Quantificazione della pigmentazione addominale in Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di quantificare rapidamente la pigmentazione addominale nel moscerino della frutta Drosophila melanogaster. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia evoluzionistica, come l'identificazione dei loci genetici che sono alla base della morfologia della variazione specifica del trust e la comprensione dello sviluppo e dell'evoluzione dei fenotipi morfologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente agli utenti di misurare in modo non distruttivo vari aspetti della pigmentazione addominale, tra cui la diffusione e la profondità della pigmentazione.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla pigmentazione addominale di Drosophila melanogaster, può essere applicato anche ad altre specie di Drosophila e facilmente adattato per misurare i modelli di pigmentazione in altri insetti e taxa animali. Prima dell'imaging, le mosche possono essere conservate in etanolo al 70% per mantenere la loro pigmentazione. La visualizzazione richiede un pad di montaggio.

Caricare in acqua una piastra di Petri da 60 millimetri con circa 10 millilitri di agar all'1,25%. Al microscopio, usa una pinza fine per scavare una trincea lunga 20 millimetri, larga due millimetri e profonda un millimetro nel gel. Diverse trincee possono essere realizzate in un piatto.

Quindi incorporare le mosche nella trincea con la superficie per l'analisi che si trova appena sopra la superficie del gel. In questo caso, il lato dorsale è interessante. Ora, riempi il piatto con il 70% di etanolo fino a quando le mosche non sono completamente sommerse.

Questo riduce i riflessi sulla cuticola che possono oscurare il modello di pigmentazione. Ora, avvia il software di imaging e la fotocamera digitale collegata al microscopio. Per una fonte di luce, la luce fredda proveniente da un dispositivo a doppio collo d'oca è abbondante.

Nel software di analisi delle immagini, impostare il tipo di immagine su 8 bit. Quindi, nel software di acquisizione delle immagini, attivare l'impostazione Live per aprire una finestra di visualizzazione della fotocamera. Impostate il tipo di immagine su Scala di grigi.

Ora, impostate la sorgente luminosa alla massima intensità e posizionate le luci a circa 120 millimetri dal palco. Impostare il microscopio su un ingrandimento di 60 volte in modo che il campo visivo sia largo tre millimetri. Quindi posizionare il micrometro da due millimetri nel campo visivo e mettere a fuoco su di esso.

Tornando al software, regolare il tempo di esposizione per visualizzare il micrometro utilizzando il campo che si trova nella casella di esposizione. Quindi imposta la scala. Apri lo strumento linea retta e disegna la lunghezza di due millimetri lungo il micrometro del tavolino.

Quindi inserisci quella lunghezza sotto l'opzione Imposta scala. La finestra dovrebbe quindi visualizzare la scala in pixel per micron. Prendere nota della scala e dare l'OK alle regolazioni.

A questo punto, tornare al software di acquisizione delle immagini e utilizzare i comandi Stop e Snap per acquisire un'immagine del micrometro da tavolino. Quindi torna al software di analisi delle immagini e salva l'immagine come file Tiff. Ora, concentrati sulla linea mediana dorsale di una mosca montata.

La linea mediana deve essere posizionata verso l'alto per ottenere i migliori risultati di imaging. Scostare le ali e qualsiasi altra struttura sporgente e regolare l'illuminazione per illuminare al meglio la cuticola. Quindi, imposta l'esposizione nel software di acquisizione delle immagini utilizzando l'istogramma del valore dei pixel come guida per catturare l'intera gamma di pixel dell'immagine senza saturazione, massimizzando così il contrasto.

Mantieni questa esposizione e illuminazione per tutta la durata dell'esperimento. Ora, prima di catturare un'immagine, assicurati che i segmenti addominali di interesse siano in vista. Quindi acquisisci un'immagine e salva l'immagine con il numero ID del campione nel nome del file.

Utilizzare il formato descritto nel protocollo scritto. Questa analisi si avvale di una macro fornita dagli autori. Le serie di immagini da analizzare devono essere tutte contenute nella stessa cartella di file.

Ora, avvia la macro e segui i comandi richiesti. Innanzitutto, identifica la posizione dei file archiviati. Quindi identificare la posizione in cui devono essere archiviati i dati dell'analisi.

Quindi, inserisci il numero di caratteri utilizzati nei nomi dei file in modo che il software legga correttamente la serie di immagini. Il prompt successivo è per la larghezza della regione di interesse. Qui, inserisci il numero di pixel lungo la striscia antero-posteriore che deve essere analizzato.

Ora, al prompt, fai la scelta di analizzare la prima immagine della serie. Le altre opzioni sono l'analisi dell'immagine successiva nella serie o l'uscita dall'analisi. Lo strumento linea viene selezionato automaticamente.

Usalo per identificare la linea mediana sull'immagine tracciando una linea lungo di essa nella direzione anteriore e posteriore. Quindi, segui le istruzioni macro per identificare il bordo posteriore di Tergite4 utilizzando lo strumento linea. Lo strumento linea è disponibile per tracciare la linea dal bordo posteriore della linea mediana al bordo laterale destro in modo che il centro della linea sia appena posteriore al bordo posteriore della banda di pigmento.

Quindi definisci il bordo anteriore di Tergite4 utilizzando lo strumento linea. Disegna una linea dal bordo anteriore della linea mediana al bordo laterale destro. Il centro della linea definita da un quadrato bianco dovrebbe trovarsi sul bordo anteriore della cuticola leggermente pigmentata.

Con queste informazioni, la macro genera ora un profilo di pigmentazione. Tuttavia, il profilo potrebbe essere impreciso se setole o altre imperfezioni attraversano la striscia lungo la quale viene misurato il profilo. Per correggere questo problema, selezionare l'anteprima dal vivo nella finestra dell'istogramma e regolare la linea in modo che il profilo sia uniforme.

Affinché la striscia di analisi dell'immagine catturi con precisione i vari aspetti della pigmentazione, è fondamentale identificare una regione di analisi che abbia un rumore minimo causato da irregolarità dell'immagine o del campione. Ora procedi ad analizzare Tergite3 nella stessa immagine per poi passare all'immagine successiva. La procedura descritta è stata utilizzata per esplorare un cambiamento noto nella pigmentazione addominale causato dalla temperatura di allevamento.

Il terzo e il quarto tergite sono stati esaminati più volte sotto varie luci ed esposizioni. Sono stati esplorati vari aspetti della pigmentazione. E in particolare, è stato riscontrato che le bande di pigmentazione erano più larghe quando le mosche venivano allevate a temperature più fresche.

I valori calcolati sono stati poi confrontati con le misure soggettive generali effettuate sulle stesse mosche da cinque diversi osservatori. Nella valutazione di 45 mosche femmine, la classificazione media osservata della larghezza della quarta fascia di pigmentazione addominale era strettamente correlata con la misurazione automatizzata della macro. La stessa banda di pigmentazione è stata misurata manualmente utilizzando un software di imaging.

Questi risultati sono stati anche fortemente correlati con le misurazioni generate utilizzando la macro. Il software è stato quindi testato per misurare la pigmentazione nelle femmine di mutanti di ebano, che sono ben note per avere un aumento della pigmentazione nella terza e quarta banda di pigmento. Il metodo è stato utilizzato anche per misurare la quinta e la sesta banda addominale di femmine di tipo selvatico.

La tecnica automatizzata ha sempre fornito utili misurazioni della densità del pigmento e della dimensione della banda. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come quantificare rapidamente e con precisione la pigmentazione addominale nella Drosophila. La padronanza della tecnica richiede principalmente l'uso in profondità del forcipe.

Una volta padroneggiata, la parte di imaging di questa tecnica può essere eseguita a una velocità di 50 campioni all'ora. L'estrazione delle misure di pigmentazione da queste immagini può essere eseguita a un ritmo di 70 immagini all'ora.