Name: Quantificazione della pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 41 s
Description: Scopri un metodo rapido per quantificare la pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster tramite analisi digitale delle immagini. Questa tecnica non distruttiva consente di studiare la biologia evolutiva con precisione.

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Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation per IOS-1256565 e IOS-1557638 a AWS. Ringraziamo Patricia Wittkopp e tre anonimi recensori per i loro commenti utili su una versione precedente di questo articolo.

1. Montaggio del campione NOTA: Conservare le mosche morte in etanolo al 70% in acqua prima dell&#39;immagine. <ol><li> Versare 10 ml di agar 1,25% agar disciolto in acqua bollente in un piatto di Petri da 60 mm x 15 mm e lasciarlo impostare. </li><li> Sotto un microscopio di dissezione, utilizzare una coppia di pinze a punta fine per fare una scanalatura di 20 mm, una scanalatura profonda di 2 mm di profondità da 1 mm sulla superficie del gel. Utilizzando pinze fine, incorporare il lato ventrale di un mosca adulto nella scanalatura, con il lato dorsale della mosca che proietta sopra il gel. NOTA: L&#39;allentamento del gel consente un semplice riposizionamento senza danneggiare il campione. La stessa scanalatura può essere usata per più esemplari, anche se diventa sporca, spezzata e inutilizzabile nel tempo. L&#39;utente può quindi eseguire un&#39;altra scanalatura nello stesso gel. Ogni piastra può essere usata per immagini ~ 200 mosche. </li><li> Completamente coprire il campione in etanolo al 70% in acqua per ridurre le riflessioni della luce dalla cuticola cerosa e per evitare danni alle ali duranteManipolazione dei campioni. </li></ol> 2. Impostazione del microscopio NOTA: Le immagini vengono acquisite utilizzando un campo di dissezione, una base di luce trasmessa, una fotocamera digitale e una fonte di luce fredda a gooseneck collegata ad un computer che esegue il software di acquisizione di immagini. Le istruzioni del software sono specifiche di Micro-Manager v1.4.20 44 , che è un software open source che incorpora ImageJ 45 . <ol><li> Accendere il microscopio, la fotocamera digitale, la fonte di luce fredda a doppio fascio e il computer. </li><li> Esegui il software di acquisizione delle immagini per aprire una finestra Micro-Manager e una finestra ImageJ. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;Image&quot;&gt; &quot;Type&quot;&gt; &quot;8-Bit&quot; per impostare tutte le immagini come 8 bit. Fai clic su &quot;live&quot; nella finestra Micro-Manager per aprire una finestra &quot;Snap / Live&quot; che mostra un&#39;anteprima in tempo reale dalla fotocamera. <ol><li> Massimizza la dimensione della finestra &quot;Snap / Live&quot; se nesario. Selezionare &quot;Scala di grigi&quot; nel menu &quot;Modalità di visualizzazione&quot; a discesa nella scheda &quot;Contrasto&quot; della finestra Micro-Manager. </li></ol></li><li> Accendere la fonte di luce fredda fino alla sua massima intensità e posizionare le punte di ciascun collo a circa 120 mm dalla fase, una sulla sinistra e una sulla destra. NOTA: Gli utenti possono anche utilizzare un illuminatore anulare, anche se questo può generare un anello di luce riflessa attorno all&#39;addome mosca. </li><li> Impostare manualmente l&#39;ingrandimento del microscopio a 60x in modo che il campo visivo cattura una superficie di circa 3 mm sul palco. </li><li> Posizionare un micrometro di fase a 2 mm sul palco (passando lo sfondo a bianco, se necessario). Mentre guardi l&#39;anteprima dal vivo, concentrarsi sul micrometro di fase e regolare l&#39;esposizione nella finestra Micro-Manager immettendo il tempo di esposizione in ms nella casella &quot;Esposizione&quot;. </li><li> Per calibrare la fotocamera spazialmente, selezionare lo strumento &quot;linea retta&quot; in tLui ImageJ finestra e disegnare una linea la lunghezza del micrometro di fase. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;Analizza&quot;&gt; &quot;Imposta scala&quot; per aprire la finestra &quot;Imposta scala&quot;, inserire la lunghezza del micrometro in μm nella casella &quot;Distanza nota&quot; e immettere &quot;μm&quot; nell&#39;unità di &quot;lunghezza&quot; scatola. <ol><li> Vedere che la finestra &quot;Imposta scala&quot; visualizza la scala in &quot;pixel / μm&quot;. Prendi nota della scala e fai clic su &quot;OK&quot;. </li></ol></li><li> Nella finestra &quot;Snap / Live&quot;, fare clic su &quot;Stop&quot; e poi su &quot;Snap&quot; per catturare un&#39;immagine del micrometro di fase. </li><li> Salvare l&#39;immagine come una TIFF in scala di grigi a 8 bit per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. Nella finestra ImageJ fare clic su &quot;File&quot;&gt; &quot;Salva con nome&quot;&gt; &quot;Tiff ...&quot; Specificare dove salvare il file nel file browser, denominare il file e fare clic su &quot;Salva&quot;. </li><li> Commutare il palco in nero e postoUn piatto di Petri che tiene una mosca montata in agar (punti 1.1-1.2) sul palco. </li><li> Guardate attraverso il microscopio e posizionate la mosca per assicurare che la linea mediana dorsale sia dritta per vedere meglio il pattern di pigmentazione. Spostare le ali e le appendici per assicurare che la vista dell&#39;addome non sia ostacolata. Se la cuticola pigmentata (a2-a5) non è visibile, estrarre lateralmente l&#39;addome fino a quando non è (anche se l&#39;addome delle mosche è conservato in etanolo al 70% in acqua, quindi questo non è di solito necessario). NOTA: quando si posiziona la mosca, potrebbe essere necessario utilizzare un ingrandimento inferiore (20X). L&#39;ingrandimento deve essere restituito a 60X prima di procedere. </li><li> Messa a fuoco manuale sull&#39;addome dorsale della mosca. Regolare manualmente le punte della sorgente luminosa per ridurre al minimo le ombre e la riflessione sull&#39;addome dorsale. </li><li> Guardando l&#39;anteprima dal vivo sullo schermo del computer e utilizzando l&#39;istogramma del valore di pixel nella scheda &quot;Contrasto&quot; della finestra Micro-Manager,Regolare l&#39;esposizione come descritto nel punto 2.4 per massimizzare l&#39;intervallo di valori dei pixel dell&#39;immagine di anteprima. </li><li> Rimuovere il piatto di mosca e Petri e sostituirli con un LED (uscita spettrale di 430-660 nm) collegato ad un contatore di tensione, centrato nel campo visivo nella stessa posizione del mosca. Utilizzare il misuratore di tensione e LED come misuratore di luce 46 e registrare la tensione generata dalla luce che colpisce il LED (~ 125 mV). NOTA: il LED e il contatore di tensione vengono utilizzati per garantire che i livelli di luce siano costanti in sessioni di imaging multiple in un singolo esperimento. </li><li> Per la durata dell&#39;esperimento, non modificare ulteriormente la posizione o l&#39;intensità della sorgente luminosa, l&#39;ingrandimento del microscopio o l&#39;esposizione della fotocamera. </li></ol> 3. Esemplare Imaging <ol><li> Posizionare un piatto di Petri in possesso di una mosca montata in agar (punti 1.1-1.3) sullo stadio del microscopio nero. Regolare la posizione del mosca in modo che il terzo e quattroH segmenti addominali sono visibili e la linea mediana dorsale è dritta, come descritto al passaggio 2.9. Assicurarsi che l&#39;ingrandimento sia a 60x prima di procedere. </li><li> Messa a fuoco manuale il microscopio in modo che il terzo e il quarto terzitomi addominali dorsali siano a fuoco. Utilizzare il software di acquisizione di immagini per acquisire un&#39;immagine come un TIFF in scala di grigi a 8 bit, come descritto nel passaggio 2.6. NOTA: L&#39;immagine può essere acquisita a colori e successivamente convertita in scala di grigi per l&#39;analisi. </li><li> Salvare l&#39;immagine come &quot;SESH000_sampleID.tiff&quot;, come descritto nel punto 2.7. NOTA: qui [SESH] è costante, [000] è il numero della sessione ed è variabile ma deve essere di tre cifre e [sampleID] è qualunque cosa desideri, anche se non deve contenere caratteri di sottolineatura (_) aggiuntivi Deve essere di lunghezza costante. [SampleID] dovrebbe includere dettagli sui fattori utilizzati nell&#39;analisi dei dati di pigmentazione ( ad esempio, temperatura o linea di origine), separati da un carattere non-alfabetiCarattere cal, come un trattino (-). Ciò consente a questi fattori di essere facilmente analizzati da [sampleID] usando un software statistico standard. </li><li> Rimuovere il piatto di Petri dal palco e sostituire la mosca con il prossimo campione. Ripetere i passaggi 3.1-3.3 finché tutti gli esemplari non sono stati riprodotti, senza aggiustare ulteriormente i livelli di illuminazione, l&#39;ingrandimento o l&#39;esposizione. </li></ol> 4. Imaging in diverse sessioni <ol><li> Se le immagini devono essere assunte in più sessioni, mantenere l&#39;intensità della luce, l&#39;esposizione e l&#39;ingrandimento in tutte le sessioni. All&#39;inizio di ogni sessione, controllare la calibrazione spaziale della fotocamera (punto 2.4) e l&#39;intensità della luce sul palco (misurata con il LED / tensione, punto 2.12). </li><li> Cattura e salva un&#39;immagine del micrometro di fase (passaggi 2.5-2.7) per garantire la possibilità di calibrare spazialmente le immagini, se necessario. </li><li> Utilizzare almeno 15 esemplari di controllo e riesaminarli in modo casuale in ogni sessione allo alloW per la rilevazione e l&#39;eliminazione degli effetti di sessione. Assicurarsi che i campioni di controllo duplicati tra le sessioni hanno lo stesso [sampleID] ma diversi [SESH000]. NOTA: i campioni di controllo sono le mosche raccolte, memorizzate e montate in modo identico a campioni sperimentali, ma vengono riprogettati in sessioni. Il numero preciso degli esemplari di controllo dipenderà dall&#39;installazione sperimentale dell&#39;utente. Vedere la discussione per ulteriori dettagli. </li></ol> 5. Analisi delle immagini NOTA: L&#39;analisi delle immagini è condotta in ImageJ 45 e utilizza la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot;, fornita come file aggiuntivo. <ol><li> Posiziona tutte le immagini da analizzare nella stessa cartella. </li><li> Avviare ImageJ e eseguire la macro &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; facendo clic su &quot;Plugins&quot;&gt; &quot;Macro&quot;&gt; &quot;Esegui&quot;, selezionando &quot;Measurement of Pigmentation.ijm&quot; nel browser del file e facendo clic su &quot;Aperto.&quot; NOTA: tutti i passaggi successivi sono all&#39;interno della macro. Ogni passo è un comando macro singolo. </li><li> Si noti che viene aperta una finestra di dialogo &quot;Action Required&quot; che indica &quot;Scegli la cartella in cui sono memorizzate le immagini&quot;. Fai clic su &quot;OK&quot; e utilizza il browser file per selezionare la cartella contenente le immagini e quindi fare clic su &quot;scegli&quot;. </li><li> Si noti che una finestra di dialogo &quot;Azione richiesta&quot; verrà aperta, indicando &quot;Scegli la cartella in cui si desidera memorizzare i dati&quot;. Fare clic su &quot;OK&quot; e utilizzare il browser file per selezionare la cartella desiderata per salvare i profili di pigmentazione. Fai clic su &quot;scegli&quot;. </li><li> Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede &quot;quanti caratteri nel tuo ID campione&quot;? Nella casella di immissione dati, immettere il numero di caratteri in [SampleID], come specificato al passaggio 3.3, e fare clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Notare che verrà aperta una finestra di dialogo che chiede &quot;Quanto è largo il ROI?&quot; Nella casella di immissione dati, immettere la larghezza dei pixel dell&#39;anteriore-Striscia posteriore lungo la quale deve essere letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 1G , figura 2A e 2A &#39;). Fare clic su &quot;OK&quot;; Il valore predefinito è di 20 pixel. NOTA: Il profilo di pigmentazione viene letto attraverso una striscia di cuticola, piuttosto che una linea, per ridurre il rumore dovuto a peli e setole. La larghezza di questa striscia dipenderà dalla risoluzione dell&#39;immagine, ma dovrebbe essere ~ 1/20 della larghezza dell&#39;addome, in pixel. </li><li> Si noti che la macro apre l&#39;immagine del primo volo e una finestra di dialogo chiede se misurare la mosca corrente (fare clic su &quot;Sì&quot;) per passare alla prossima mosca (fare clic su &quot;No&quot;) oppure per uscire dalla finestra Macro (fare clic su &quot;Annulla&quot;). </li><li> Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica &quot;Definire la linea mediana dell&#39;addome dorsale, da ANTERIOR a POSTERIOR&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dall&#39;anteriore al posteriorePer definire la linea mediana dell&#39;addome dorsale. Fare clic su &quot;OK&quot;; Vedi figura 2A e 2A &#39;, linea gialla. NOTA: viene utilizzato per riorientare l&#39;immagine in modo che la linea mediana dorsale sia orizzontalmente sullo schermo, con l&#39;anteriore a sinistra, facendo più facilmente i passaggi successivi. </li><li> Si noti che verrà aperta una finestra di dialogo che indica &quot;Definire il bordo POSTERIOR di Tergite 4 appena dietro la fascia di pigmento&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo della mediana posteriore al bordo laterale destro, in modo tale che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) sia posteriormente posizionato sul bordo posteriore della banda di pigmento (cuticola a5). Fai clic su &quot;OK&quot;; Vedere la Figura 2A e 2A &#39;, linea magenta. NOTA: lo script R rileverà automaticamente il bordo posteriore della fascia di pigmento dal profilo di pigmentazione. </li><li> Si noti una finestra di dialogoSi apre la scritta &quot;Definire il bordo ANTERIOR di Tergite 4 al bordo anteriore della cuticola pigmentata (a2)&quot;. Lo strumento &quot;lineare&quot; sarà già selezionato. Disegnare una linea dal bordo mediano anteriore al bordo laterale destro, in modo che il centro della linea (contrassegnato da un quadrato bianco) si trovi sul bordo anteriore della cuticola pigmentata (cuticola a2). Fai clic su &quot;OK&quot;; Vedere la Figura 2A e 2A &#39; , linea ciano. NOTA: lo script R definirà questo punto come il bordo anteriore della cuticola pigmentata del tergito. Sull&#39;immagine, la macro mostrerà la regione di interesse (ROI) lungo la quale viene letto il profilo di pigmentazione (rettangolo verde, figura 2A e 2A &#39;, ingrandita nella figura 2B e 2B &#39;). La macro aprirà anche una seconda finestra che mostra il profilo di pigmentazione per il ROI ( fig<html> E 2C e 2C &#39;), dove l&#39;asse x è la posizione, espressa come numero di pixel dal bordo posteriore del profilo e l&#39;asse y è il valore medio di pixel in ogni posizione. </li><li> Visualizza le trame del profilo di pigmentazione che verrà aperta dalla macro. Se necessario, fare clic su &quot;Live&quot; nella finestra del profilo per regolare la posizione del ROI in modo che non includa strutture ( es. Setole) che influenzerebbero il profilo di pigmentazione. Una volta che il profilo è soddisfacente, fai clic su &quot;OK&quot;. </li><li> Ripetere i passaggi 5.8-5.11 per Tergite 3. NOTA: La macro esporta i profili di pigmentazione come due file CSV, ognuno denominato &quot;SESH000_samplename_TX_profile.csv&quot;, dove [SESH000_samplename] è il nome dell&#39;immagine e [TX] sia T3 o T4 per il terzo e il quarto tergit. </li><li> Notare che la macro apre l&#39;immagine successiva. Ripetere i passaggi 5.7-5.13 finché tutte le immagini sono state analizzate. </li></ol>Jove_title &quot;&gt; 6. Preprocesso dei dati, analisi e correzione della sessione NOTA: Tutte le analisi dei dati sono condotte in R 47 e usano lo script &quot;Analisi di pigmento.R&quot; fornito. Di seguito, &quot;L ...&quot; indica quali linee di script da eseguire per ciascuna parte dell&#39;analisi. Vedere le informazioni supplementari per ulteriori dettagli sull&#39;esecuzione dell&#39;analisi. <ol><li> Modificare lo script R per impostare la directory di lavoro (L6) e definire il percorso di file nella cartella contenente i profili the.csv (L11). </li><li> Esegui L13-15 per generare un elenco dei profili di pigmentazione memorizzati nella cartella del profilo. </li><li> Caricare e gestire le funzioni &quot;reader&quot; e &quot;addPrimaryKey&quot; (L17-41) per leggere i profili in un singolo frame di dati. </li><li> Modificare lo script a L43 per specificare la calibrazione spaziale delle immagini in μm / pixel, come determinato nel passaggio 2.5. </li><li> Caricare e eseguire il &quot;regolazione&quot;(L46-58) per convertire la posizione del profilo (asse x, figura 2C e 2C &#39;) dai pixel-da-posteriore-edge-of-ROI a μm-from-front-edge-of-ROI e (0 = nero, 255 = bianco) al valore di pigmento (0 = nessun pigmento, 255 = pigmento massimo), il valore del profilo (asse y, figura 2C e 2C &#39;). </li><li> Caricare ed eseguire la funzione &quot;spline.der.er&quot; (L60-71) per generare la spline cubica dei profili di pigmentazione e dei suoi primi e secondi derivati ​​( Figura 2D -2F e 2D &#39;- 2F &#39;). </li><li> Caricare ed eseguire le funzioni &quot;coord&quot; e &quot;assmbly.coord&quot; (L74-163), innanzitutto per estrarre la posizione dei bordi posteriori (T3) e anteriori (T 2 ) della fascia di pigmento ( figura 2D e 2D &#39;;) E il bordo posteriore della cuticola a2 (T1, Figura 2D e 2D &#39;) e quindi estrarre rispettivamente i valori di pigmentazione massima (P max ) e minima (P min ), assunti rispettivamente in T 3 e T 1 . NOTA: Il bordo anteriore della cuticola a2 è già stato definito nel passaggio 5.9. </li><li> Facoltativo: caricare ed eseguire la funzione &quot;chek&quot; (L165-175) per verificare se la funzione &quot;coordina&quot; identifica correttamente le posizioni T 1-3 per un profilo di pigmentazione selezionato a caso. </li><li> Caricare ed eseguire le funzioni di indice e metriche (L178-193) per generare una tabella dati con le intestazioni &quot;Session&quot;, &quot;Sample&quot;, &quot;Tergite&quot;, &quot;id&quot; (una concatenazione di Sample e Tergite), &quot; Pmax &quot; &quot;P min &quot;, &quot;W band &quot; (larghezza della fascia pigmentata, = T3 - T2) e &quot;W tergite &quot; (larghezza del pigmento cUticoli a2-a5, = T3). </li><li> Caricare e eseguire la funzione &quot;correzione&quot; (L196-234) per generare una tabella dati che corregge P max e P min per eventuali fattori di fastidio derivanti da effetti di sessione. Utilizzare l&#39;aumento medio (o diminuzione) di P max o P min dai campioni di controllo riprogettati in sessioni adiacenti temporanee. </li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

Questa metodologia consente l&#39;acquisizione precisa, rapida e ripetibile di dati di pigmentazione in una forma quantitativa adatta a più analisi a valle. Il metodo è stato utilizzato per acquisire dati sull&#39;effetto della temperatura sulla pigmentazione addominale in una linea isogenica di mosche. Tuttavia, la metodologia potrebbe essere utilizzata negli studi di avanzamento genetico per identificare i geni che stanno alla base delle differenze di pigmentazione tra individui, popolazioni o specie o studi reverse-g...

La pigmentazione mostra enormi variazioni fenotipiche tra specie, popolazioni e individui, e anche all&#39;interno di individui durante l&#39;ontogenesi 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Sebbene ci siano innumerevoli studi di pigmentazione in un&#39;ampia varietà di animali, la pigmentazione è stata forse meglio studiata in Drosophila melanogaster , dove è stato utilizzato il pieno potere della genetica molecolare per chiarire i meccanismi di sviluppo e fisiologici che regolano la pigmentazione e come questi meccanismi evolvono 1 , 6 . Molti sono noti sui geni che regolano la sintesi biochimica dei pigmenti in D. melanogaster 7 , 8 ei geni che controllano la temporale e la spazialità diStribuzione di questa biosintesi 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Inoltre, la mappatura genetica ha individuato i siti genetici che sottendono le differenze intra- e interspecifiche nella pigmentazione in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . Sono stati esplorati anche i rapporti tra la pigmentazione e le caratteristiche pleiotropiche, come il comportamento 18 , 19 e l&#39;immunità 19 , 20 , così come il significato adattativo dei modelli di pigmentazione 15 , 21 , 22 . Come tale, la pigmentazione in D. melanogaster è emersa come un potente ma semplice mOdel per lo sviluppo e l&#39;evoluzione di fenotipi complessi. La pigmentazione nell&#39;adulto D. melanogaster è caratterizzata da pattern distinti di melanizzazione sul corpo, in particolare sulle ali e sul torace dorsale e sull&#39;addome. È la pigmentazione di ogni piastra cuticolare (tergita) sull&#39;addoma dorsale, tuttavia, che ha ricevuto la più attenzione. C&#39;è una notevole variabilità in questa pigmentazione ( Figura 1A- F ), a causa sia dei genetici 17 , 23 che quelli ambientali 24 , 25 fattori. La cuticola di un tergite addominale è costituita da compartimenti di sviluppo anteriori e posteriori ( Figura 1G ), ciascuno dei quali può essere ulteriormente suddiviso a seconda della pigmentazione e dell&#39;ornamento 26 . Il vano anteriore comprende sei cuticolaI tipi (a1-a6) e lo scomparto posteriore comprendono tre (p1-p3) ( Figura 1G ). Di queste, la cuticola p1, p2 e a1 sono tipicamente piegate sotto il tergite in abdomeni non stretti in modo che siano nascosti. La cuticola affidabile è caratterizzata da una banda di pigmentazione pesante, qui indicata come una &quot;banda di pigmento&quot;, composta da tipi di cuticola a4 (pelosa con setole moderate) e a5 (pelose con grandi setole), con il bordo posteriore della banda Più pigmentato del bordo anteriore ( Figura 1G ). Anteriore a questa fascia è una regione di cuticola pelosa leggermente pigmentata, che ha setole posteriormente (a3) ​​ma non anteriormente (a2). La variazione della pigmentazione tra le mosche è osservata sia nell&#39;intensità della pigmentazione che nella larghezza della fascia di pigmento. In generale, la variazione è più grande nei segmenti più posteriori (segmenti addominali 5, 6 e 7) ed è più bassa nei segmenti più anteriori (addome addominale3 e 4) 24 . Inoltre, c&#39;è un dimorfismo sessuale nella pigmentazione di D. melanogaster , con i maschi in genere hanno completamente pigmentati quinto e sesto tergi addominali ( Figura 4C ). Nella maggior parte degli studi di pigmentazione addominale in D. melanogaster , la pigmentazione è stata trattata come un tratto categorico o ordinale, con il modello misurato 27 , 28 , 29 o semi-quantitativamente su scala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Questi metodi inevitabilmente soffrono di una mancanza di precisione, e poiché si basano sulla valutazione soggettiva della pigmentazione, è difficile confrontare i dati tra gli studi. Alcuni autori hanno quantificato le dimensioni spaziali della pigmentazione 38 , 39 , l&#39;intensità della pigmentazione di un particolare tipo di cuticola 23 , 25 , 39 , 40 , o l&#39;intensità media della pigmentazione nel tergite addominale nel suo complesso 41 , 42 , 43 . Tuttavia, questi metodi di quantificazione non misurano sia l&#39;intensità e la distribuzione spaziale della pigmentazione addominale contemporaneamente e pertanto non catturano le sfumature di come la pigmentazione varia inTergita propria. Inoltre, molti di questi metodi di quantificazione 38 , 41 , 42 , 43 richiedono la dissezione e il montaggio della cuticola addominale. Ciò richiede tempo e distrugge il campione, rendendolo non disponibile per ulteriori analisi morfologiche. Poiché la comprensione dello sviluppo e dell&#39;evoluzione della pigmentazione addominale si approfondisce, saranno necessari strumenti più sofisticati per misurare rapidamente e con precisione sia la distribuzione spaziale che l&#39;intensità della pigmentazione. L&#39;obiettivo generale di questo metodo è quello di utilizzare l&#39;analisi delle immagini digitali per ottenere una misura replicabile e più precisa della pigmentazione addominale in D. melanogaster . La metodologia comprende tre fasi. In primo luogo, la mosca adulta è montata in modo non distruttivo e viene presa un&#39;immagine digitale dell&#39;addome dorsale. In secondo luogo, utilizzando una macro ImageJ, l&#39;utenteDefinisce una striscia anteriore-posteriore di pixel che si estende dall&#39;anteriore della cuticola a2 alla parte posteriore della cuticola a5 (casella verde, figura 1G ) sia sul terzo che sul quarto segmento addominale. Il valore medio di pixel lungo la larghezza di questa striscia viene quindi estratto lungo il suo asse lungo, generando un profilo che cattura la distribuzione spaziale e l&#39;intensità della pigmentazione in quanto cambia dall&#39;anteriore alla posteriore del tergito. In terzo luogo, uno script R viene utilizzato per descrivere il profilo di pigmentazione matematicamente utilizzando una spline cubica. Lo script R poi utilizza la spline e il suo primo e secondo derivato per estrarre la larghezza della cuticola a2-a5, la larghezza della fascia di pigmento e i livelli massimi e minimi di pigmentazione. Il metodo quantifica quindi sia le caratteristiche spaziali che la profondità della pigmentazione addominale. Questa metodologia quantifica la pigmentazione del terzo e del quarto tergi addominale,Che sono stati al centro di numerosi studi precedenti 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , esclusivamente o in combinazione con più tergiti posteriori. Sebbene meno variabile rispetto al quinto e al sesto tergi addominale, i terzi e terzi non sono completamente pigmentati nei maschi, quindi questo protocollo può essere applicato sia ai maschi che alle femmine. Tuttavia, come indicato qui, il protocollo può essere utilizzato per misurare la pigmentazione nel quinto e sesto tergi addominale nelle femmine. Inoltre, piccole modifiche degli script utilizzati per estrarre le caratteristiche del profilo di pigmentazione dovrebbero permettere che il metodo venga utilizzato per quantificare la variazione della pigmentazione in un&#39;ampia varietà di altreorganismi.

<table><tbody><tr><td>Dumont #5 Pinza per biologia</td><td>FST</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5040</td><td></td></tr><tr><td>Cannocchiale da dissezione</td><td>Leica</td><td>MZ16FA</td><td></td></tr><tr><td>Base</td><td>Leica</td><td>MDG41</td><td></td></tr><tr><td>Fotocamera</td><td>Leica</td><td>DFC280</td><td></td></tr><tr><td>Collo d'oca Sorgente di luce fredda</td><td>Schott</td><td>ACE 1</td><td></td></tr><tr><td>immagine Software di controllo dell'acquisizione</td><td>Micro-Manager v1.3.20</td><td></td><td>https://micro-manager.org/</td></tr> <tr><td>Software di analisi delle immagini</td><td>ImageJ</td><td></td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Software di analisi dei dati</td><td>R 3.3.2</td><td></td><td>https://www.r-project.org/</td></tr> <tr><td>LED</td><td>Thor Labs</td><td>LEDWE-15</td><td></td></tr><tr><td>Multimetro</td><td>Fluke</td><td>Fluke 75 Serie II</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di Petri 60 mm x 15 mm</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229663</td><td></td></tr><tr><td>Micrometro da palcoscenico</td><td>Klarman Rulings, Inc.</td><td>KR-867</td><td></td></tr></tbody></table>

quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; drosophila melanogaster</em

Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster

La pigmentazione è un tratto morfologicamente semplice ma altamente variabile che spesso ha un significato adattativo. Ha servito ampiamente come modello per comprendere lo sviluppo e l&#39;evoluzione dei fenotipi morfologici. La pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster è stata particolarmente utile, consentendo ai ricercatori di identificare i loci che sono alla base delle variazioni inter- e intraspecifiche della morfologia. Fino ad oggi, tuttavia, la pigmentazione addominale D. melanogaster è stata ampiamente analizzata qualitativamente, attraverso un punteggio piuttosto che quantitativo, che limita le forme di analisi statistica che possono essere applicate ai dati di pigmentazione. Questo lavoro descrive una nuova metodologia che consente la quantificazione di vari aspetti del pattern di pigmentazione addominale di D. melanogaster adulte . Il protocollo include il montaggio del campione, la cattura delle immagini, l&#39;estrazione dei dati e l&#39;analisi. Tutto il software utilizzato per le macro delle funzioni di acquisizione e analisi delle immaginiScritta per l&#39;analisi delle immagini open source. Il vantaggio di questo approccio è la capacità di misurare con precisione i tratti di pigmentazione utilizzando una metodologia altamente riproducibile in diversi sistemi di imaging. Mentre la tecnica è stata utilizzata per misurare la variazione nei modelli di pigmentazione della terna di D. melanogaster adulte , la metodologia è flessibile e si applica generalmente ai modelli di pigmentazione in innumerevoli organismi diversi.

Il protocollo è stato utilizzato per esplorare l&#39;effetto dell&#39;allevamento della temperatura sulla pigmentazione addominale. Studi precedenti hanno dimostrato che un aumento della temperatura di sviluppo produce una diminuzione della diffusione della pigmentazione addominale in diverse specie di Drosophila , tra cui D. melanogaster 30 , 32 . In particolare, nei tergiti addominali 3 e 4, la portata della p...

Questo lavoro presenta un metodo per quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster utilizzando l&#39;analisi di immagine digitale. Questo metodo semplifica le procedure tra l&#39;acquisizione di fenotipi e l&#39;analisi dei dati e include il montaggio del campione, l&#39;acquisizione di immagini, l&#39;estrazione del valore dei pixel e la misurazione del tratto.

Quantificazione della pigmentazione addominale in<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Pigmentation is a morphologically simple but highly variable trait that often has adaptive significance. It has served extensively as a model for ...

L'obiettivo generale di questa metodologia è quantificare rapidamente la pigmentazione addominale nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia evolutiva, come l'identificazione dei loci genetici che sottendono la variazione morfologica specifica per il fenotipo e la comprensione dello sviluppo e dell'evoluzione dei fenotipi morfologici. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente agli utenti di misurare in modo non distruttivo diversi aspetti della pigmentazione addominale, inclusa l'estensione e l'intensità della pigmentazione.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster, può essere applicato anche ad altre specie di Drosophila e facilmente adattato per misurare i modelli di pigmentazione in altri insetti e taxa animali. Prima dell'acquisizione delle immagini, le mosche possono essere conservate in etanolo al 70% per mantenere la loro pigmentazione. Per la visualizzazione è necessario un supporto per il montaggio.Caricare una piastra di Petri da 60 millimetri con circa 10 millilitri di agar al 1,25% in acqua. Sotto

quantifying-abdominal-pigmentation-in-drosophila-melanogaster

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JoVE Journal

Genetics

Genetica

Drosophila pupa Addome Immunoistochimica

Variazione fenotipica per i tratti può derivare da mutazioni in cis-regolamentazione elemento (CRE) sequenze che i modelli di espressione genica di controllo. Metodi derivati ​​per l'utilizzo in Drosophila melanogaster possono confrontare quantitativamente i livelli di modelli spaziali e temporali di espressione genica mediata da modificato o naturale varianti CRE.

Confronto quantitativo di Cis-Regulatory Element (CRE) Attività in transgenici Drosophila melanogaster</em

Protocolli per la gestione temporanea di pupal periodi e misurazione della pigmentazione ala della Drosophila guttifera sono descritti. Staging e quantificazione della pigmentazione forniscono una solida base per lo studio di meccanismi di tratti di adulti e consentire interspecifico confronto tra lo sviluppo del tratto.

Metodi per la gestione temporanea Pupal periodi e misura di ala pigmentazione della Drosophila guttifera

La drosophila è un modello sperimentale ampiamente utilizzato adatto per lo screening di farmaci con potenziali applicazioni per la terapia del cancro. Qui, descriviamo l'uso di fenotipi di colore degli occhi variati della Drosophila come metodo per lo screening di composti di piccole molecole che promuovono la formazione di eterocromatina.

Un metodo di screening per l'identificazione di farmaci che promuovono l'eterocromatina utilizzando la drosophila

La poliploidizzazione indotta dalla ferita è una strategia di riparazione dei tessuti conservata in cui le cellule crescono di dimensioni invece di dividersi per compensare la perdita cellulare. Ecco un protocollo dettagliato su come utilizzare il moscerini della frutta come modello per misurare lo stratagemma e la sua regolazione genetica nella riparazione delle ferite epiteliali.

Un modello di Drosophila per studiare la poliploidizzazione indotta dalle ferite

I regolatori delle funzioni dei melanociti governano le differenze visibili nel risultato della pigmentazione. Decifrare la funzione molecolare del gene candidato della pigmentazione rappresenta una sfida. Qui, dimostriamo l'uso di un sistema modello di zebrafish per identificare i candidati e classificarli in regolatori del contenuto di melanina e del numero di melanociti.

Approccio genetico inverso per identificare i regolatori della pigmentazione usando il pesce zebra

Qui, vengono descritti metodi non invasivi per la localizzazione delle proteine di membrana dei fotorecettori e la valutazione della degenerazione retinica nell'occhio composto Drosophila utilizzando la fluorescenza eGFP.

Studio del traffico proteico di membrana nelle cellule fotorecettrici di Drosophila utilizzando proteine con tag eGFP

Presentiamo un protocollo per caratterizzare elettrofisiologicamente i fotopigmenti bistabili: (i) sfruttando gli spostamenti di carica all'interno delle molecole di fotopigmento a seguito dell'assorbimento dei fotoni e la loro enorme quantità nei fotorecettori, e (ii) sfruttando le differenze assorbimento-spettri degli stati di fotopigmento di rodopsina e metarodopsina. Questi protocolli sono utili per lo screening delle mutazioni che interessano i sistemi fotopigmenti bi-stabili.

Metodi elettrofisiologici per misurare i livelli di fotopigmento nei fotorecettori di Drosophila

Il sistema oculare Drosophila è uno strumento utile per studiare vari processi biologici, in particolare le malattie neurodegenerative umane. Tuttavia, la quantificazione manuale dei fenotipi dell'occhio ruvido può essere distorta e inaffidabile. Qui descriviamo un metodo con cui ilastik e Flynotyper vengono utilizzati per quantificare il fenotipo dell'occhio in modo imparziale.

Quantificazione dei fenotipi oculari di Drosophila melanogaster : un approccio computazionale che integra ilastik e Flynotyper

Qui, presentiamo un flusso di lavoro rapido e a basso costo per l'imaging ad alta risoluzione degli occhi adulti di Drosophila per quantificare il patterning e i difetti di crescita. Descriviamo il nostro protocollo per la preparazione dei campioni mediante montaggio su punti, acquisizione di immagini ad alta risoluzione e analisi delle immagini.

Un flusso di lavoro rapido e semplice per la quantificazione delle strutture esterne di Drosophila adulta

Scopri un metodo rapido per quantificare la pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster tramite analisi digitale delle immagini. Questa tecnica non distruttiva consente di studiare la biologia evolutiva con precisione.

Quantificazione della pigmentazione addominale in

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