole, non è possibile seguire la dinamica della membrana in una cella per un periodo di tempo. Così, per la ricostruzione di qualsiasi cellulare, anchet, si deve acquisire ed analizzare un gran numero di immagini da ciascun campione e ciascun punto temporale. Inoltre, nei neuroni, un numero ancora maggiore di immagini è necessario poiché la fusione delle vescicole sinaptiche richiede solo indirizzi 20 - 30% delle sinapsi in neuroni ippocampali di topo 18, 28. L&#39;analisi di un insieme di dati di grandi dimensioni quali richiede enormi quantità di tempo. In futuro, l&#39;acquisizione e l&#39;analisi delle immagini devono essere automatizzati per rendere l&#39;approccio più efficiente 29, 30. La seconda limitazione è imposta dalla natura della tecnica di congelamento ad alta pressione. Quando le cellule congelare, acqua cellulare riorganizza per formare cristalli di ghiaccio se il tasso di congelamento è inferiore a 100 K / s 21. Questi cristalli di ghiaccio possono penetrare le membrane o concentrato soluti per alterare la pressione osmotica locale, con conseguente rottura delle membrane. Per evitare di cristalli di ghiaccio, HIGpressione h (~ 2.000 atm) è applicato ai modelli. Per effetto super-raffreddamento, è sufficiente per impedire all&#39;acqua di formazione di cristalli di ghiaccio a questa pressione 21 una velocità di congelamento di 100 K / s. In teoria, provini spessi come 500 micron possono essere congelati senza cristalli di ghiaccio, ma approssimativamente 200 um è probabilmente il limite pratico, come forme cubica di ghiaccio tendono a formare nel tessuto spesso, compromettendo morfologia. Nell&#39;elaborazione di campioni maggiore di 5 um, l&#39;uso di un adeguato crio-protettivo, come BSA, è necessario. Tuttavia, BSA cambierà l&#39;osmolarità della soluzione e può influenzare la risposta fisiologica di cellule. Pertanto, molti esperimenti di controllo sono tenuti a convalidare l&#39;uso di BSA in sistemi particolari. cristalli di ghiaccio possono anche formare dopo alta pressione congelamento se i campioni vengono rimossi accidentalmente dal bagno di azoto liquido. Pertanto, è fondamentale per mantenere i campioni in azoto liquido in ogni momento e di utilizzare forcipe pre-raffreddati amanipolarli. Quando si pianifica esperimenti, i seguenti tre punti devono essere considerati. In primo luogo, l&#39;intensità massima della luce (la linea 460 nm) è di 5,5 - 8,0 mW / mm 2. Se questa intensità è sufficiente per indurre l&#39;attività deve essere verificata con il live-cell imaging su un microscopio a fluorescenza prima di esperimenti Flash e rigelo. In secondo luogo, gli esperimenti devono essere eseguiti a temperatura fisiologica. La fase del congelatore ad alta pressione viene riscaldato fino a 37 ° C per gli esperimenti con neuroni ippocampali di topo 31. Infine, i punti di tempo devono essere scelti con attenzione per cogliere le dinamiche della membrana. Gli studi iniziali hanno indicato che l&#39;endocitosi è completa dopo 100 ms di stimolazione. Così, tre punti di tempo addizionali (15, 30, e 50 ms) sono stati anche esaminati per seguire la dinamica della membrana 17, 18. Questi punti di tempo sono state necessarie per visualizzare evento traffico di membranas durante la trasmissione sinaptica. Tuttavia, il requisito per il numero di punti temporali sono diverse in ciascun evento cellulare. Pertanto, alcuni punti di tempo dovrebbero essere campionati prima di iniziare la grande collezione di dati.

Visualizzazione dinamica della membrana e proteine ​​all&#39;interno di una cellula è un passo fondamentale verso la comprensione della biologia cellulare di particolari processi. eventi di traffico dinamico possono essere catturati usando la luce o di microscopia a fluorescenza. Tuttavia, il contesto subcellulare è in gran parte assente in queste immagini perché le strutture sub-cellulari non possono essere completamente &quot;dipinte&quot; di coloranti o sonde fluorescenti e risolte spazialmente e spettralmente 1, 2. D&#39;altra parte, mentre la microscopia elettronica può delineare architettura subcellulare nei minimi dettagli, non può catturare dinamiche cellulari, poiché i campioni devono essere fissate prima di imaging. Così, non è in genere sufficiente per comprendere completamente dinamiche cellulari utilizzando solo una modalità di imaging. Per superare le limitazioni di microscopia ottica ed elettronica, sono state sviluppate tecniche di microscopia correlativa. Correlative Luce e Microscopia Elettronica(CLEM) visualizza dinamica intracellulare mediante microscopia ottica e strutture subcellulari sottostanti con microscopia elettronica. In CLEM, cellule impegnate in vari processi, come citochinesi e endocitosi 3, 4, 5, 6, sono live-immagini formate ed poi trasformati per la microscopia elettronica. Sebbene CLEM coglie alcuni aspetti della dinamica intracellulare, ci sono quattro fattori che limitano l&#39;utilità di questo approccio. In primo luogo, la risoluzione temporale è limitata da quanto velocemente le cellule possono essere immobilizzati, che richiede tipicamente s - min dovuto alla diffusione lenta e reazione di fissativi 7. Dopo la seconda, l&#39;architettura subcellulare si osserva facto 8; pertanto, le variazioni morfologiche dinamici non possono essere acquisite utilizzando questo approccio. Terzo, micrografie fluorescenza e elettroni non possono essere allineati con precisione a causa sh tessutirinkage causato dalla disidratazione durante la preparazione dei campioni per la microscopia elettronica 9, 10. In quarto luogo, eventi come cytokinesis e endocitosi non avvengono nello stesso momento in ogni cellula 5, 11, e, quindi, una cella particolare che è impegnata in caso devono essere identificati da una grande popolazione di cellule. Questo processo è spesso laboriosa. Pertanto, un nuovo metodo è necessario per indurre particolari eventi in ogni cellula e per catturare le dinamiche cellulari risultanti dal rapido immobilizzazione di cellule in momenti definiti. Recentemente, diversi strumenti sono stati sviluppati per indurre particolari dinamiche cellulari che utilizzano la luce (optogenetics). Channelrhodopsin è un canale cationico fotosensibile, non selettivo isolato da Chlamydomonas reinhardtii 12, 13. Quando channelrhodopsin è espresso in neuronal membrane, un breve lampo di luce induce un afflusso di ioni di sodio in neuroni e innesca un potenziale 14, 15 azione. Il potenziale d&#39;azione propaga poi nei terminali sinaptici, dove vescicole sinaptiche fondono in pochi millisecondi 16, 17, 18 Pertanto, channelrhodopsin induce attività neuronale. Per seguire dinamica della membrana a terminali sinaptici, i neuroni devono essere immobilizzati in momenti definiti dopo stimolazione con precisione ms. Per catturare dinamica della membrana dopo l&#39;induzione dell&#39;attività neuronale, abbiamo accoppiati stimolazione luminosa con alta pressione congelamento 17, 18, 19. -Alta pressione congelamento consente di immobilizzazione quasi istantanea di cellule con formazione di cristalli di ghiaccio ridotta 20. Cristalli di ghiaccio can rottura membrane e perturbare l&#39;architettura subcellulare 21. Variando gli intervalli di tempo tra la stimolazione e il congelamento, traffico di membrana all&#39;interno terminali sinaptici stato catturato dopo l&#39;induzione di un potenziale d&#39;azione. Qui, dimostriamo procedure sperimentali utilizzando un congelatore ad alta pressione che le coppie commercializzato un ms controllo temporale della stimolazione luminosa con alta pressione di congelamento. A differenza di altri strumenti che richiedono un dispositivo esterno per controllare stimolazione luminosa e il congelamento, stimolazione luminosa è completamente integrato in questo sistema e può essere applicato con precisione ms 19. Questo processo prevede più passaggi. 1) neuroni ippocampali di topo sono coltivate su dischi zaffiro e infettate con lentivirus trasporta un vettore di espressione per channelrhodopsin 18. 2) I neuroni sono stimolati e congelati in momenti definiti dopo la stimolazione. 3) L&#39;acqua è sostituto vetrificatod con un solvente organico, mentre lipidi e proteine ​​sono reticolati con fissativi di conservare l&#39;architettura intracellulare. 4) I campioni sono infiltrate ed inclusi in resina epossidica. 5) Le sezioni ultrasottili sono raccolti utilizzando un ultramicrotomo. 6) Le sezioni sottili vengono esposte su un microscopio elettronico a trasmissione. 7) acquisizione di immagini e l&#39;analisi sono effettuate alla cieca rispetto ai punti temporali o genotipi. Dinamiche cellulari possono essere determinati attraverso la ricostruzione di immagini risolte nel tempo 17, 18. Preparazione del campione (punti 2 - 5 di cui sopra) richiede una settimana, ma la successiva analisi delle immagini richiede mesi a un anno.

<table><tbody><tr><td>Sistema di Freeze-Substitution e Inclusione a Bassa Temperatura per Microscopia Ottica ed Elettronica -AFS II</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Congelatore ad alta pressione - EM-ICE</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td>EM ICE è un congelatore ad alta pressione specializzato che consente un controllo preciso della stimolazione luminosa e del congelamento.</td></tr><tr><td>Osmometro</td><td>Gonotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultramicrotome UC7</td><td>Leica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forno</td><td>Blu M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lama di rasoio</td><td>Personna</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glutaraldeide</td><td>EMS</td><td>16530</td><td></td></tr><tr><td>Tetrossido di osmio</td><td>EMS</td><td>RT19132</td><td>Tossico, aperto solo sotto cappa chimica certificata</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>EMS</td><td>RT10016</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Emdmillipore</td><td>391340-250GM</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma</td><td>49159-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>746436-1KG</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>21115-250ML</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>J.T.Baker</td><td>2444-01</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica liquida Eponate 12</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Resina epossidica bisfenolo A Araldite 502</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Anidride dodecenilsuccinica (DDSA)</td><td>Ted Pella</td><td>18028</td><td></td></tr><tr><td>Benzil dimetil ammina (BDMA)</td><td>Ted Pella</td><td>18241</td><td></td></tr><tr><td>Capsula speciale per inclusione (BEEM)</td><td>EMS</td><td>70021</td><td></td></tr><tr><td>Griglia di rame</td><td>Ted Pella</td><td>1GC12H</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di polivinile ( Pioloform F)</td><td>Ted Pella</td><td>19244</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Polysciences</td><td>21447-25</td><td></td></tr><tr><td>Etilcianoacrilato (Super colla)</td><td>Scotch</td><td>170497</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA</td><td>Themo scientific</td><td>25300-120</td><td></td></tr><tr><td>DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)</td><td>Thermo scientific</td><td>10569-044</td><td>Dovrebbe essere riscaldato a 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td><td>Thermo scientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Thermo scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-deossiuridina (FUDR)</td><td>Sigma</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetto</td><td>Fisher</td><td>S175223</td><td>Deve essere lavato con acido</td></tr><tr><td>Disco di zaffiro</td><td>Technotrade</td><td>616-100</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acido</td><td>Emdmillipore</td><td>1000631011</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lisina (PDL)</td> <td>Sigma</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Collagene a coda di ratto</td><td>Thermo scientific</td><td>A10483-01</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal A</td><td>Fisher</td><td>10888022</td><td>Dovrebbe essere riscaldato a 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutammina (Glutamax)</td><td>Fisher</td><td>35050-079</td><td></td></tr><tr><td>Integratore senza siero&nbsp; (B-27)&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>17504044</td><td></td></tr><tr><td>Hanks'-balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>Thermo scientific</td><td>24020117</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>LS003126</td><td>Active Unit deve essere calcolato per ogni lotto</td></tr><tr><td>Thermomixer</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>Thermomixer C</td><td></td></tr><tr><td>Inibitore della tripsina</td><td>Sigma</td><td>T9253</td><td></td></tr><tr><td>NBQX</td><td>Tocris</td><td>03-731-0</td><td></td></tr><tr><td>Bicculina</td><td>Tocris</td><td>01-091-0</td><td></td></tr><tr><td>Whatman I carta da filtro</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a trasmissione</td><td>Philips CM20</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

flash-e-freeze: una tecnica innovativa per l&#39;acquisizione di membrana dynamics con microscopia elettronica

Flash-and-Freeze: A Novel Technique to Capture Membrane Dynamics with Electron Microscopy

Cellule cambiano continuamente la loro architettura membrana e distribuzione della proteina, ma è estremamente difficile da visualizzare questi eventi ad una risoluzione temporale e spaziale dell&#39;ordine di ms e nm, rispettivamente. Abbiamo sviluppato una tecnica risolta nel tempo microscopia elettronica, &quot;flash-e-freeze&quot;, che induce eventi cellulari con optogenetics e visualizza le dinamiche della membrana derivanti dal congelamento delle cellule in momenti definiti dopo la stimolazione. Per illustrare questa tecnica, abbiamo espresso channelrhodopsin, un canale cationico fotosensibile, in neuroni ippocampali di topo. Un lampo di luce stimola l&#39;attività neuronale e induce rilascio di neurotrasmettitore dai terminali sinaptici mediante la fusione di vescicole sinaptiche. La stimolazione optogenetic dei neuroni è accoppiato con alta pressione di congelamento per seguire le variazioni morfologiche durante la trasmissione sinaptica. Utilizzando uno strumento commerciale, abbiamo catturato la fusione delle vescicole sinaptiche e il recupero del synaPTIC membrana delle vescicole. Per visualizzare la sequenza di eventi, grandi set di dati sono stati generati ed analizzati alla cieca, in quanto i cambiamenti morfologici sono stati rilevati in diverse cellule nel tempo. Tuttavia, flash-e-freeze consente la visualizzazione delle dinamiche di membrana nel microscopio elettronico con risoluzione temporale ms.

Utilizzando il protocollo sopra descritto, abbiamo eseguito &quot;flash e rigelo&quot; esperimenti di topo neuroni dell&#39;ippocampo esprime channelrhodopsin. Questi neuroni sono stati congelati sia 15 ms o 100 ms dopo l&#39;insorgenza di luce. Abbiamo precedentemente dimostrato che l&#39;esocitosi e endocitosi delle vescicole sinaptiche avvengono nei terminali sinaptici ai 15 ms e 100 ms punti temporali, rispettivamente 18. Questi eventi sono stati catturati con successo al momento opportuno (Figura 2), suggerendo che gli esperimenti di appassimento e rigelo possono essere eseguite con successo nel congelatore ad alta pressione specializzata prescelto (vedere la tabella dei materiali). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig1.jpg" /> Figura 1. Esempio di caricamento e programmazione in alta pressione congelatore. A) Esempio di tabella di carico di un alto pcongelatore ressure. La piastra intermedia, mostrato nel riquadro di dettaglio strutturale, viene collocato in un supporto per il campione CLEM carico. Uno dei semicilindri è posto nella parte inferiore della tabella caricamento del campione, e l&#39;altro è collegato con una clip al coperchio superiore. Una volta caricato il campione, la piastra centrale è spinta in avanti al semicilindro inferiore ed il coperchio è chiuso per iniziare il congelamento. B) assemblaggio campione. Il disco di zaffiro contenente neuroni è collocato nel pozzetto della piastra centrale, con la cellula rivolta verso l&#39;alto. Un anello 100 um è posizionato direttamente sopra il disco di zaffiro all&#39;interno del pozzo. Quindi, un disco zaffiro vuoto immersa in soluzione salina fisiologica viene posizionato con la soluzione rivolto verso il basso. Le bolle d&#39;aria devono essere evitati. Infine, un anello 100 um e un anello 400 um sono comodamente posizionati sopra. Qualsiasi liquido supplementare viene rimosso con carta da filtro. C) Una sezione trasversale di una capsula incorporamento con il disco di zaffiro sommerso in resina epossidica. il Sappassumere disco è collocato nella parte inferiore della capsula, con la cella rivolta verso l&#39;alto e coperto con resina epossidica per l&#39;infiltrazione e l&#39;incorporamento. D) Programmazione del congelatore ad alta pressione per una singola, 10 ms stimolo. I campioni sono congelati 90 ms dopo l&#39;impulso luminoso. E) Programmazione del congelatore ad alta pressione per 10 stimoli a 20 Hz. I campioni sono congelati 5 ms dopo l&#39;ultimo impulso di luce. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig1large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/55664/55664fig2.jpg" /> Figura 2. Visualizzazione Esocitosi e endocitosi in topo neuroni dell&#39;ippocampo. neuroni dell&#39;ippocampo sono stimolati una volta congelati negli orari indicati. Microscopio elettronico mostrano l&#39;esocitosi di un vescicole sinaptiche A) e endocitosi ultraveloce <strong&gt; B). PSD, densità post-sinaptica. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55664/55664fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Abbiamo sviluppato una nuova tecnica di microscopia elettronica, &quot;flash-e-congelamento&quot; che permette la visualizzazione di dinamica della membrana con ms risoluzione temporale. Questa tecnica combina la stimolazione optogenetic di neuroni con alta pressione di congelamento. Qui, dimostriamo le procedure e descrivere i protocolli in dettaglio.

Flash-e-Freeze: una tecnica innovativa per l&#39;acquisizione di membrana Dynamics con microscopia elettronica

Cells constantly change their membrane architecture and protein distribution, but it is extremely difficult to visualize these events at a temporal and ...

L'obiettivo generale di questa procedura è catturare la dinamica delle membrane mediante microscopia elettronica dopo l'induzione dell'attività neuronale utilizzando l'optogenetica, seguita dal congelamento delle cellule in punti temporali definiti dopo la stimolazione. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze e nella biologia cellulare riguardo ai meccanismi del riciclo delle vescicole sinaptiche e potrebbe forse essere modellato su una scala temporale estremamente rapida. Il principale vantaggio di questa tecnica consiste nella possibilità di visualizzare i cambiamenti morfologici all'interno di una cellula mediante microscopia elettronica su una scala temporale dell'ordine del millisecondo.La procedura sarà dimostrata da Shuo Li, uno studente laureato, e da Sumana Raychaudhuri, un associato di ricerca. Entrambi del mio laboratorio. Prima di preparare il fissativo, etichettare due provette criogeniche da millilitro con una matita in base ai numeri dei campioni.Quindi combinare tutti i reagenti fissanti e suddividere un millilitro di volume del fissativo in ciascun vial. Dopo aver chiuso i tubi, immergere immediatamente i fissativi nell'azoto liquido e conservare i vial in una scatola chiusa di polistirolo. Successivamente, riempire un'unità automatizzata per la sostituzione criogenica e un congelatore ad alta pressione con azoto liquido.Quindi posizionare un piccolo contenitore di acetone nella camera del campione dell'unità di sostituzione e attendere finché la temperatura dell'unità di sostituzione non raggiunge meno 90 gradi Celsius. Per programmare il protocollo di stimolazione luminosa, fare clic su modifica nella finestra di stimolazione luminosa del monitor touchscreen. Si aprirà un'altra finestra.Impostare 15 secondi per la fase scura, 100 millisecondi per il periodo, 10 millisecondi per l'impulso e uno per il numero di periodi per un singolo stimolo di 10 millisecondi.Nella schermata principale, confermare che la casella di stimolazione luminosa sia selezionata, quindi fare clic su archiviazione del campione seguito da modifica. Nella nuova finestra, utilizzare il pulsante più o meno per selezionare due campioni da conservare in ogni canale e confermare che l'opzione azoto liquido abilitato per l'archiviazione sia selezionata. Ora, sotto un microscopio stereoscopico, posizionare un disco di zaffiro con il lato delle cellule rivolto verso l'alto nel pozzetto di una piastra nera centrale.Seguito da un anello distanziale di 100 micron. Immergere un lato di un disco di zaffiro vuoto in una soluzione salina preriscaldata e posizionare il disco sopra l'anello distanziale, con il lato contenente la soluzione salina rivolto verso il basso. Posizionare un altro anello distanziale di 100 micron.E un anello spaziatore di 400 micron sopra l'ultimo disco di zaffiro, e utilizzare carta da filtro per rimuovere qualsiasi liquido in eccesso. Mentre si tengono i campioni, assicurarsi di non intrappolare bolle d'aria tra i dischi di zaffiro. Quindi posizionare l'intero montaggio tra i due semicilindri trasparenti e chiudere il coperchio rosso superiore per avviare il processo di congelamento.Il coperchio rosso si solleverà automaticamente una volta completato il processo di congelamento. Quando tutti i campioni saranno congelati, aprire la porta del dewar di conservazione e trasferire il dewar sul piano di lavoro. Trasferire la camera del campione dal dewar di conservazione a un'apposita piastra campioni riempita con azoto liquido.Sbloccare la manopola per rilasciare il contenitore del campione. Quindi utilizzare una pinza con punte raffreddate con azoto liquido per rimuovere i semicilindri trasparenti dal contenitore del campione. Trasferire con attenzione le piastre nere centrali in un piccolo contenitore contenente azoto liquido.È fondamentale mantenere i campioni congelati sotto azoto liquido in ogni momento e manipolarli sempre con pinzette precamerate. Raffreddare nuovamente le pinzette e trasferire rapidamente la prima piastra centrale nell'acetone precamerato. Agitare e battere delicatamente la piastra per favorire la separazione del disco di zaffiro dalla piastra.Quindi, inserire un contenitore criogenico aperto contenente fissativo nella camera del campione nell'unità di sostituzione. Trasferire il disco di zaffiro nel vial. E chiudere immediatamente il vial.Una volta trasferiti tutti i campioni, impostare i parametri appropriati del programma di sostituzione libera e avviare il programma. Al termine del programma di sostituzione libera, utilizzare i guanti per trasferire le provette criogeniche dalla camera del campione a una cappa chimica ed usare una pipetta per aggiungere acetone a temperatura ambiente in ciascuna provetta. Sostituire il lavaggio in ogni provetta con acetone fresco da quattro a sei volte nell'arco di uno a due ore.Quindi aggiungere 30%epoxy resin appena preparata in ogni provetta per un'incubazione di due-tre ore a temperatura ambiente in uno shaker orbitale a 120 rpm. Al termine dell'incubazione, sostituire la 30%epoxy resin con 70%epoxy resin per un'incubazione di tre-quattro ore nello shaker orbitale. Successivamente, utilizzare pinze per trasferire ciascun disco, con il lato delle cellule rivolto verso l'alto, sul tappo di una capsula di inclusione e aggiungere 90%epoxy resin sui dischi per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.Il mattino seguente, trasferire ciascun disco di zaffiro nel cappuccio di una nuova capsula di inclusione e riempire il cappuccio con resina epossidica fresca al 100%. Dopo l'ultima incubazione con resina epossidica al 100%, polimerizzare i campioni in un forno a 60 gradi Celsius per 48 ore. Una volta che i campioni sono polimerizzati, posizionare il primo campione capovolto sul microscopio stereoscopico in modo che il disco di zaffiro si trovi nella parte superiore del blocco di resina e utilizzare una lametta per rimuovere uno strato sottile di resina dalla superficie superiore del campione.Successivamente, utilizzare la lametta per praticare un piccolo taglio lungo il bordo del disco, separando così il disco di zaffiro dalla resina epossidica. Immergere quindi il disco in azoto liquido per circa 10 secondi per staccare il disco dal resto della resina. Trasferire la resina sotto un microscopio stereoscopico e fissare il campione al piano del microscopio con del nastro adesivo.Utilizzando un ingrandimento da 4 a 10X, individuare un'area con cellule e usare una lametta a doppio taglio per tagliare una zona di due per due millimetri intorno alla regione di interesse. Successivamente, utilizzare una colla istantanea per montare le cellule su un blocco cilindrico fittizio realizzato in resina epossidica e incubare il blocco a 60 gradi Celsius per un'ora. Dopo la sezione su un ultramicrotomo, trasferire i campioni a un microscopio elettronico a trasmissione per l'acquisizione di immagini a un ingrandimento di 930.000X.In questa immagine viene mostrata la fusione delle vescicole sinaptiche mediante esocitosi, registrata 15 millisecondi dopo l'insorgenza della luce nella zona attiva di una membrana presinaptica di un neurone ippocampale di topo. 100 millisecondi dopo l'insorgenza della luce è possibile osservare una fossetta endocitotica adiacente alla zona attiva, che illustra l'endocitosi ultrarapida operata dalla cellula nervosa. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione del modo in cui processare i campioni mediante esperimenti flash e freeze.Ricordare che lavorare con glutaraldeide, tetrossido di osmio e azoto liquido può essere estremamente pericoloso, quindi assicurarsi di indossare abbigliamento protettivo. Una volta acquisita padronanza, la fase di congelamento di questa procedura può essere completata in un paio d'ore per 12 campioni, ma il resto della procedura, inclusa l'acquisizione delle immagini e l'analisi delle immagini, può richiedere giorni, settimane o anche mesi, pertanto potrebbe trattarsi di una procedura molto lunga. Se si localizzano proteine o se ne visualizza la dinamica, è inoltre possibile utilizzare protocolli diversi per preservare l'antigenicità o la perlacenza delle proteine perlacenti e visualizzarne la dinamica mediante queste tecniche.

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