Glycoproteomics della matrice extracellulare: Un metodo per l'analisi Intact Glycopeptide Utilizzando la spettrometria di massa

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di analizzare la composizione proteica della matrice extracellulare, compresa l'identificazione dei siti di glicosilazione e la caratterizzazione composizionale delle forme di glicani nei tessuti cardiovascolari. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel processo di fibrosi tissutale, come ad esempio il modo in cui una glicostlazione strutturale della matrice influisce sulla fibrosi tissutale durante le malattie cardiovascolari. Il vantaggio principale di questa tecnica è che, a differenza dei protocolli precedenti che analizzano i cambiamenti complessivi della glicosilazione, consente la caratterizzazione della glicosilazione in particolari siti di una matrice strutturale di proteine, fornendo uno strumento per studi meccanicistici di follow-up più mirati.

A dimostrare le procedure saranno la dottoressa Marika Fava e la signora Ferheen Baig del nostro laboratorio. Per iniziare questa procedura, preparare tutti i buffer di estrazione come descritto nel protocollo di testo. Quindi, usa un bisturi per tagliare da 20 a 50 milligrammi di tessuto in tre o quattro pezzi più piccoli di circa due millimetri.

Metti il fazzoletto a dadini in un tubo da 1,5 millilitri e aggiungi 500 microlitri di PBS ghiacciato. Lavare il fazzoletto cinque volte utilizzando 500 microlitri di PBS per ogni lavaggio per ridurre al minimo la contaminazione del sangue. Trasferire i campioni lavati in una provetta da 1,5 millilitri con tappo a vite e aggiungere un volume di tampone di cloruro di sodio 10 volte il peso del tessuto.

Vorticare alla velocità minima per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, trasferire l'estratto in nuove provette da centrifuga e centrifugare a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare brevemente i pellet di tessuto risultanti con un tampone di cloruro di sodio fresco.

Successivamente, aggiungere un volume di tampone SDS 10 volte il peso del tessuto e agitare a una velocità minima per 16 ore a temperatura ambiente. Trasferire l'estratto in nuove provette da centrifuga e centrifugare a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Lavare i pellet risultanti con acqua distillata doppia.

Aggiungere un volume di tampone guanidina cloridrato cinque volte il peso del tessuto e agitare alla massima velocità per 72 ore a temperatura ambiente. Trasferire l'estratto risultante in nuove provette e centrifugare a 16.000 volte G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Dopo aver quantificato la proteina, aliquotare 10 microgrammi in una nuova provetta per ogni campione, per la valutazione dell'occupazione del sito di glicosilazione e 50 microgrammi in una provetta separata per l'analisi diretta dei glicopeptidi.

Aggiungere 10 volte il volume di etanolo a ciascuno e incubare per una notte a 20 gradi Celsius. Il giorno successivo, centrifugare i campioni a 16.000 volte G per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Aspirare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet precipitato.

Quindi utilizzare un concentratore sottovuoto per asciugare il pellet per 15 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere 10 microlitri di tampone di deglicosilazione preparato a ciascun campione. Imballare le provette del campione all'interno di una provetta conica da 50 millilitri e incubare con un angolo di 45 gradi per due ore a 25 gradi Celsius.

Successivamente, aumentare la temperatura a 37 gradi Celsius e incubare per 36 ore con una leggera agitazione. Dopo la centrifugazione a 16.000 volte G per un minuto, utilizzare un concentratore sottovuoto a temperatura ambiente per 45 minuti per far evaporare l'acqua. Risospendere i campioni essiccati con 10 microlitri di acqua marcata con O-18 contenente 50 unità per millilitro PNGase F.Incubare per 36 ore a 37 gradi Celsius sotto agitazione costante, quindi eseguire la digestione della tripsina in soluzione per tutti i campioni e procedere con la pulizia con C-18.

Per iniziare, aggiungi 200 microlitri di metanolo a ciascun pozzetto della piastra rotante C-18 per attivare la resina. Centrifugare a 1.000 volte G per un minuto. Quindi aggiungere 200 microlitri di ACN all'80% e TFA allo 0,1% in acqua in ogni pozzetto e centrifugare a 1.000 volte G per un minuto.

Quindi, aggiungere 200 microlitri di una soluzione contenente l'1% di ACN e lo 0,1% di TFA in acqua in ciascun pozzetto e centrifugare per un minuto a 1.000 volte G.Ripetere l'aggiunta di questa soluzione e centrifugare due volte. Successivamente, caricare i campioni nei pozzetti della piastra di centrifugazione e centrifugare a 1500 volte G per un minuto. Ricaricare il flusso e ripetere la centrifugazione.

Quindi aggiungere 200 microlitri di una soluzione contenente l'1% di ACN e lo 0,1% di TFA in acqua in ogni pozzetto e centrifugare a 1500 volte G per un minuto. Ripetere l'aggiunta di questa soluzione e centrifugare due volte. Successivamente, aggiungere 170 microlitri di una soluzione contenente il 50% di ACN e lo 0,1% di TFA in acqua in ciascun pozzetto e centrifugare a 1500 volte G per un minuto.

Ripetere l'aggiunta e la centrifugazione ancora una volta. Utilizzare un concentratore sottovuoto per asciugare l'eluizione combinata a temperatura ambiente per due ore. Conservare i campioni essiccati a 80 gradi Celsius fino al momento dell'uso.

Successivamente, eseguire l'analisi di spettrometria di massa tandem con cromatografia liquida sui campioni destinati alla valutazione dell'occupazione dei glicositi. Per i campioni destinati all'analisi diretta dei glicopeptidi, procedere prima con la marcatura standard TMT zero come indicato nel protocollo di testo. Per iniziare, aggiungere a ogni 10 microlitri di campione marcato con TMT zero 50 microlitri di tampone legante fornito.

Quindi, aliquotare 50 microlitri di sospensione omogenea di resina per la cattura del glico in nuove provette da 1,5 millilitri e centrifugare per un minuto a 2500 volte G.Rimuovere il surnatante e aggiungere 60 microlitri del campione e della soluzione tampone legante alle provette contenenti i pellet di resina utilizzando una pipetta per miscelare. Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti agitando a 1200 giri/min. Dopo aver centrifugato per due minuti a 2.000 volte G, trasferire il surnatante in nuove provette.

Successivamente, aggiungere 150 microlitri di tampone di lavaggio a ciascuna provetta di resina utilizzando la pipetta per mescolare per iniziare il processo di lavaggio. Incubare a temperatura ambiente per 10 minuti agitando a 1200 giri/min. Dopo la centrifugazione a 2500 volte G per due minuti, trasferire ciascun surnatante nella provetta di conservazione del surnatante corrispondente per completare il lavaggio.

Ripetere questo processo di lavaggio altre due volte. Successivamente, aggiungere 75 microlitri di tampone di eluizione e mescolare con una pipetta. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti agitando a 1200 giri/min.

Centrifugare a 2500 volte G per due minuti e trasferire ciascun surnatante in una nuova provetta da 1,5 millilitri. Aggiungere 75 microlitri di tampone di eluizione utilizzando una pipetta per miscelare e quindi ripetere l'incubazione e la centrifugazione dei campioni. Trasferire ogni eluizione nella provetta corrispondente.

Dopo aver centrifugato l'eluizione combinata per due minuti a 2500 volte G, trasferire ciascun surnatante in una nuova provetta per garantire la completa rimozione della resina. Successivamente, utilizzare un concentratore sottovuoto per asciugare l'eluito per due ore a temperatura ambiente. Risospendere i glicopeptidi essiccati in 15 microlitri di 2%ACN e 05%TFA in acqua doppia distillata.

Quindi, eseguire l'analisi della spettrometria di massa come indicato nel protocollo di testo. In questo studio, le proteine ECM del tessuto cardiovascolare sono preparate per l'analisi della spettrometria di massa tandem della cromatografia liquida della composizione della ECM, nonché per l'analisi dei glicopeptidi indiretti e diretti. La strategia di base si basa su incubazioni sequenziali con cloruro di sodio, SDS e guanadina cloridrato seguite da analisi indiretta o diretta dei glicopeptidi.

L'efficienza dell'estrazione viene monitorata su gel di bis-tris acrilammide con colorazione all'argento per la visualizzazione. Dei tre estratti eseguiti, la maggior parte delle glicoproteine della MEC si trova nelle aliquote di guanadina cloridrato. Le glicoproteine della MEC sono decorate con catene di glicani glicaminici grandi e ripetitive insieme a oligosaccaridi legati a N e O corti e diversificati.

L'efficienza della deglicosilazione si osserva con l'aggiunta di enzimi che digeriscono i glicani glicosaminici e di enzimi che prendono di mira gli oligosaccaridi più piccoli legati a N e O. Le glicoproteine sono quindi identificate dalla presenza di asparagine deamidate marcate con ossigeno 18 all'interno dei sequoni NXT o NXS. Qui è mostrato uno spettro di massa tandem HCD rappresentativo per un peptide di decorina con un'asparagina deamidata in posizione due 11.

La frammentazione dell'HCD ETD viene quindi utilizzata per analizzare l'estratto di ECM arricchito con glicoproteine. Lo spettro di massa tandem ETD consente la caratterizzazione della composizione dei glicani. Una volta padroneggiata, questa tecnica dovrebbe richiedere circa due o tre settimane.

Questa glicoproteomica ci permette di esplorare la funzione fisiologica e patologica della fibrosi non solo sui cambiamenti nella proteomica ma anche sulla composizione degli zuccheri del pensiero. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione su come preparare i campioni per uno studio sulla glicosilazione delle proteine mediante spettrometria di massa. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle malattie cardiovascolari, può essere applicato anche ad altre patologie nella fibrosi di volume, come le malattie respiratorie o il cancro.