L'isolamento di Murine adiposo derivate dal tessuto microvascolare Frammenti come vascolarizzazione Unità per Tissue Engineering

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare frammenti microvascolari dal tessuto adiposo murino per la generazione di unità di vascolarizzazione per l'ingegneria tissutale. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'ingegneria tissutale sulla vascolarizzazione in vivo dei sostituti tissutali. Un vantaggio di questa tecnica è che produce segmenti microvascolari completamente funzionali senza complesse elaborazioni in vitro che possono essere seminati su scaffold e impiantati nei difetti tissutali.

Questo metodo può essere applicato anche ad altri sistemi, come i saggi di angiogenesi in vitro, per svelare i meccanismi molecolari alla base della formazione e del rimodellamento della rete microvascolare. Inizia posizionando un maschio anestetizzato di tipo selvatico C57 nero sei in posizione supina sotto uno stereomicroscopio chirurgico e conferma la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita. Immobilizzare le zampe con del nastro adesivo e disinfettare l'addome.

Successivamente, utilizzare le forbici da dissezione per separare lo strato addominale dal tessuto muscolare sottostante ed eseguire una laparotomia sulla linea mediana. Aprire lateralmente i lembi della parete addominale e identificare bilateralmente i testicoli, l'epididimo e i cuscinetti adiposi dell'epididimo. Quindi utilizzare piccole forbici da preparazione e pinze fini per raccogliere i cuscinetti adiposi, facendo attenzione a non raccogliere alcun tessuto epididimico e posizionare i cuscinetti adiposi in una capsula di Petri contenente 15 ml di DMEM a 37 gradi Celsius.

In una cappa a flusso laminare, lavare i cuscinetti adiposi in tre piastre di Petri separate contenenti 15 ml di PBS e porre il grasso lavato in una provetta vuota di polipropilene da 14 ml. Utilizzare una bilancia a tubo per determinare il volume del grasso raccolto. Quindi usa le forbici sottili per tritare meccanicamente il tessuto adiposo.

Quando si ottiene una sospensione tissutale omogenea, utilizzare una pipetta dosatrice da 10 ml per trasferire il tessuto tritato con due volumi di collaginasi NB 4G in un pallone di erlenmeyer da 50 ml contenente un'ancorette da 25 mm. Mettere il pallone in un incubatore per colture cellulari per 10 minuti agitando energicamente. Quindi, osservare 10 mcL del tessuto digerito al microscopio.

Il passo più difficile in questa procedura di isolamento è identificare il momento appropriato per fermare la digestione. Digerire i cuscinetti adiposi troppo a lungo si tradurrà in una sospensione di una singola cellula senza frammenti microvascolari. Se il digestato contiene frammenti microvascolari derivati dal tessuto adiposo libero accanto a singole cellule, neutralizzare l'enzima con due volumi di PBS integrati con il 20% di FCS e trasferire la sospensione del vaso cellulare in nuove provette di polipropilene.

Incubare la soluzione per cinque minuti a 37 gradi Celsius per separare i frammenti microvascolari dal grasso rimanente per gravità. Quindi, utilizzare una pipetta di precisione da un ml per rimuovere con cura un ml del surnatante di grasso principale, seguito dall'uso di una pipetta di precisione da 100 ml per rimuovere il resto del surnatante fino a quando la sospensione non sembra essere priva di grassi. Quando tutto il grasso è stato rimosso, utilizzare una pipetta dosatrice da 10 ml per filtrare la sospensione del vaso cellulare attraverso un colino da 50 micron su una provetta conica da 50 ml e trasferire la sospensione filtrata in una nuova provetta in polipropilene da 14 ml per ogni singolo frammento microvascolare isolato.

Raccogliere i pellet di frammenti microvascolari mediante centrifugazione e rimuovere tutto tranne l'ultimo mL di surnatante da ciascuna provetta. Risospendere i pellet nei supernatenti rimanenti. Quindi, trasferire ciascuna sospensione in singole provette da microcentrifuga coniche da 1,5 mL e pellettare nuovamente i frammenti microvascolari per la risospensione nel volume finale appropriato di PBS e 20% di FCS per l'analisi pianificata a valle.

Qui viene mostrata la distribuzione della lunghezza dei frammenti microvascolari appena isolati da sei topi neri C57 wild type di sei, sette a dodici mesi, con una lunghezza media media di circa 42 micrometri osservata. Come dimostra questo striscio rappresentativo di sospensione dei vasi cellulari, si osservano frammenti microvascolari grandi, medi e piccoli, nonché singole cellule quando il tessuto adiposo è stato sufficientemente digerito. Un ingrandimento più elevato rivela che i frammenti microvascolari mostrano una morfologia microvascolare matura con segmenti microvascolari gerarchici.

La caratterizzazione dei frammenti microvascolari mediante citometria a flusso indica che contengono cellule endoteliali CD31 positive, cellule paravascolari alfa della muscolatura liscia acton positive e cellule staminali mesenchimali CD117 positive, cellule che esprimono marcatori. Dopo la semina su un sostituto cutaneo dermico, i frammenti microvascolari più grandi sono localizzati principalmente sulla superficie dell'impianto con alcuni segmenti di vasi capillari rilevati all'interno dei nuclei dell'impianto. La colorazione immunoistochimica dei frammenti microvascolari seminati rivela inoltre configurazioni fisiologiche dei microvasi con frammenti arteriolari, venulari e capillari.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare frammenti microvascolari dal tessuto adiposo murino come unità di vascolarizzazione per l'ingegneria tissutale.