Personalizzato aghi per microiniezioni nel cervello del roditore

L'obiettivo generale di questa metodologia è quello di perfezionare un protocollo per la microiniezione cerebrale utilizzando un ago di quarzo personalizzato e riutilizzabile che non produca danni tissutali rilevabili e garantisca una consegna affidabile anche nelle regioni profonde. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle neuroscienze, come la fisiopatologia delle malattie neurodegenerative e psichiatriche e gli effetti della terapia genica e cellulare tramite vettori virali e innesti cellulari. Il vantaggio principale è che questi aghi non producono alcun danno tissutale rilevabile, il che garantisce una consegna affidabile nelle regioni profonde del cervello.

Sono convenienti in quanto possono essere puliti e riutilizzati. Per iniziare questa procedura, pulire e sterilizzare i capillari di quarzo mettendoli per cinque minuti in acqua distillata. Cinque minuti in etanolo al 99%, seguiti da cinque minuti in etere etilico.

Lasciare quindi asciugare completamente i capillari sotto la cappa per almeno un'ora. Nel frattempo, prepara i ferri lunghi e sottili utilizzando un estrattore laser. Quindi posizionare gli aghi in una capsula di Petri precedentemente pulita con etanolo al 70%.

Coprite il piatto con una pellicola di plastica di paraffina. Quindi, tagliare i capillari in corrispondenza del micro dissettore. Fissare saldamente l'ago sul tavolo del microscopio e posizionarne la punta al centro dello schermo del computer.

Sulla barra dei menu, fai clic sull'icona della matita e usala per disegnare un segno per l'ago da tagliare. Nella funzione della barra laterale, selezionare la bandierina contenente il pulsante Avvia taglio per consentire al laser di tagliare il punto precedentemente segnato. Se necessario, tagliare i fori laterali tracciando un segno e ripetendo le procedure di taglio senza riposizionare l'ago.

Dopo aver tagliato l'ago, collegarlo a una pompa per vuoti attraverso un tubo di plastica. Quindi, accendere la pompa e impostare manualmente la portata di andata su tre microlitri al minuto. Quindi aspirare l'etanolo al 99% seguito dall'acqua distillata per rimuovere le impurità dovute al taglio.

Successivamente, aspirare nuovamente l'etanolo al 99% per facilitare l'essiccazione. Successivamente, conservare gli aghi in una capsula di Petri adeguatamente coperta fino al giorno dell'intervento. Per riutilizzare gli aghi, al termine dell'esperimento, pulirli con gli appositi detergenti ed etanolo al 70% per rimuovere la soluzione iniettata ed eventuali residui di tessuto.

Se necessario, questi aghi possono anche essere bolliti in barattoli di vetro dedicati riempiti con acqua distillata. In questo passaggio, selezionare il menu delle impostazioni per calibrare la pompa in base al diametro per volume della siringa per microiniezione. E impostare la portata a 0,3 microlitri al minuto.

Quindi riempire una siringa da 10 millilitri con acqua sterile. E usalo per riempire la siringa per microiniezioni e il kit di parti di assemblaggio per iniezione per la pompa manuale per microniniezione. Successivamente, collegare l'ago al kit della pompa di microiniezione manuale.

Scollegare la siringa da 10 millilitri dalla siringa per microiniezione spingendo lentamente il pistone, in modo da lasciare una goccia d'acqua nella parte superiore della siringa per microiniezione. Quindi, inserire il pistone nella siringa per microiniezione. Ora, collega la siringa per microiniezione alla pompa e imposta la portata a 0,3 microlitri al minuto.

Successivamente, modificare la portata a 0,1 microlitri al minuto e avviare la procedura chirurgica. Per eseguire l'intervento, radere la testa dell'animale e pulirla con una salvietta imbevuta di alcol. Quindi, posiziona il ratto nel fotogramma stereotassico.

Fai un taglio longitudinale sul cranio usando un bisturi sterilizzato. Sii delicato per evitare sanguinamenti eccessivi. Successivamente, apri il cuoio capelluto con una spatola piatta e applica clip chirurgiche sui lembi della pelle per mantenerla aperta.

Molto delicatamente, staccare il periostio per esporre il bregma e l'area del cranio attraverso la quale verrà inserito l'ago. Successivamente, montare il braccio sul telaio stereotassico e spostare la punta dell'ago proprio sopra il bregma, facendo attenzione a non romperne la punta. Annotare le coordinate laterali anteroposteriore e mediale del bregma e spostare l'ago alle coordinate desiderate.

Quindi, abbassa l'ago fino a quando la sua punta tocca quasi il cranio, segnando il punto di perforazione dopo aver sollevato un po' il braccio stereotassico. Forare il cranio nel punto segnato, facendo attenzione a non danneggiare le meningi e il cervello. Quindi, taglia un piccolo pezzo di pellicola di paraffina di plastica e posizionalo sul cranio.

Utilizzando la pipetta da 10 microlitri, fare una goccia della soluzione da applicare sul film plastico di paraffina. Arrestare la pompa, recuperare leggermente lo spintore della pompa e creare una piccola bolla d'aria nel capillare tirando delicatamente il pistone della siringa per microiniezione. Abbassare la punta dell'ago fino a raggiungere la goccia.

Prelevare il campione tirando molto lentamente il pistone della siringa per microiniezione, evitando la formazione di bolle. Sostituire lo spingipompa a contatto con il pistone e accendere la pompa ad una portata di 0,3 microlitri al minuto. Quindi, attendi la formazione di una goccia prima di procedere al passaggio successivo.

Successivamente, abbassare il flusso a 0,1 microlitri al minuto. Intacca la dura madre con un ago a punta smussata in acciaio inossidabile e abbassa lentamente l'ago per entrare nel tessuto cerebrale. Quando viene raggiunta la posizione desiderata, scendere di altri 0,1 millimetri, quindi arrestare la pompa.

Sollevare il braccio stereostatico di 0,1 millimetri e riavviare la pompa a 0,3 microlitri al minuto. Successivamente, avviare il timer e l'iniezione. Monitorare il movimento della bolla durante l'iniezione.

Al termine, arrestare la pompa e attendere cinque minuti prima di recuperare lentamente l'ago. Quando l'ago di quarzo è completamente estratto, riavviare la pompa e verificare la formazione di una goccia sulla punta dell'ago. Quindi, sigilla l'apertura nella superficie del cranio con cera ossea.

Rimuovere le clip omeostatiche e suturare il cuoio capelluto. Rivestire l'area intorno alla ferita con una crema antibiotica e riportare l'animale nella gabbia di casa. Queste sono le sezioni coronali di otto micrometri del cervello di ratto a livello dello striato.

Questa immagine mostra i danni prodotti dall'iniezione di due microlitri di ACSF, utilizzando un ago in acciaio inossidabile con estremità smussata calibro 26. Al contrario, lo striato iniettato con un ago di quarzo, non ha mostrato alcun danno rilevabile. Queste altre immagini mostrano i danni indotti dai due aghi a livello dell'ippocampo dorsale.

Ma l'ago di quarzo non ha prodotto alcun danno rilevabile. Il successo delle iniezioni con entrambi gli aghi è stato dimostrato dalla distribuzione del blu di tripano. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in due ore, se eseguita correttamente.

Seguendo queste procedure, tutto ciò che contava, come ulteriori interventi chirurgici, può essere eseguito per rispondere a diverse domande come l'effetto indotto dal farmaco. Dopo questo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle neuroscienze per esplorare l'effetto delle tossine e dei farmaci e, più recentemente, dei prodotti di terapia genica e cellulare in modelli animali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire microiniezioni in regioni cerebrali più profonde senza lesioni rilevabili utilizzando aghi di quarzo personalizzati.

Non dimenticare che l'uso di reagenti e/o agenti patogeni sezionati al laser può essere estremamente pericoloso. E precauzioni come le procedure di sicurezza laser e i dispositivi di protezione individuale devono essere sempre prese quando si esegue questa procedura.