Name: Fette di cuore ventricolare dellasse corto dellurina per gli studi elettrofisiologici (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Scopri la preparazione di fette ventricolari vitali da cuore di topo per registrazioni elettrofisiologiche. Questa tecnica preserva la struttura tissutale in vivo e consente misurazioni dirette in tutte le regioni cardiache.

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Riconosciamo il sostegno offerto dai laboratori e dalla struttura animale dell&#39;Istituto di Neurofisiologia. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Walter und Marga Boll-Stiftung, dalla Köln Fortune e dalla Deutsche Stiftung für Herzforschung.

La manipolazione degli animali deve essere conforme alle linee guida del comitato locale per la protezione degli animali e alla direttiva 2010/63 / UE del Parlamento europeo. 1. Preparare soluzioni <ol><li> Preparare la soluzione di Tyrode senza Ca 2+ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, 2,3-butanedione monoxime (BDM) 30. Regolare il pH a 7,4 Con NaOH a 4 ° C. </li><li> Preparare la soluzione di Tyrode con Ca 2+ (composizione in mM): NaCl 136, KCl 5,4, NaH 2 PO 4 0,33, MgCl2 1, glucosio 10, HEPES 5, BDM 30, CaCl2 0,9. Regolare il pH a 7,4 con NaOH a 4 ° C. </li><li> Preparare agarosio a basso contenuto di fusione al 4%: inserire 0,6 g di agarosio a bassa percentuale di fusione in soluzione di Tyrode da 15 ml senza Ca 2+ . Scaldare la miscela in un forno a microonde due volte a 750 W per 10-15 s finché l&#39;agarosio non si scioglie. Tenere la soluzione a una temperatura costante di 37 &amp;# 176; C e mescolare continuamente. </li><li> Mantenere il Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) senza siero a 37 ° C in bolle con carbogeno (5% CO 2 , 95% O 2 ). </li></ol> 2. Preparare il Microtomo <ol><li> Accendere il microtomo. </li><li> Riempire la camera esterna del microtomo con ghiaccio. </li><li> Riempire la camera interna del microtomo con la soluzione di Tyrode ghiacciata senza Ca 2+ e continuamente ossigenare la soluzione con 100% O 2 . </li><li> Mettere una lamiera d&#39;acciaio nel porta-lama del microtomo. </li></ol> 3. Isolamento del cuore del mouse <ol><li> Iniettare 2,500 U di eparina sottocutanea. Attendere 15 min. </li><li> Sacrificare l&#39;animale per dislocazione cervicale. </li><li> Apri il petto con la sternotomia. </li><li> Separare con attenzione il pericardio usando piccole forbici e una pinza # 5. </li><li> Inserire una cannula nell&#39;arto ascendente e perfezionare le arterie coronarie in situ con Tyrode&#39;s ghiaccio freddoSoluzione senza Ca 2+ fino a rimuovere il sangue rimanente. </li><li> Rescondare delicatamente il cuore con una pinza e forbici e trasferire il cuore in soluzione fredda di Tyrode, guidata senza Ca 2+ . </li><li> Separare l&#39;atria dai ventricoli con un bisturi o forbici. </li></ol> 4. Incorporazione dei ventricoli in agarosio a basso contenuto di fusione del 4% <ol><li> Posizionare i ventricoli con l&#39;apice rivolto verso l&#39;alto nello stampo agarosio ( Figura 1 ). Posizionare il perno in mezzo dello stampo nella camera ventricolare sinistra. </li><li> Riempire lo stampo con agarosio a basso contenuto di fusione al 4% a 37 ° C, finché il cuore non sia completamente coperto. </li><li> Posizionare lo stampo sul ghiaccio per una tempra più rapida dell&#39;agarosio che impedisce il galleggiamento del tessuto. </li><li> Rimuovere il blocco di agarosio contenente i ventricoli dallo stampo con un bisturi. </li><li> Girare il blocco capovolto e riempire le camere ventricolari e il divario sul retro del blocco agarosio, cheS lasciata dal perno del molt, con agarosio a basso contenuto di fuso al 4% utilizzando una siringa con un ago da 20 G. </li><li> Tagliare il blocco di agarosio con uno scalpello per ottenere un fondo piatto del blocco e in posizione verticale dell&#39;apice cardiaco. </li></ol> 5. Sezione del tessuto ventricolare <ol><li> Fissare il blocco sul supporto del campione del microtomo con una goccia di colla cianoacrilato. Affrontare l&#39;apice cardiaco verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare il supporto del campione nella camera del campione interno del microtomo, che è riempito di Tyrode senza ghiaccio senza Ca 2+ . Completamente coprire il blocco di agarosio con la soluzione di Tyrode. </li><li> Preparare le fette di asse corto a uno spessore di 150-400 μm, a seconda dell&#39;ulteriore applicazione (per registrazioni di elettrodo nitido 150-200 μm), mantenere la frequenza di vibrazione della lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile . </li><li> Utilizzare una spazzola fine per rimuovere attentamente l&#39;agarosio residuo dalle fette. </li><li> Trasferisce delicatamenteR sezioni con una pipetta Pasteur nella soluzione Tyrode con 0,9 mM Ca 2+ aerata con 100% O 2 e conservarle per almeno 30 minuti in ghiaccio per recuperare dalla procedura di affettatura. </li><li> Successivamente, tenere le fette per 30 minuti in DMEM a 37 ° C, aerata con carbogeno, per lavare BDM prima dell&#39;uso successivo. </li></ol> 6. Preparazione dell&#39;installazione dell&#39;elettrodo Sharp <ol><li> Per il pre-riscaldamento, accendere tutti i dispositivi elettrici 30 minuti prima che le registrazioni inizieranno. </li><li> Mettere un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante posta sul microscopio invertito. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo ad anello su misura ( figura 2 ) nel piatto e collegare i fili di messa a terra del preamplificatore e dell&#39;elettrodo di stimolazione. </li><li> Collegare i tubi flessibili del sistema di perfusione al piatto. </li><li> Riempire il serbatoio del sistema di perfusione con DMEM, aerato con carbogeno. </li><li> Accendere la pompa di perfusione e impostare la perfusioneTe a 2-3 ml / min. </li><li> Regolare la temperatura del DMEM nel piatto a 37 ° C regolando il riscaldatore di flusso e la piastra riscaldante. </li></ol> 7. Potenziali registrazioni di azione <ol><li> Mettere una fetta ventricolare nel piatto riempito con DMEM. </li><li> Controllare l&#39;integrità strutturale e la vitalità (sulla base della funzione contrattile) del tessuto con il microscopio invertito. </li><li> Riempire un elettrodo di vetro di registrazione con 3 M KCL. </li><li> Riempire un elettrodo di stimolazione con DMEM. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di registrazione e l&#39;elettrodo di stimolazione sui supporti degli elettrodi. </li><li> Posizionare con cura l&#39;elettrodo di stimolazione sulla fetta e accendere lo stimolatore elettrico. Inizia con una frequenza di stimolazione di 1-2 Hz. </li><li> Spostare l&#39;elettrodo di registrazione con il micromanipolatore sulla posizione di registrazione desiderata. </li><li> Abbassare lentamente l&#39;elettrodo di registrazione fino a quando la punta tocca il tessuto. </li><li> Applicare un breve impulso elettrico rettangolare attraverso laL&#39;elettrodo di registrazione per penetrare nella membrana cellulare. </li><li> Riposizionare con cautela l&#39;elettrodo di registrazione fino a garantire un segnale stabile. </li><li> Avviare la registrazione dei potenziali di azione. </li></ol>

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<li>Verrecchia, F., Herve, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+blockade+of+gap+junctional+communication+by+2%2C3-butanedione+monoxime+in+rat+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Reversible blockade of gap junctional communication by 2,3-butanedione monoxime in rat cardiac myocytes.</a> Am J Physiol. 272, C875-C885 (1997).</li>
<li>Watanabe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitory+effect+of+2%2C3-butanedione+monoxime+%28BDM%29+on+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchange+current+in+guinea-pig+cardiac+ventricular+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes.</a> Br J Pharmacol. 132, 1317-1325 (2001).</li>
<li>Fleischmann, B. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+subunit+composition+of+the+G+protein-activated+inward-rectifier+potassium+channel+during+cardiac+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Differential subunit composition of the G protein-activated inward-rectifier potassium channel during cardiac development.</a> J Clin Invest. 114, 994-1001 (2004).</li>
<li>Peinkofer, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Early+Embryonic+to+Adult+Stage%3A+Comparative+Study+of+Action+Potentials+of+Native+and+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">From Early Embryonic to Adult Stage: Comparative Study of Action Potentials of Native and Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes.</a> Stem Cells Dev. 25, 1397-1406 (2016).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da dichiarare.

Le fetture ventricolari consentono studi elettrofisiologici, farmacologici e meccanici con una struttura tissue preservata in vivo e accesso diretto della tecnologia di misura a tutte le regioni del cuore. Le proprietà del potenziale fisiologico di azione sono state dimostrate in fette embrionali, neonatali e adulti 9 , 10 , 11 . La vitalità delle fette, ad eccezione degli strati superficiali direttamente danneggiati d...

Le fette di tessuto sottile sono state utilizzate frequentemente nella scienza di base poiché Yamamot e Mcllwain hanno mostrato nel 1966 che l&#39;attività elettrica delle fette del cervello è mantenuta in vitro 1 . Da allora, studi elettrofisiologici e farmacologici sono stati condotti su fette da cervello 2 , fegato 3 , polmone 4 e tessuto miocardico 5 , 6 , 7 . Le prime registrazioni di patch-clamp in fette ventricolari da cuori di ratto neonatale sono state descritte nel 1990 8 , ma questa tecnica è caduta nell&#39;oblio per un certo tempo. Più di un decennio più tardi, il nostro gruppo ha stabilito un nuovo metodo per preparare le embrioni murine 9 , le neonate 10 e le 11 fette di cuore adulte. Queste fette di tessuto vitale possono essere utilizzate per esperimenti acuti (fetta adultaS possono essere coltivati ​​per diverse ore) o esperimenti di coltura a breve termine (fette embrionali e neonatali possono essere coltivate per alcuni giorni). Le fette mostrano in vivo caratteristiche elettrofisiologiche simili e una diffusione di eccitazione omogenea valutata con potenzialità di azione dell&#39;elettrodo acuto e registrazioni a matrice di microelettrodi 11 . Grazie alla loro morfologia &quot;bidimensionale&quot;, consentono l&#39;accesso diretto degli elettrodi di registrazione a tutte le regioni del ventricolo, che li rende uno strumento interessante per le indagini elettrofisiologiche e solleva nuove opzioni sperimentali rispetto ai cuori interi perfezionati da Langendorff. La risposta del farmaco delle fette ai bloccanti del canale ionico come verapamil (bloccante canale L-tipo Ca 2+ ), lidocaina (bloccante Na + -cannel), 4-aminopiridina (bloccante K + -kanelare dipendente dalla tensione non selettiva) e linopirdina (KCNQ K + - blocco canale) 9 , 11 </suP&gt; corrispondevano a effetti noti sui cardiomiociti dissociati. Le misure di forza isometrica hanno rivelato una relazione positiva di frequenza di forza e suggerito fortemente la funzione contrattuale intatta 10 . Questi risultati hanno dimostrato che le fettine ventricolari murine sono adatte come un modello di tessuto in vitro per studi fisiologici e farmacologici. Inoltre, le fetture ventricolari di cuori riceventi in combinazione con registrazioni di elettrodo nitide hanno dimostrato di essere uno strumento molto utile per caratterizzare l&#39;integrazione elettrica e meccanica, nonché la maturazione dei cardiomiociti fetali 12 , 13 e 14 trapiantati. In sintesi, le fetture ventricolari sono un prezioso e ben consolidato modello di tessuto multicellulare e devono essere considerati complementari ai cardiomiociti dissociati e ai cuori perfezionati da LangendorffNella ricerca cardiovascolare, con il grande vantaggio di fornire una struttura tissutale in vivo (in contrasto con le cellule dissociate), nonché l&#39;accesso diretto delle tecnologie di misura come le registrazioni di elettrodo nitido a tutte le regioni del cuore (in contrasto con i preparati cardiaci interi).

<table><tbody><tr><td>Leica VT 1000s</td><td>Leica Microsystems, Wetzlar, Germania</td><td></td><td>Microtomo con lama vibrante.</td></tr><tr><td>Lame in acciaio inossidabile</td><td>Campden Instruments, Loughborough, Inghilterra</td><td>7550-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>Z627992</td><td></td></tr><tr><td>Fine brush, e.g. misura 6 (4/32")</td><td>VWR, International, Radnor, USA</td><td>149-2125</td><td></td></tr><tr><td>Tavolo</td><td></td><td></td> di preparazione <td></td></tr><tr><td>autocostruito Molt per l'inclusione di ventricoli in agarosio</td><td></td><td></td><td>autoprodotto</td></tr><tr><td>1 ml siringa</td><td>Becton, Dickinson; Franklin Lakes, USA</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>27 G x 3/4'' Aghi</td><td>Braun, Melsungen, Germania</td><td>4657705</td><td></td></tr><tr><td>20 G 11/2'' Aghi</td><td>4657519</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Forbice piccola</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette #5, 0,1 x 0,06 mm</td><td>punta WPI, Sarasota, USA</td><td>500342</td><td></td></tr><tr><td>Gas ossigeno (grado medico O2)</td><td>Linde, Monaco di Baviera, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gas carbogen (95 % O2, 5 % CO2)</td><td>Linde, Monaco di Baviera, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, USA</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti</td><td>51558</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-glucosio</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louise, Stati Uniti</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Colla cianoacrilica</td><td>Henkel, D&uuml; sseldorf, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarosio Roth a basso punto di fusione</td><td>, Karlsruhe, Germania</td><td>6351.2</td><td></td></tr><tr><td>Eparina-sodico-25000 I.E./5 mL</td><td>Ratiopharm, Ulm, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), glucosio alto, GlutaMAX</td><td>ThermoScientific, Waltham, USA</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>SEC-10LX Amplifier</td><td>npi electronic GmbH, Tamm, Germania</td><td>SEC-10LX</td><td></td></tr><tr><td>EPC 9</td><td>HEKA Elektronik GmbH, Lambrecht, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss Axiovert 200</td><td>Zeiss, Oberkochen, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a basso ingrandimento</td><td>Narashige, Tokyo, Giappone</td><td>Nm-3</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore a tre assi ad alto ingrandimento</td><td>Narashige, Tokyo, Giappone</td><td>MHW-3</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td> <td>di perfusione peristalticaMulti Channel Systems, Reutlingen, Germania</td><td>PPS2</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura a 2 canali</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Germania</td><td>TCO02</td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore di impulsi quadrato</td><td>Natus Europe GmbH, Planegg, Germania</td><td>Grass SD9</td><td></td></tr><tr><td>Capillari in vetro</td><td>WPI, Sarasota, USA</td><td>1B150F-1</td><td></td></tr></tbody></table>

fette di cuore ventricolare dell&#39;asse corto dell&#39;urina per gli studi elettrofisiologici

Murine Short Axis Ventricular Heart Slices for Electrophysiological Studies

Cardiomiociti murini sono stati ampiamente utilizzati per studi in vitro di fisiologia cardiaca e nuove strategie terapeutiche. Tuttavia, le preparazioni multicellulari di cardiomiociti dissociati non rappresentano la struttura complessa in vivo di cardiomiociti, non miociti e matrice extracellulare, che influenza sia le proprietà meccaniche che elettrofisiologiche del cuore. Qui descriviamo una tecnica per preparare fette ventricolari vitali di cuori adulti con un tessuto tissutale in vivo e dimostrare la loro idoneità alle registrazioni elettrofisiologiche. Dopo l&#39;escissione del cuore, i ventricoli vengono separati dall&#39;atria, perfezionati con soluzione Ca 2+ -libera contenente 2,3-butanedione monoxime e incorporati in un blocco agarosio a basso contenuto di fusione al 4%. Il blocco è posto su un microtomo con una lama vibrante, e fettine di tessuto con uno spessore di 150-400 μm sono preparate mantenendo la vibrazione freDella lama a 60-70 Hz e spostare la lama in avanti in modo più lento possibile. La spessore delle fette dipende dall&#39;ulteriore applicazione. Le fette vengono conservate in soluzione di Tyrode ghiacciata con 0,9 mM Ca 2+ e 2,3-butanedione monoxime (BDM) per 30 minuti. Successivamente, le fette vengono trasferite a 37 ° C di DMEM per 30 minuti per lavare il BDM. Le fette possono essere utilizzate per studi elettrofisiologici con elettrodi taglienti o matrici di microelettrodi, per misurare le forze per analizzare la funzione contrattile o per indagare l&#39;interazione tra i cardiomiociti derivanti dalle cellule staminali trapiantati e il tessuto ospite. Per registrazioni di elettrodo nitide, una fetta viene posta in un piatto di coltura da 3 cm sulla piastra riscaldante di un microscopio invertito. La fetta è stimolata con un elettrodo unipolare e potenziali d&#39;azione intracellulari di cardiomiociti all&#39;interno della fetta sono registrati con un elettrodo di vetro nitido.

L&#39;infarto miocardico porta ad una perdita praticamente irreversibile di cardiomiociti. La terapia sostitutiva cellulare che utilizza cardiomiociti derivanti da cellule staminali per la rigenerazione cardiaca esogena è un approccio terapeutico promettente. L&#39;integrazione elettrica e la maturazione delle cellule trapiantate sono fondamentali per la sicurezza e l&#39;efficienza della terapia sostitutiva delle cellule. Per...

Qui descriviamo la preparazione di fette ventricolari vitali da topi adulti e il loro utilizzo per registrazioni potenziali di azione elettrodo. Queste preparazioni multicellulari forniscono una struttura tissutale conservata in vivo , che li rende un prezioso modello per studi elettrofisiologici e farmacologici in vitro .

Fette di cuore ventricolare dell&#39;asse corto dell&#39;urina per gli studi elettrofisiologici

Murine cardiomyocytes have been extensively used for in vitro studies of cardiac physiology and new therapeutic strategies. However, multicellular ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è ottenere fette di cuore ventricolari vitali, adatte per registrazioni elettrofisiologiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia cardiaca a livello tissutale, come ad esempio sull'integrazione elettrica di cardiomiociti trapiantati o sugli effetti di farmaci cardioattivi. Il principale vantaggio di questa tecnica è che le fette di tessuto ventricolare vitali mantengono una struttura tissutale simile a quella in vivo, consentendo misurazioni dirette in tutte le regioni del cuore.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla fisiologia elettrofisiologica del cuore murino, può essere applicato anche ad altri animali, come coniglio o criceto. Per iniziare questa procedura, pulire innanzitutto la pelle dell'animale con etanolo al 70%. Dopo aver aperto il torace, dissezionare con attenzione il pericardio del cuore utilizzando forbici e pinze di piccole dimensioni.Inserire una cannula nel ventricolo sinistro e perfondere il cuore in situ con soluzione di Tyrode fredda senza calcio, fino a rimuovere completamente il sangue residuo. Successivamente, resecare delicatamente il cuore e trasferirlo nella soluzione di Tyrode fredda senza calcio. Separare le atria dai ventricoli utilizzando un bisturi o delle forbici.Successivamente, posizionare i ventricoli con l'apice rivolto verso l'alto nello stampo in agarosio. In seguito, inserire il perno al centro dello stampo e nella camera del ventricolo sinistro. Riempire lo stampo con agarosio a basso punto di fusione al 4% a 37 gradi Celsius fino a quando il cuore non è completamente ricoperto.Quindi, posizionare lo stampo sul ghiaccio per accelerare l'indurimento dell'agarosio ed evitare che il tessuto galleggi. Dopo un minuto, rimuovere con un bisturi il blocco di agarosio contenente i ventricoli dallo stampo. Successivamente, capovolgere il blocco e riempire le camere ventricolari e lo spazio presente sul retro del blocco di agarosio con agarosio a basso punto di fusione al 4% utilizzando una siringa.Quindi, modellare il blocco di agarosio con un bisturi per ottenere una superficie inferiore piatta e una posizione verticale dell'apice cardiaco. In questa procedura, fissare il blocco sul portacampioni del microtomo con una goccia di colla a base di cianoacrilato, con l'apice cardiaco rivolto verso l'alto. Successivamente, inserire il portacampioni nella camera interna del microtomo, riempita con Tyrode freddo senza calcio.Assicurarsi che il blocco di agarosio sia completamente ricoperto dalla soluzione di Tyrode. Preparare le sezioni con uno spessore compreso tra 150 e 400 micrometri, a seconda dell'applicazione successiva. Mantenere la frequenza di vibrazione della lama tra 60 e 70 hertz e spostare la lama in avanti il più lentamente possibile.Successivamente, utilizzare un pennello fine per rimuovere con attenzione l'agarosio rimanente dalle fette. Poi, trasferire delicatamente le fette con una pipetta di Pasteur nella soluzione di Tyrode, contenente calcio 0,9 millimolare, aerata con ossigeno al 100%. Conservarle per almeno 30 minuti sul ghiaccio per permettere il recupero dopo la procedura di sezionamento.Posizionare le fette su una rete aiuta a mantenerle piatte. Successivamente, utilizzare una carta filtrante e una seconda rete per trasferire le fette in DMEM a 37 gradi Celsius, saturato con carbogeno, per eliminare il BDM prima di ulteriori utilizzi. Per il preriscaldamento, accendere tutti i dispositivi elettrici 30 minuti prima delle registrazioni.Posizionare una piastra di coltura cellulare da tre centimetri con la piastra riscaldante sul microscopio invertito. Successivamente, posizionare l'elettrodo ad anello su misura nella piastra e collegare i cavi di messa a terra del preamplificatore e dell'elettrodo di stimolazione. Dopodiché, collegare i tubi flessibili del sistema di perfusione alla piastra.Riempire il serbatoio del sistema di perfusione con DMEM e aerarlo con carbogeno. Successivamente, accendere la pompa di perfusione e impostare la velocità di perfusione da due a tre millilitri al minuto. Regolare la temperatura del DMEM nella piastra a 37 gradi Celsius, regolando il riscaldatore del flusso e la piastra riscaldata.Ora, posizionare una sezione ventricolare nella piastra riempita con DMEM. Con il microscopio invertito, verificare l'integrità strutturale e la vitalità del tessuto. Successivamente, riempire un'elettrodo di registrazione in vetro con cloruro di potassio 3 molar, e un'elettrodo di stimolazione con DMEM.Successivamente, posizionare l'elettrodo di registrazione nell'elettrodo di stimolazione sui supporti per elettrodi. In seguito, posizionare con attenzione l'elettrodo di stimolazione sulla sezione. Accendere lo stimolatore elettrico e iniziare con una frequenza di stimolazione di uno-due hertz.Quindi, spostare l'elettrodo di registrazione mediante un micromanipolatore nella posizione prevista per la registrazione. Abbassare lentamente l'elettrodo di registrazione fino a quando la punta tocca il tessuto. Una volta che la registrazione rileva il contatto, applicare un breve impulso elettrico rettangolare attraverso l'elettrodo di registrazione per penetrare la membrana cellulare.Successivamente, riposizionare con attenzione l'elettrodo di registrazione fino a garantire un segnale stabile. Dopodiché, iniziare la registrazione dei potenziali d'azione. Per valutare l'integrazione e la maturazione, i cardiomiociti, derivati da iPSCM che esprimono eGFP, sono stati trapiantati nei cuori sani di topi adulti.Qui è mostrata una sezione cardiaca ventricolare, contenente iPSCM trapiantati, che sono stati stimolati focalmente mediante un elettrodo unipolare posizionato nel tessuto ospite. I potenziali d'azione intracellulari sono stati registrati con microelettrodi vetrini affilati riempiti con cloruro di potassio tre molare e cellule iPSCM trapiantate positive per eGFP, e con il tessuto ospite adiacente all'interno delle sezioni. Qui di seguito sono riportate le registrazioni dei potenziali d'azione nel tessuto ospite sano e negli iPSCM trapiantati.La sezione è stata stimolata localmente mediante un elettrodo di stimolazione posizionato nel tessuto ospite, a circa due hertz e cinque hertz. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in uno o due ore, se effettuata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere la velocità in avanti della lama del microtomo il più lenta possibile.Al termine di questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi, come le prime misurazioni, al fine di rispondere a ulteriori domande. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della terapia cellulare per esplorare l'attività elettrica, l'integrazione e la maturazione dei cardiomiociti trapiantati nei cuori riceventi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come preparare fette vitali dell'asse corto ventricolare, utilizzando un microtomo con lama vibrante.Queste sezioni sono particolarmente adatte per le registrazioni elettrofisiologiche con elettrodi di vetro affilati.

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