Flash-e-Freeze: una tecnica innovativa per l'acquisizione di membrana Dynamics con microscopia elettronica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di catturare la dinamica della membrana mediante microscopia elettronica dopo l'induzione dell'attività neuronale utilizzando l'optogenetica, quindi congelare le cellule in punti temporali definiti dopo la stimolazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze e nella biologia cellulare sui meccanismi di riciclaggio delle vescicole sinaptiche e forse anche sulla modellazione su una scala temporale molto rapida. Il vantaggio principale di questa tecnica è la possibilità di visualizzare i cambiamenti morfologici all'interno di una cellula utilizzando la microscopia elettronica su una scala temporale di millisecondi.

La procedura sarà dimostrata da Shuo Li, uno studente laureato e Sumana Raychaudhuri, un ricercatore associato. Entrambi dal mio laboratorio. Prima di preparare il fissativo, etichettare con una matita le lime criogeniche da due millilitri in base al numero di esemplari.

Quindi unire tutti i reagenti fissativi e aliquotare un millilitro di volumi di fissativo in ogni fiala. Dopo aver tappato le provette, immergere immediatamente i fissativi nell'azoto liquido e conservare le fiale in una scatola di polistirolo chiusa. Successivamente, riempire un'unità di sostituzione libera automatizzata e un congelatore ad alta pressione con azoto liquido.

Quindi posizionare un piccolo contenitore di acetone nella camera del campione dell'unità di sostituzione libera e attendere che la temperatura dell'unità di sostituzione raggiunga meno 90 gradi Celsius. Per programmare il protocollo di stimolazione della luce, fare clic su modifica nella finestra di stimolazione della luce del monitor touchscreen. Si aprirà un'altra finestra.

Immettere 15 secondi per la fase scura, 100 millisecondi per il periodo, 10 millisecondi per l'impulso e uno per il numero di periodi per un singolo stimolo di 10 millisecondi.

Nella schermata principale, confermare che la casella di stimolazione luminosa è selezionata e fare clic su Conservazione del campione seguito da modifica. Nella nuova finestra, utilizzare il pulsante più o meno per selezionare due per conservare due campioni in ciascun canale e confermare che l'opzione di conservazione dell'azoto liquido abilitata è selezionata. Ora sotto uno stereomicroscopio, posiziona una cella del disco di zaffiro con il lato rivolto verso l'alto nel pozzetto di una piastra nera centrale.

Seguito da un anello distanziatore da 100 micron. Immergere un lato di un disco di zaffiro vuoto in una soluzione salina preriscaldata e posizionare il disco sopra l'anello distanziatore, con il lato salino rivolto verso il basso. Posizionare un altro anello distanziatore da 100 micron.

E un anello distanziatore da 400 micron sulla parte superiore dell'ultimo disco di zaffiro e utilizzare carta da filtro per rimuovere il liquido in eccesso. Mentre tieni i campioni, assicurati di non intrappolare bolle d'aria tra i dischi di zaffiro. Quindi posizionare l'intero gruppo tra i due semicilindri trasparenti e chiudere il coperchio rosso superiore per avviare il processo di congelamento.

Il coperchio rosso si riaprirà automaticamente una volta completato il processo di congelamento. Quando tutti i campioni sono stati congelati, aprire lo sportello del dewar di stoccaggio e trasferire il dewar sul banco. Trasferire la camera del campione dal dewar di stoccaggio a un vassoio per campioni specializzato riempito con azoto liquido.

E sbloccare la manopola per rilasciare la coppa del campione. Quindi utilizzare un paio di pinzette con punte raffreddate ad azoto liquido per rimuovere i semicilindri trasparenti dalla coppa del campione. E trasferisci con cura le piastre nere centrali in una piccola tazza contenente azoto liquido.

Fare attenzione a mantenere sempre i campioni congelati sotto azoto liquido e a maneggiare sempre i campioni con pinzette pre-raffreddate. Pre-raffreddare nuovamente le pinzette e trasferire rapidamente la prima piastra centrale nell'acetone pre-raffreddato. Agitando delicatamente e picchiettando la piastra per separare il disco di zaffiro dalla piastra.

Quindi posizionare un file criogenico aperto di fissativo in una camera per campioni nell'unità di sostituzione. Trasferire il disco di zaffiro nella fiala. E tappare immediatamente la fiala.

Quando tutti i campioni sono stati trasferiti, impostare i parametri appropriati del programma di sostituzione libera e avviare il programma. Al termine del programma di sostituzione gratuita, utilizzare i guanti per trasferire i file criogenici dalla camera del campione a una cappa chimica e utilizzare una pipetta per aggiungere acetone a temperatura ambiente a ciascuna fiala. Sostituire il lavaggio in ogni fiala con acetone fresco da quattro a sei volte in un periodo di una o due ore.

Quindi aggiungere resina epossidica al 30% appena preparata a ciascuna fiala per un'incubazione di due o tre ore a temperatura ambiente in un agitatore orbitale a 120 giri/min. Al termine dell'incubazione, sostituire la resina epossidica al 30% con resina epossidica al 70% per un'incubazione di tre o quattro ore sull'agitatore orbitale. Quindi utilizzare le pinzette per trasferire ogni disco, con la cellula rivolta verso l'alto, sul tappo di una capsula di inclusione e aggiungere il 90% di resina epossidica ai dischi per un'incubazione notturna a quattro gradi Celsius.

La mattina successiva, trasferisci ogni disco di zaffiro sul tappo di una nuova capsula di inclusione e riempi il tappo con resina epossidica al 100% appena preparata. Dopo l'ultima incubazione di resina epossidica al 100%, polimerizzare i campioni in un forno a 60 gradi Celsius per 48 ore. Quando i campioni si sono polimerizzati, posizionare il primo campione capovolto sullo stereomicroscopio in modo che il disco di zaffiro si trovi nella parte superiore del blocco di resina e utilizzare una lama di rasoio per rimuovere un sottile strato di resina dalla parte superiore del campione.

Quindi, usa la lama del rasoio per tagliare una linea poco profonda lungo il bordo del disco per separare il disco di zaffiro dalla resina epossidica. E immergi il disco nell'azoto liquido per circa 10 secondi per separare il disco dal resto della resina. Trasferire la resina al microscopio da dissezione e fissare il campione al tavolino del microscopio.

Utilizzando un ingrandimento da quattro a 10X, trova un'area con celle e usa una lama di rasoio a doppio taglio per tagliare un'area di due per due millimetri attorno alla regione di interesse. Quindi utilizzare la supercolla per montare le celle su un blocco cieco cilindrico in resina epossidica e incubare il blocco a 60 gradi Celsius per un'ora. Dopo il sezionamento su un tomo ultra micro, trasferire i campioni su un microscopio elettronico a trasmissione per l'imaging con un ingrandimento di 930.000X.

In questa immagine, viene mostrata la fusione delle vescicole sinaptiche tramite esocitosi registrata 15 millisecondi dopo l'insorgenza della luce all'interno della zona attiva di una membrana presinaptica in un neurone ippocampale di topo. 100 millisecondi dopo l'insorgenza della luce si può osservare una fossa endocitotica adiacente alla zona attiva, che illustra l'endocitosi ultra veloce da parte della cellula nervosa. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come elaborare i campioni con esperimenti flash e freeze.

Ricorda, lavorare con glutaraldeide, tetrossido di osmio e azoto liquido può essere davvero pericoloso, quindi assicurati di indossare indumenti protettivi. Una volta padroneggiata, la parte di congelamento di queste procedure può essere eseguita in un paio d'ore per 12 campioni, ma il resto delle procedure, tra cui l'imaging e l'analisi delle immagini, può richiedere fino a giorni, settimane o addirittura mesi, e quindi potrebbe essere una procedura davvero lunga. Se si localizzano le proteine, o si visualizzano le loro dinamiche, si possono anche utilizzare diversi protocolli per preservare l'antigenicità, o la perlescenza dalle proteine perlescenti e visualizzare le loro dinamiche utilizzando queste tecniche.