Name: Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dellinsulina in In vitro Myotubes primario umano coltivato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri come misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina in miotubi primari umani coltivati in vitro. Questo metodo quantifica gli effetti biologici cellulari in risposta alla stimolazione ormonale.

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Gli autori riconoscono Anne Charrié presso il servizio Radiobiology (ospedale Lyon-Sud) e il Fond National Suisse (FNS) per il loro sostegno finanziario.

1. Preparazione dei mezzi di coltura cellulare e delle soluzioni <ol><li> Preparazione di supporti di coltura <ol><li> Preparare il medium di proliferazione (PM) completando il mezzo F-10 di Ham con glutamina (2 mM), penicillina / streptomicina (5 μg / mL finale), 2% fetale calf serum (FCS) e 2% siero sostituto. </li><li> Preparare il mezzo di differenziazione (DM) integrando Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) con glutamina (2 mM), penicillina / streptomicina (5 μg / mL finale) e 2% FCS. </li></ol></li><li> Preparazione di soluzioni di assorbimento di glucosio Attenzione: La manipolazione del materiale radioattivo è consentita solo da un personale autorizzato in una zona limitata e controllata. Il materiale e gli sprechi devono essere trattati secondo procedure, linee guida e legislazioni locali appropriate. <ol><li> Per preparare la soluzione salina fosforata (X-DPBS) di X-Dulbecco, preparare una soluzione di DPBS contenente 0,2% (w / v) (concentrazione finale)Umina (BSA). Filtrare la soluzione con un filtro da 0,2 μm. Conservare a 4 ° C. </li><li> Per preparare una soluzione fredda di 2-deossi-D-glucosio (2dG), pesare 16,4 mg di 2dG e solubilizzare in 10 mL di acqua distillata per ottenere una soluzione di 10 mM. Conservare a 4 ° C. </li><li> Aggiungere 600 μl di freddo 2dG e 6 μL di radiolabeled [3H] 2dG a 5400 μL di X-DPBS per ottenere la soluzione radiomarcata 2dG (2dG *). NOTA: La concentrazione finale è di 1 mM 2dG e l&#39;etichettatura è 1 μCi / mL. <ol><li> Impostare una aliquota di 20 μl (TC20) di soluzione 2dG * radiomarcato. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione delle miscele di incubazione <ol><li> Per la miscela di citocalasin B aggiungere 2 μL di 20 mM di citocalasin B a 2 ml di soluzione 2dG * radiolabeled. NOTA: La soluzione di base del citocalasin B è a 10 mg / mL in dimetilsolfossido (DMSO). </li><li> Per la miscela DMSO aggiungere 4 μL di DMSO alle restanti 4 mL di soluzione 2dG * radiolabeled. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Cultura di cellule muscolari primarie umane <ol><li> Seminazione di piatti a 6 pozzetti con cellule umane del muscolo cellulare NOTA: utilizzare in-house (vedere il riferimento 24 per i dettagli) o le cellule umane del muscolo umano commercialmente disponibili da una fiala congelata (contenente 250.000 celle). La seguente procedura è fornita per 250.000 celle per ottenere una piastra a 6 pozzetti necessaria per la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio in una sola condizione. <ol><li> Rapidamente scongelare flaconi congelati di preparazioni in-house 24 o preparazioni commerciali di cellule umane del muscolo cellulare in acqua pre-riscaldata (37 ° C) fino a quando rimane solo un piccolo blocco di ghiaccio nella fiala. </li><li> Versare direttamente in un tubo di plastica da 50 ml contenente 10 ml di PM pre-riscaldato (37 ° C). </li><li> Centrifugare per 5 minuti a 500 xg e scartare il surnatante. </li><li> Riposare delicatamente il pellet cellulare con 18 ml di PM pre-riscaldato (per ottenere 42.000 cellule per3 ml di media). Distribuire 3 mL in ogni pozzetto di una piastra a 6 pozzetti (9,6 cm2). NOTA: i sei singoli pozzetti di una piastra sono necessari per eseguire una misura duplicata di assorbimento di glucosio per le seguenti condizioni: inibizione del trasporto passivo (pozzetti 1 e 2), tasso basale (pozzetti 3 e 4) e tasso stimolato da insulina (pozzetti 5 e 6). Ripetere quanti piatti a sei pozzetti, come sono necessari trattamenti distinti. </li><li> Incubare in condizioni di coltura standard (37 ° C, 5% CO 2 ) fino a quando le cellule raggiungono la confluenza del 90%. NOTA: Questo passaggio richiede tra 48 e 72 h a seconda del batch della cella. Non cambia mezzo durante questo passaggio. </li></ol></li><li> Differenziazione delle cellule muscolari <ol><li> Rimuovere PM (dopo 48-72 h) e sostituire con DM pre-riscaldato (3 mL per pozzetto). Incubare a 37 ° C, 5% CO 2 . NOTA: La differenziazione richiede cinque giorni per raggiungere uno stato stabile dove le celle sono allineate e polinucleate. Tipicamente, il primarioI miotubi vengono coltivati ​​in un mezzo di glucosio da 1 g / l. Pertanto, per evitare l&#39;esaurimento del glucosio durante la coltura, riempire la piastra con mezzo di 3 ml per assicurare che in qualsiasi momento sia disponibile il substrato di glucosio sufficiente per le cellule. </li><li> Sostituire il mezzo DM ogni due giorni. NOTA: Da questo punto, i myotubes sono stabili per un massimo di 7 giorni senza alcuna modifica significativa e la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio può essere eseguita in qualsiasi momento. </li></ol></li><li> Trattamento delle cellule muscolari (opzionale) NOTA: i miotubi primari possono essere trattati per diversi giorni per indurre la modifica (test di farmaco, inibitori / attivatori del percorso di segnalazione, ecc. ) Prima della stimolazione dell&#39;insulina e delle misure di assorbimento del glucosio. Le cellule muscolari possono essere sottoposte a qualsiasi trattamento che possa avere un impatto sulla sensibilità all&#39;insulina e la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio quantificerà tale impatto. Ad esempio, l&#39;incubazione delle cellule muscolari con il palmitato acido grasso saturo promuove la resistenza all&#39;insulina e le cellule presentano ridottiNsulin stimolava l&#39;assorbimento di glucosio. <ol><li> Preparare 12 ml di DM completato con 10% BSA (senza acidi grassi) e 0,5 ml di palmitato (PALM). Preparare solo 12 ml di DM completato con 10% BSA (solo acido grasso). </li><li> Preparare due piastre a 6 pozzetti con miotubi primari umani e coltivarli come descritto nelle sezioni 2.1 e 2.2 (con 5 giorni di differenziazione). </li><li> Il giorno 5, lavare ogni pozzetto con 2 ml di PBS. Ad una piastra aggiungere 2 mL di DM contenente PALM. All&#39;altra piastra aggiungere 2 mL di BSA contenente solo DM. </li><li> Incubare per 48 h a 37 ° C, 5% CO 2 . </li></ol></li></ol> 3. Stimolazione dell&#39;insulina <ol><li> Lavare le cellule muscolari differenziate due volte con 2 mL di PBS. </li><li> Rimuovere attentamente PBS e incubare con 3 ml di DM senza FCS per 3 h (37 ° C, 5% CO 2 ) per l&#39;esaurimento del siero. </li><li> Sostituire i supporti in tutti i pozzetti con 3 mL di DM senza FCS. Aggiungere 100 nM insulina ai pozzetti 5 e 6. </li><li> Incubare la cultura umana di myotubes per1 h (37 ° C, 5% CO 2 ). </li></ol> 4. Assorbimento di glucosio <ol><li> Dopo 1 ora di stimolazione dell&#39;insulina, lavare i pozzetti due volte con X-DPBS (1 mL per lavaggio). </li><li> Aggiungere 1 mL di miscela di citocalasin B ai pozzi 1 e 2 e 1 mL di miscela DMSO ai pozzetti 3 - 6. Incubare per 15 minuti (37 ° C, 5% CO 2 ). Al termine dell&#39;incubazione, posizionare immediatamente la lastra sul ghiaccio. </li></ol> 5. Lysis cellulare <ol><li> Lavare le cellule due volte con 1 ml di PBS a ghiaccio freddo. </li><li> Lyse le cellule in ciascun pozzetto con 600 μL di 50 mM NaOH. Incubare su ghiaccio per 5 minuti e mescolare delicatamente con rotazione orbitale lenta. NOTA: Se il lisato è troppo viscoso, diluire fino a 1,5 mL di NaOH. </li><li> Usando una pipetta, risospendere e raccogliere il lisato cellulare. </li></ol> 6. Determinazione del glucosio radioattivato <ol><li> Mettere 400 μl di ciascuna cellula lisata in una fiala di conteggio liquido di scintillazione. Preparare una fiala di controllo negativa con 400ΜL di 50 mM NaOH e un flaconcino di controllo positivo con 20 μL di TC20 (dal punto 1.2.3.1). </li><li> Aggiungere 4 ml di soluzione di scintillazione liquida a ciascuna fiala. Chiudere il tappo e mescolare bene ogni fiala (1-2 s). </li><li> Inserire ciascuna fiala in un contatore di scintillazione liquida e misurare la radioattività secondo le istruzioni del produttore. Conteggio record per min (CPM) per ogni fiala di scintillazione per 10 min. NOTA: CPM = &quot;disintegrazioni al minuto&quot; x &quot;efficienza di conteggio&quot;. </li></ol> 7. Tasso di assorbimento di glucosio <ol><li> Utilizzare il restante lisato (200 μL dalla fase 5.2) per misurare la concentrazione proteica. Determinare la concentrazione proteica di ogni lisi cellulare utilizzando Bradford 25 o un metodo equivalente. Calcolare la quantità totale di proteine ​​(Q) in mg per ogni pozzetto. </li><li> Per ottenere TC1 (il valore per 1 μL di radiodiffusione 2dG *), dividere il valore CPM di TC20 per 20. </li><li> Per ogni fiala, calcolare tTasso di assorbimento di glucosio come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq1.jpg" /> NOTA: R è misurato in pmol / mg / min. Il mezzo di R per i pozzi 1 - 2 fornisce un tasso di trasporto passivo, R p . Il mezzo di R per i pozzi 3-4 fornisce il tasso di trasporto totale basale, R bt . Il mezzo di R per i pozzi 5-6 fornisce il tasso di trasporto totale stimolato dall&#39;insulina, R it . <ol><li> Calcolare il tasso di trasporto attivo basale (R ba ) come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq2.jpg" /></li><li> Calcolare il tasso di trasporto attivo stimolato dall&#39;insulina (R ia ) come segue: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/55743/55743eq3.jpg" /> NOTA: nelle cellule reattive dell&#39;insulina come i myotubes, i tassi di assorbimento del glucosio sono di solito rappresentati da tre valori: R ba , R ia , e la stimolazione di insulina piega come R ia / R ba . </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;assorbimento di glucosio è una misura biologica chiave per l&#39;attivazione di attivatori o inibitori sulla coltura cellulare e su come influenzano l&#39;uso del glucosio e la capacità della cellula di rispondere all&#39;insulina. Il metodo descritto qui è stato dimostrato rapido e affidabile ed è stato ampiamente utilizzato in molti studi utilizzando miotubi primari da soggetti sani e / o pazienti affetti da metabolismo 6 , 7 , <sup class="xre...

Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all&#39;omeostasi del glucosio. Questo tessuto sensibile all&#39;insulina è il sito primario dell&#39;assorbimento di glucosio che è innescato dalla stimolazione insulinica 1 . Nel diabete di tipo 2, la resistenza all&#39;insulina è osservata in diversi tessuti, inclusi i muscoli scheletrici, e conduce alla normale concentrazione di glucosio nel sangue. Pertanto, è di grande importanza determinare il livello di sensibilità all&#39;insulina di questo tessuto e delle sue cellule, se si vuole caratterizzare un difetto di un soggetto o per valutare l&#39;efficacia di un trattamento che intende migliorare. Nei soggetti umani o animali, la tecnica del gold standard per valutare la sensibilità all&#39;insulina è il morsetto iperinsulinemico euglicemico. Introdotto da DeFronzo nel 1979 2 e modificato dal 3 , 4 poi, il metodo permette di quantificare il corpo intero aNd la reattività dell&#39;insulina misurata come il tasso di glucosio da perfezionare sotto la stimolazione dell&#39;insulina per mantenere la concentrazione normale di glucosio nel sangue. L&#39;esplorazione di sensibilità all&#39;insulina può essere eseguita anche a livello cellulare utilizzando modelli muscolari in vitro e la misurazione dei tassi di assorbimento di glucosio rimane uno strumento efficace e affidabile per quantificare la risposta biologica della cellula alla stimolazione insulinica 5 , 6 , 7 . Infatti, la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio quantifica la risposta biologica cellulare alla stimolazione dell&#39;insulina, dal legame dell&#39;insulina al suo recettore alla traslocazione delle vescicole arricchite GLUT4, e che comprende le cascate intracellulari di segnalazione e di fosforilazione 8 . Questo è di grande interesse per i campioni umani, in quanto i miotubi differenziati mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, incluso il metabolismoI disturbi osservati nel paziente 9 , 10 , 11 , 12 . I myotubes mostrano somiglianze strutturali, metaboliche e fenotipiche al muscolo scheletrico 13 , 14 , compresa l&#39;espressione dei trasportatori di glucosio 15 e delle macchine di segnalazione di insulina cellulare 16 . Pertanto, la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio nei miotubi primari è rilevante per caratterizzare il fenotipo muscolare di un donatore, o per indagare l&#39;effetto di un intervento (farmaco, nutrizione o attività fisica) sulla sensibilità dell&#39;insulina nella cellula muscolare. La misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio sui miotubi coltivati ​​è anche uno strumento affidabile quando si eseguono esperimenti che modificano la sensibilità all&#39;insulina 17 , 18 . L&#39; in vitro </Em&gt; è adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero migliorare la reattività all&#39;insulina o potrebbero impedire o invertire la resistenza all&#39;insulina acquisita o indotta dalla 19 , 20 , 21 , 22 , 23 . Qui descriviamo un protocollo dettagliato per coltivare e differenziare i miotubi umani e per misurare i tassi di assorbimento di glucosio cellulare. Il metodo è applicabile a qualsiasi sorgente di cellule umane di precursori muscolari, siano essi provenienti da preparazioni in laboratorio, collaborazioni o fornitori disponibili in commercio. Le linee di cellule muscolari immortalizzate, come C2C12 e L6, rispettivamente dall&#39;origine del topo e del ratto, possono anche essere utilizzate per la misurazione dell&#39;assorbimento di glucosio con questo protocollo 7 . Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi in stati basali e stimolati da insulina usando radiodiffatti [ 3 H] 2dG. TL&#39;uso di un analogo glucosio etichettato consente una accurata determinazione dell&#39;ingresso di glucosio con un materiale di partenza ridotto, una condizione comune quando si lavora con le cellule primarie. La molecola di glucosio modificata non è in grado di entrare nei percorsi metabolici e quindi si accumula all&#39;interno della cellula, consentendo una quantificazione affidabile tramite la radioattività totale della cellula. Le condizioni sperimentali includono l&#39;uso di un inibitore del trasporto di glucosio (citocalasin B) e le misurazioni vengono eseguite con e senza insulina. Questa combinazione permette di determinare le percentuali di ingresso attive del glucosio, nonché il calcolo del cambiamento di piega per l&#39;indice di risposta dell&#39;insulina. Il metodo viene presentato con una dose di insulina durante un solo periodo di incubazione, ma il protocollo può essere facilmente modificato per la risposta alla dose o per gli esperimenti del corso di tempo 12 .

<table><tbody><tr><td>Cellula muscolare primaria umana</td><td>Preparazione in casa da biopsie del muscolo scheletrico umano Preparazione</td><td>in casa da biopsie del muscolo scheletrico umano</td><td>Se non disponibile, utilizzare una fonte commerciale</td></tr><tr><td>Cellula muscolare primaria umana</td><td>Promocell</td><td>C-12530</td><td>Deve essere coltivato con terreno associato C23060 e C23061</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>Corning</td><td>356400</td><td>BioCoat Collagen I Piastre</td></tr> <tr><td>multipozzettoHam's F10</td><td>Dutscher</td><td>L0145-500</td><td>1 g/L di glucosio</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Dutscher</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/streptomicina 100x</td><td>Thermo fisher scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Sostituto del siero UltroserG</td><td>Pall France</td><td>15950.017</td><td>sostituto del siero nel testo</td></tr><tr><td>DMEM basso glucosio</td><td>Dutscher</td><td>L0064-500</td><td>1 g/L di glucosio</td></tr><tr><td>Siero fetale di vitello</td><td>Eurobio</td><td>CVFSVF00-01</td><td></td></tr> Soluzione <tr><td>salina tamponata con fosfato di Dulbecco</td><td>Dutscher</td><td>L0625-500</td><td>contiene mg2+ (0,5 mM) e Ca2+ (0,9 mM)</td></tr><tr><td>Soluzione di insulina umana</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>2-deossi-D-glucosio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6134</td><td></td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>euromedex</td><td>04-100-812-E</td><td></td></tr><tr><td>senza acidi grassi BSA</td><td>Roche</td><td>10,775,835,001</td><td></td></tr><tr><td>palmitato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0500</td><td></td></tr><tr><td>Deossi-D-glucosio, 2-[1,2-3H (N)]</td><td>PerkinElmer</td><td>NET328A001MC</td><td>Attività specifica: 5 - 10 Ci (185-370GBq)/mmol, 1 mCi (37MBq</td></tr><tr><td>Citocalasina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>c2743</td><td></td></tr><tr><td>PICO PRIAS FIALA 6 mL</td><td>PerkinElmer</td><td>6000192</td><td></td></tr><tr><td>ultima gold MW CA&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>6013159</td><td>liquido di scintillazione</td></tr><tr><td>b&ecirc; contatore TA&nbsp;</td><td>PerkinElmer</td><td>2900TR</td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell&#39;insulina in<em&gt; in vitro</em&gt; myotubes primario umano coltivato

Glucose Uptake Measurement and Response to Insulin Stimulation in In Vitro Cultured Human Primary Myotubes

Il muscolo scheletrico è il più grande deposito di glucosio nei mammiferi e contribuisce in gran parte all&#39;omeostasi del glucosio. La valutazione della sensibilità all&#39;insulina delle cellule muscolari è di grande rilevanza per tutti gli studi dedicati all&#39;esplorazione del metabolismo muscolare del glucosio e alla caratterizzazione delle alterazioni metaboliche. Nelle cellule muscolari, le proteine ​​di glucosio trasportatore di tipo 4 (GLUT4) si traslocano alla membrana plasmatica in risposta all&#39;insulina, consentendo così l&#39;immissione massiccia di glucosio nella cellula. La capacità delle cellule muscolari di rispondere all&#39;insulina aumentando il tasso di assorbimento di glucosio è una delle letture standard per quantificare la sensibilità delle cellule muscolari all&#39;insulina. I miotubi primari umani sono un modello in vitro adatto, in quanto le cellule mantengono molte caratteristiche del fenotipo del donatore, compresa la sensibilità all&#39;insulina. Questo modello in vitro è anche adatto per la prova di tutti i composti che potrebbero influenzare la reattività dell&#39;insulina. Riflettere le misurazioni della portata di glucosio in miotubi differenziatiSensibilità all&#39;insulina. In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento di glucosio con e senza stimolazione dell&#39;insulina. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi di trasporto passivi e attivi di glucosio usando [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose ([ 3 H] 2dG radiolabeled). I metodi di calcolo sono forniti per quantificare i tassi attivi basali e insulino-stimolati, nonché la piega di stimolazione.

Il giorno 3, i mioblasti arrivano a confluenza ( Figura 1A ). I myoblasti in questa fase sono tipicamente mononucleati. La media è stata modificata e il giorno 8, la differenziazione è stata completata ( figura 1B ) (protocollo sezione 2). Dopo 5 giorni di differenziazione, i myotubi sono allineati e tipicamente polinucleati. I miotubi primari umani sono stati sottoposti a un trattamento con palmitato o un solo BSA prima della m...

In questo metodo, le cellule muscolari primarie umane vengono coltivate in vitro per ottenere miotubi differenziati e misurati i tassi di assorbimento del glucosio. Forniamo un protocollo dettagliato per quantificare i tassi negli stati basali e stimolati da insulina utilizzando il [ 3 H] 2-deoxy-D-Glucose radiomarcato.

Misurazione e risposta alla somministrazione di glucosio alla stimolazione dell&#39;insulina in<em&gt; In vitro</em&gt; Myotubes primario umano coltivato

Skeletal muscle is the largest glucose deposit in mammals and largely contributes to glucose homeostasis. Assessment of insulin sensitivity of muscle ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'assorbimento di glucosio stimolato dall'insulina in cellule muscolari primarie umane. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo muscolare, come la sensibilità all'insulina delle cellule muscolari. Il principale vantaggio di questa tecnica è che quantifica l'effetto biologico effettivo delle cellule muscolari in risposta alla stimolazione ormonale.Per iniziare l'esperimento, preparare il mezzo di proliferazione, o PM, integrando il mezzo Ham's F-10 con il 2% di siero fetale bovino, o FCS, il 2% di sostituto del siero, 2 millimoli di glutammina e 5 microgrammi per millilitro di penicillina-streptomicina. Preparare un mezzo di differenziazione, o DM, integrando il Dulbecco's Modified Eagle Medium, o DMEM, con il 2% di FCS, 2 millimoli di glutammina e 5 microgrammi per millilitro di penicillina-streptomicina. Per preparare X Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, o XDPBS, preparare una soluzione di DBPS contenente lo 0,2% peso/volume di albumina sierica bovina.Filtrare la soluzione attraverso un filtro da 0,2 micrometri. Successivamente, conservare l'XDPBS a 4 gradi Celsius. Per preparare la soluzione fredda di 2DG, pesare 16,4 milligrammi di 2DG e solubilizzarli in 10 millilitri di acqua distillata per ottenere una soluzione 10 millimolare.Conservare la soluzione a 4 gradi Celsius. Successivamente, aggiungere 600 microlitri di 2DG freddo e 6 microlitri di 2DG radiomarcato a 5.400 microlitri di XDPBS per ottenere la soluzione di 2DG radiomarcato. Mettere da parte un'aliquote di 20 microlitri di soluzione di 2DG radiomarcato.Per la miscela di citocalasina B, aggiungere 2 microlitri di citocalasina B 20 millimolare a 2 millilitri di soluzione di 2DG radiomarcata. Per la miscela di DMSO, aggiungere 4 microlitri di DMSO ai rimanenti 4 millilitri di soluzione di 2DG radiomarcata. Scongelare rapidamente le provette congelate di cellule satelliti muscolari umane in acqua preriscaldata fino a quando nella provetta rimane solo un piccolo grumo di ghiaccio.Successivamente, versare direttamente le cellule in un tubo di plastica da 50 millilitri contenente 10 millilitri di PM preriscaldato. Centrifugare il tubo per cinque minuti a 500 × g. Quindi, eliminare il soprannatante. Aggiungere 18 millilitri di PM preriscaldato al pellet cellulare e risospendere delicatamente le cellule. Distribuire 3 millilitri in ciascun pozzetto di una piastra a sei pozzetti.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per 48-72 ore fino a quando le cellule raggiungono una confluenza del 90%. Dopo 48-72 ore, rimuovere il PM e sostituirlo con 3 millilitri di DM pre-riscaldato per pozzetto. Incubare le cellule in condizioni standard.Sostituire il mezzo DM ogni due giorni. È importante che le cellule muscolari in coltura raggiungano uno stato completamente differenziato per ottenere una risposta ottimale all'insulina, poiché le cellule differenziate mostreranno un'espressione inversa, debole o nulla, della stimolazione insulinica del glucosio. Lavare le cellule muscolari differenziate due volte con 2 millilitri di PBS.Quindi, rimuovere con attenzione il PBS e incubare le cellule in 3 millilitri di DM senza FCS per la deplezione del siero. Successivamente, sostituire il mezzo in tutte le pozzette con 3 millilitri di DM senza FCS. Aggiungere 100 nanomoli di insulina alle pozzette cinque e sei.Quindi, incubare la coltura di miotubi umani. Dopo un'ora di stimolazione con insulina, lavare le pozzette due volte con 1 millilitro di XDPBS. Aggiungere 1 millilitro di miscela di citocalasina B nelle pozzette uno e due e 1 millilitro di miscela di DMSO nelle pozzette da tre a sei.Incubare per 15 minuti a 37 gradi Celsius e 5%CO2. Al termine dell'incubazione, posizionare immediatamente la piastra sul ghiaccio. Lavare le cellule due volte con 1 millilitro di PBS freddo di ghiaccio.Lisare le cellule in ogni pozzetto con 600 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare. Incubare le cellule sul ghiaccio per cinque minuti e mescolarle delicatamente con una lenta rotazione orbitale. Utilizzando una pipetta, risospendere e raccogliere il lisato cellulare.Aggiungere 400 microlitri di ogni lisato cellulare in un vial per conteggio con scintillazione liquida. Preparare un vial di controllo negativo con 400 microlitri di idrossido di sodio 50 millimolare e un vial di controllo positivo con 20 microlitri di TC20. Successivamente, aggiungere 4 millilitri di soluzione per scintillazione liquida in ogni vial.Chiudere il tappo e mescolare accuratamente ogni provetta per uno o due secondi. Inserire ogni provetta in un contatore a scintillazione liquida e misurare la radioattività seguendo le istruzioni del produttore. Registrare i conteggi al minuto per ogni provetta a scintillazione per 10 minuti.Le immagini al microscopio ottico acquisite al terzo giorno rivelano che i mioblasti raggiungono la confluenza e sono tipicamente mononucleati. Dopo il cambio del mezzo e all'ottavo giorno, la differenziazione è completa e i miotubi sono allineati e tipicamente polinucleati. Il tasso di assorbimento del glucosio è stato calcolato nelle condizioni di controllo e di trattamento.L'insulina aumenta in modo significativo il trasporto di glucosio nella condizione con BSA. Quando la risposta delle cellule miotubulari umane all'insulina viene espressa come variazione di fold, è evidente che la risposta all'insulina diminuisce nei miotubi trattati con palmitato. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come studiare la sensibilità all'insulina nelle cellule muscolari mediante la determinazione dei tassi di assorbimento del glucosio.

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Valutazione dell'assorbimento del glucosio nei motoneuroni delle larve di Drosophila con metabolismo del glucosio sovraregolato

L'obiettivo del presente protocollo è quello di misurare l'effetto delle modifiche del glucosio-mediata di respirazione mitocondriale in presenza di composti naturali sulle cellule beta intatto 832/13 utilizzando manometrica ad alta risoluzione.

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Qui, presentiamo omogeneo tempo risolto FRET (HTRF) come un metodo efficace per la rilevazione rapida di insulina secernuta dalle cellule.

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