Name: Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-13T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Impara la tecnica di somministrazione subpiale di AAV9 nel midollo spinale di topi adulti per ottenere un'espressione transgenica potente. Questo metodo facilita gli studi sui disturbi neurodegenerativi spinali.

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Questo studio è stato sostenuto dalla sovvenzione della Fondazione SANPORC e ​​ALSA (Martin Marsala); Il Programma Nazionale di Sostenibilità, numero di progetto LO1609 (Ministero della Pubblica Istruzione, Gioventù e Sport); E RVO: 67985904 (Stefan Juhas e Jana Juhasova).

Questi studi sono stati eseguiti con un protocollo approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l&#39;uso degli animali dell&#39;Università della California, San Diego, e sono stati conformi all&#39;Associazione per la valutazione delle linee guida per l&#39;animale da laboratorio per l&#39;uso degli animali. Tutti gli studi sono stati eseguiti in modo da ridurre al minimo le dimensioni del gruppo e le sofferenze degli animali. 1. Preparazione generale degli animali e chirurgici <ol><li> Prima di iniziare la procedura chirurgica, scongelare il virus (AAV9-UBI-GFP; 5 μL aliquote) 8 . Preparare una soluzione al 5% di dextran (10.000 MW) mescolando la polvere di dextran in acqua distillata. Mescolare la soluzione di virus con soluzione al 5% di dextran 1: 1 ad una concentrazione finale di dextran del 2,5%. <ol><li> Conservare la soluzione di virus sul ghiaccio (4 ° C). </li></ol></li><li> Usi i topi adulti C57BL / 6J (maschio e femmina, 20-30 g). Anestetizzare i topi usando 5% isoflurano (in O 2 , 1 L / min) e mantenerli a 2-3% isoflurano inalato (in O 2 , 1 L / min) con il cono del naso durante l&#39;intervento chirurgico, a seconda della frequenza respiratoria e della risposta a pizzicotto. </li><li> Bagnare la parte posteriore degli animali con tagliatori da barba e pulire la pelle con 2% di clorexidina. </li><li> Negli studi di recupero cronico seguire una stretta tecnica sterile. </li><li> Se si devono eseguire iniezioni subaliali lombari, tagliare la pelle sovrapponendo le vertebre Th8-L1 con un bisturi e staccare il muscolo paravertebrale dalle vertebre spinale Th10-12 usando le forbici. <ol><li> Montare l&#39;animale in un telaio stereotatico standard usando i morsetti spinali del mouse. </li><li> Rasare entrambi i lati della lamina delle vertebre Th10-12 usando un trapano dentale (bit di trapano: 0,9 mm, velocità: 20.000 giri / min) finché non appaiono crepe. </li><li> Rimuovere i frammenti ossei crepati con le pinze e esporre la superficie dorsale del midollo spinale lombare. </li><li> Tagliare la dura circa 1 cm utilizzando un ago in acciaio inossidabile da 30 G e pinze. </li></ol></li><li><sTrong&gt; Se si devono eseguire iniezioni subpiali cervicali, incidere la pelle del collo dorsale 1,5-2 cm utilizzando forbici ed esporre i segmenti C1-C2. <ol><li> Rimuovere la membrana atlanto-occipitale della cisterna magna usando un ago e pinze in acciaio inox 23G. </li><li> Pulire il sito di incisione di qualsiasi tessuto e residui di ossa utilizzando tamponi di cotone. </li><li> Tagliare il duro circa 2-3 mm utilizzando un ago in acciaio inossidabile da 30 G e pinze. </li></ol></li></ol> 2. Apertura della membrana pialla e inserimento dell&#39;ago secondario per la consegna AAV9 <ol><li> Montare l&#39;ago penetrante 34 g nel braccio Z di un manipolatore XYZ usando un porta-capillare in vetro ( Figura 1A e B ). NOTA: Per produrre l&#39;ago penetrante, la punta smussata originale dell&#39;ago 34G viene affilata usando un piattello capillare in vetro con piastra abrasiva diamantata - grossolani (da 5,0 a 50 μm) e angolo di macinazione15 - 20 °. La punta dell&#39;ago (lunghezza da 1 mm, misurata dalla punta) è quindi leggermente piegata a circa 90 ° ( figura 1B , inserto sinistro). </li><li> Utilizzando un campo di dissezione chirurgico, impostato su 8-10 ingrandimenti X, penetrare nel pia con l&#39;ago penetrante da circa 1 mm ( figura 1C ) usando il braccio X. <ol><li> Tenere l&#39;angolo dell&#39;ago penetrante alla superficie del tessuto a 5-10 °. </li></ol></li><li> Dopo l&#39;apertura del piede, rimuovere l&#39;ago penetrante orizzontalmente dallo spazio subpiale ( Figura 1 D) utilizzando il braccio X. NOTA: Ricorda il sito penetrato da un punto di riferimento, come un vaso sanguigno. </li><li> Caricare un ago iniettabile a 36G con il virus AAV9-UBI-GFP usando una microsiringa da 50 μl connessa all&#39;ago iniettore con tubi PE-10 o PE-20. </li><li> Montare l&#39;ago nel braccio Z di un secondo manipolatore XYZ ( Figura 1A </stroNg&gt; e B ) utilizzando un supporto capillare in vetro ( figura 1B , inserimento destro). NOTA: Per produrre l&#39;ago ad iniezione subpiale AAV9, la punta aperta di un ago da 36 G viene lucidata utilizzando un piattello capillare in vetro con piastra abrasiva diamanti - grossi (da 5,0 a 50 μm) per rimuovere i bordi taglienti. La punta dell&#39;ago (lunghezza da 2-3 mm, misurata dalla punta) viene quindi dolcemente piegata a circa 90 °. Gli aghi di iniezione penetranti e subpiali vengono inseriti in tubi in acciaio inossidabile da 20 g di 20 cm di lunghezza 1-2 cm (10 mm dalla fine dell&#39;ago) e incollati con epossidica. L&#39;impiego di tubi da 20 G (diametro 0,91 mm) è necessario per un fissaggio sicuro al porta capillare in vetro. </li><li> Maneggiando i bracci X, Y e Z del secondo manipolatore, posizionare la punta dell&#39;ago iniezione AAV9 nel sito penetrato dal piombo e quindi avanzare di circa 2-3 mm nello spazio subpiale attraverso la precedente apertura della membrana del piolo utilizzando il X-braccio( Figura 1E e F ). NOTA: 1) L&#39;AAV9-UBI-GFP è preparato secondo protocolli precedentemente riportati 9, 10, ei titoli finali vengono regolati a 1,2 x 10 13 copie di genoma per ml (GC / mL). 2) Non è necessario segnare il sito dell&#39;apertura del piolo perché è facilmente identificabile ( Figura 1D ). </li><li> Iniettare l&#39;AAV9-UBI-GFP (1,5, 3 o 5 μL) nello spazio subpiale usando una microsiringa da 50 μL (vedere tabella 1 per gruppi sperimentali). </li><li> Rimuovere l&#39;ago di iniezione dallo spazio subpiale dopo che l&#39;iniezione AAV9-UBI-GFP è completa. </li><li> Chiudere il muscolo e la pelle usando la sutura monofilamento 4,0 e le clip chirurgiche. NOTA: Non è necessario sigillare la vertebra aperta. </li><li> Lasciare riposare gli animali su un tappetino. </li><li> Per il controllo del dolore iniettare Buprenorfina 0,05 mg / kg / sc ogni 12 ore per2-3 giorni dopo la chirurgia. </li></ol> 3. Fusione di perfusione, Cryoprotection del tessuto e colorazione dell&#39;immunofluorescenza <ol><li> A un punto di tempo predeterminato dopo le iniezioni subpial AAV9, profondamente anestetizzano i topi con soluzione di eutanasia (vedere la tabella dei materiali , 0,3 ml) e li perfusione transcardialmente con 20 ml di salina eparinizzata seguita da 20 ml di 4% di paraformaldeide in PBS. </li><li> Disseccare i cavi e i cervelli spinali usando un osso rungare e post-fissarli in 4% di formaldeide in PBS durante la notte a 4 ° C. </li><li> Cryoprotect le corde spinali e il cervello con 30% di saccarosio in PBS per un minimo di 5-7 giorni. </li><li> Tagliare le sezioni congelate coronali, trasversali o longitudinali / orizzontali (30 μm di spessore) su un criostato e memorizzarle in PBS a 4 ° C. </li></ol> 4. La colorazione immunofluorescenza delle sezioni del cavo spinale e del cervello (vedi tabella dei materiali) <ol><li> Incubare le sezioni galleggianti libere in primariaY anticorpi durante la notte. </li><li> Dopo l&#39;incubazione con anticorpi primari, lavare le sezioni tre volte in PBS e incubare con anticorpi anti-coniglio, anti-pollo d&#39;asino e asina anti-capra. </li><li> Montare le sezioni sulle diapositive a microscopio, asciugarle a temperatura ambiente e coprirle con un mezzo antifumo. </li><li> Cattura immagini utilizzando microscopio a fluorescenza epifluorescenza (obiettivi: 10X, NA-0.3; 20X, NA-0.8; e 63X, NA-1.4). </li></ol>

<ol><li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravascular+AAV9+preferentially+targets+neonatal+neurons+and+adult+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Intravascular AAV9 preferentially targets neonatal neurons and adult astrocytes.</a> Nat Biotechnol. 27 (1), 59-65 (2009).</li>
<li>Duque, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+administration+of+self-complementary+AAV9+enables+transgene+delivery+to+adult+motor+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Intravenous administration of self-complementary AAV9 enables transgene delivery to adult motor neurons.</a> Mol Ther. 17 (7), 1187-1196 (2009).</li>
<li>Gray, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+differences+of+intravascular+AAV9+delivery+to+neurons+and+glia%3A+a+comparative+study+of+adult+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Preclinical differences of intravascular AAV9 delivery to neurons and glia: a comparative study of adult mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 19 (6), 1058-1069 (2011).</li>
<li>Meyer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+single+injection+CSF+delivery+of+AAV9-mediated+gene+therapy+for+SMA%3A+a+dose-response+study+in+mice+and+nonhuman+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Improving single injection CSF delivery of AAV9-mediated gene therapy for SMA: a dose-response study in mice and nonhuman primates.</a> Mol Ther. 23 (3), 477-487 (2015).</li>
<li>Foust, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+AAV9-mediated+suppression+of+mutant+SOD1+slows+disease+progression+and+extends+survival+in+models+of+inherited+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Therapeutic AAV9-mediated suppression of mutant SOD1 slows disease progression and extends survival in models of inherited ALS.</a> Mol Ther. 21 (12), 2148-2159 (2013).</li>
<li>Passini, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+fidelity+of+intrathecal+delivery+of+self-complementary+AAV9-survival+motor+neuron+1+for+spinal+muscular+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Translational fidelity of intrathecal delivery of self-complementary AAV9-survival motor neuron 1 for spinal muscular atrophy.</a> Hum Gene Ther. 25 (7), 619-630 (2014).</li>
<li>Bell, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motor+neuron+transduction+after+intracisternal+delivery+of+AAV9+in+a+cynomolgus+macaque%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Motor neuron transduction after intracisternal delivery of AAV9 in a cynomolgus macaque.</a> Hum Gene Ther Methods. 26 (2), 43-44 (2015).</li>
<li>Miyanohara, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+spinal+parenchymal+AAV9-mediated+gene+delivery+by+subpial+injection+in+adult+rats+and+pigs%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Potent spinal parenchymal AAV9-mediated gene delivery by subpial injection in adult rats and pigs.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 3, 16046(2016).</li>
<li>Xu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+gene+knockdown+in+rat+dorsal+root+ganglia+mediated+by+self-complementary+adeno-associated+virus+serotype+5+following+intrathecal+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">In vivo gene knockdown in rat dorsal root ganglia mediated by self-complementary adeno-associated virus serotype 5 following intrathecal delivery.</a> PLoS One. 7 (3), 32581(2012).</li>
<li>Xiao, X., Li, J., Samulski, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+high-titer+recombinant+adeno-associated+virus+vectors+in+the+absence+of+helper+adenovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Production of high-titer recombinant adeno-associated virus vectors in the absence of helper adenovirus.</a> J Virol. 72 (3), 2224-2232 (1998).</li>
</ol>

Martin Marsala è co-fondatore di Neurgain Technologies, Inc. (San Diego, USA).

Lo studio in corso descrive una tecnica di somministrazione subpiale (AAV9) in topi adulti. Come dimostrato nel video di accompagnamento, questo approccio e tecnica possono essere utilizzati in modo efficace, a condizione che gli strumenti necessari e l&#39;ago a penetrazione del piombo e dell&#39;iniettore subpiale siano correttamente fabbricati, secondo le specifiche stabilite e testate. Variabili tecniche critiche nell&#39;esecuzione di un&#39;iniezione sottomessa consistente e si...

L&#39;uso di vettori AAV per il trattamento di una varietà di disturbi neurodegenerativi del midollo spinale e del CNS sta diventando una piattaforma ben accolta per aumentare o distogliere in modo efficace l&#39;espressione di gene di interesse. Una delle limitazioni fondamentali per l&#39;utilizzo più efficace di questa tecnologia per trattare i disturbi del midollo spinale è la limitata capacità di fornire vettori AAV al cervello profondo o al parenchima del midollo spinale nei mammiferi adulti. È stato dimostrato, ad esempio, che la somministrazione sistemica di AAV9 nei roditori adulti, nei gatti o nei primati non umani è solo moderatamente efficace nell&#39;indurre l&#39;espressione di transgeni nei neuroni nel cervello e nel midollo spinale 1 , 2 , 3 . Inoltre, è stato dimostrato che l&#39;erogazione intratheca più efficace dei vettori AAV9 porta ad un&#39;espressione limitata di transgeni nelle piscine anatomicamente definite di neuroni. Più in particolare, sono stati demoniLa consegna intratraca AAV9 cisternica o lumbo-sacrale in primati, maiali o roditori non umani porta ad un elevato livello di espressione di transgene nei motonieuronali spinali e nei neuroni gangliari della radice dorsale segmentale. Tuttavia, espressione minima o nessuna espressione di interneuroni spinali o assoni ascendenti o discendenti nella materia bianca è visto 4 , 5 , 6 , 7 . Complessivamente, questi dati mostrano che esiste una barriera biologico-anatomica altamente efficace, che impedisce la diffusione di AAV intrathecalmente erogato in un parenchima spinale più profondo. In uno studio precedente che ha utilizzato ratti e suini adulti, è stata sviluppata una nuova tecnica di somministrazione del vettore subpiale 8 . Utilizzando questo approccio, è stata dimostrata un&#39;espressione di transgene altamente potente e multi-segmentale dopo la somministrazione sub-AAV9 a singolo bolus. L&#39;espressione intensa di GFP è stata osservata in modo coerenteNei neuroni, nelle cellule gliali e negli assi discendenti / ascendenti attraverso i segmenti spinali iniettati. Questo studio ha dimostrato per la prima volta che il pia mater rappresenta la barriera primaria che limita la diffusione efficace AAV9 nel parenchima spinale dallo spazio intrathecale. Mentre questa tecnica sviluppata in precedenza e il dispositivo di iniezione subpiale è relativamente facile da usare in grandi roditori (come ratti) o suini adulti, il sistema non è adatto per l&#39;uso in piccoli animali, ad esempio adulti. A causa dell&#39;elevato numero di modelli di topi transgenici disponibili di una varietà di disturbi neurodegenerativi, esiste una chiara necessità di sviluppare un&#39;efficace tecnica di erogazione del vettore spinale-parenchimale nei topi. La disponibilità di tale tecnica permetterebbe lo studio dell&#39;effetto di silenziamento specifico del gene ( ad esempio, utilizzando shRNA) o upregulation utilizzando cellule non specifiche ( ad es. Citomegalovirus-CMV o Ubiquitina) o cellule-specifiche ( ad es., Synapsin o glial Fibrillare acidoProteine ​​(GFAP)) durante uno sviluppo postnatale precoce o in condizioni malate. Di conseguenza, nel presente studio abbiamo sviluppato e convalidato un sistema di somministrazione subpiale in miniatura che può essere effettivamente utilizzato nei topi adulti. Allo stesso modo, come in precedenti studi su ratti e suini, questo lavoro dimostra un&#39;espressione potente di transgene in tutto il parenchima spinale dopo la somministrazione subpiale AAV9 a singolo bolus nei topi. La semplicità di questo approccio, la buona tollerabilità dei topi iniettati alla consegna subpiale AAV9 e l&#39;alta potenza dell&#39;espressione di transgene nel parenchima spinale suggeriscono che questa tecnica può essere effettivamente implementata in qualsiasi ambiente di laboratorio e utilizzata in esperimenti che mirano all&#39;espressione genica spinale.

<table><tbody><tr><td>C57BL / 6J Topi</td><td>Jackson Labs</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Stereotassico standard da laboratorio per topi</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>72-9568</td><td></td></tr><tr><td>Adattatore spinale per topo</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>72-4811</td><td></td></tr><tr><td>Manipolatore XYZ</td><td>Stoelting</td><td>51604</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per infusione manuale</td><td>Stoelting</td><td>51218</td><td></td></tr><tr><td>34G Ago Nanofill smussato</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF34BV-2</td><td></td></tr><tr><td>36G Ago smussato Nanofill</td><td>World Precision Instruments</td><td>NF-36BL-2</td><td></td></tr><tr><td>Fluriso, Isoflurano</td><td>MWI Alimentazione veterinaria</td><td>502017</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di clorexidina</td><td>MWI Alimentazione veterinaria MWI</td><td>501027</td><td></td></tr><tr><td>20G Ago in acciaio inossidabile</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Ago in acciaio inossidabile 23G</td><td>Becton-Dickinson</td><td>305145</td><td></td></tr><tr><td>Ago in acciaio inossidabile 30G</td><td>Applicatore con punta in cotone Becton-Dickinson</td><td>305128</td><td></td></tr><tr><td></td><td>MWI Veterinary Supply</td><td>27426</td><td></td></tr><tr><td>Smussatore capillare in vetro...</td><td>Narishige International</td><td>SM-25B</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per diapositive Superfrost</td><td>Leica Microsystems</td><td>M80</td><td></td></tr><tr><td>50 &mu; L Microsiringa&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>81242</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-20 Tubi</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>BD Intramedic PE-10 Tubi</td><td>Becton, Dickinson</td><td>427401</td><td></td></tr><tr><td>4-0 sutura monofilamento</td><td>VetOne</td><td>V1D397</td><td></td></tr><tr><td>Smussatore capillare in vetro&nbsp;</td><td>Narishige</td><td>Pipet Micro Grinder EG-40&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>5 min Epossidica (Epossidica trasparente)</td><td>Devcon</td><td>14310</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione per eutanasia</td><td>MWI Fornitura veterinaria</td><td>11168</td><td></td></tr><tr><td>Eparina Inj 1.000 U/mL</td><td>MWI Fornitura veterinaria</td><td>54254</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo</td> <td>anti NeuNEMD-Millipore</td><td>ABN78</td><td>Anticorpo policlonale primario di coniglio, anticorpo 1:1000</td></tr><tr><td>anti-colina acetiltransferasi (CHAT)</td><td>EMD-Millipore</td><td>AB144P</td><td>Anticorpo policlonale primario di capra, 1:100</td></tr><tr><td>anticorpo anti-GFP</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td>Anticorpo policlonale primario di pollo, 1:1000</td></tr><tr><td>anticorpo secondario IgG (H+L) di coniglio d'asino, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A21207</td><td>Anticorpo secondario, 1:1000</td></tr><tr><td>&nbsp; Anticorpo secondario IgG anti-coniglio d'asino, anticorpo secondario Alexa Fluor 680</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A10043</td><td>, anticorpo secondario IgY 1:1000</td></tr><tr><td>asino anti-pollo, anticorpo secondario Alexa Fluor 488</td><td>Jackson Immunoresearch Labs</td><td>703-545-155</td><td>, anticorpo secondario 1:1000</td></tr><tr><td>IgG anti-capra H& L (Alexa Fluor 647</td><td>Abcam</td><td>ab150131</td><td>Anticorpo secondario, 1:1000</td></tr><tr><td>Microscopio per vetrini Superfrost</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio per epifluorescenza</td><td>Zeiss</td><td>Zeiss AxioImager M2</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale a fluorescenza</td><td>Olympus</td><td>Olympus FV1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextran</td><td>Polysciences, Inc</td><td>19411</td><td></td></tr><tr><td>AAV9-UBC-GFP</td><td>UCSD Laboratorio</td><td></td><td></td> di base del vettore virale</tr></tbody></table>

subito adeno associato virus 9 (aav9) consegna vettoriale nei topi adulti

Subpial Adeno-associated Virus 9 (AAV9) Vector Delivery in Adult Mice

Lo sviluppo efficace di una tecnica sub-adenosa associata a virus 9 (AAV9) in ratti e suini adulti è stata riportata in precedenza. Utilizzando cateteri in polietilene (PE-10 o PE-5) posizionati subpiamente per la consegna AAV9, è stata dimostrata un&#39;espressione potente di transgene attraverso il parenchima spinale (materia bianca e grigia) nei segmenti spinali sottomarmente iniettati. A causa della vasta gamma di modelli di topi transgenici delle malattie neurodegenerative, esiste un forte desiderio per lo sviluppo di una tecnica di erogazione del vettore per il sistema nervoso centrale (CNS) potente nei topi adulti. Di conseguenza, il presente studio descrive lo sviluppo di un dispositivo di erogazione del subpiale spinale e la tecnica per consentire una consegna sicura ed efficace della AAV9 spinale in topi adulti C57BL / 6J. Nei topi spinalmente immobilizzati e anestetizzati, il pia mater (livello segmentale spinale 1 e lombare 1-2) è stato inciso con un ago tagliente a 34 G utilizzando un manipolatore XYZ. Un secondo XYZ maIl nipulatore è stato quindi usato per avanzare un ago a punta 36G nello spazio subpiale lombare e / o cervicale. Il vettore AAV9 (3-5 μL; 1,2 x 10 13 copie genomiche (gc)) che codifica la proteina verde fluorescente (GFP) è stato quindi iniettato subpially. Dopo le iniezioni, la funzione neurologica (motoria e sensoriale) è stata valutata periodicamente e gli animali sono stati perfezionati 14 giorni dopo la consegna di AAV9 con 4% di paraformaldeide. L&#39;analisi delle sezioni spinali orizzontali o trasversali ha mostrato un&#39;espressione transgena in tutto il midollo spinale, sia in materia grigia che bianca. Inoltre, l&#39;espressione di GFP mediata retrogradely-mediata è stata osservata negli assoni e nei neuroni del motore discendente nella corteccia del motore, nucleo ruber e formio reticularis. Nessun disfunzione neurologica è stata osservata in tutti gli animali. Questi dati mostrano che la tecnica di somministrazione del vettore subpiale può essere utilizzata con successo in topi adulti, senza causare lesioni del midollo spinale correlate alla procedura ed è associata ad un espresso transgene altamente potenteSione per tutta la neurazzia spinale.

<html> Potente espressione di transgene nei segmenti iniettati Subpially AAV9: L&#39;analisi dell&#39;espressione di transgene (GFP) nelle sezioni del midollo spinale a 14 giorni dopo la somministrazione di AAV9 ha mostrato un&#39;espressione GFP dipendente dalla dose di AAV9 in tutto il parenchima spinale. In primo luogo, due iniezioni bilaterali di 3 μL di AAV9-UBI-GFP iniettate nello spazio subpiale lombare superiore sono state associate all&#39;infezione quasi ...

L&#39;obiettivo del presente studio è stato quello di sviluppare e convalidare la potenza e la sicurezza del recettore genico mediato dal virus 9 associato ad adeno associato a spina (AAV9) utilizzando una nuova tecnica di somministrazione del gene subpiale nei topi adulti.

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

The successful development of a subpial adeno-associated virus 9 (AAV9) vector delivery technique in adult rats and pigs has been reported on previously. ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di somministrazione subpiale di AAV9 è ottenere un'espressione potente del transgene nel parenchima spinale lungo l'intera lunghezza del midollo spinale nei topi adulti. Questo metodo può facilitare studi mirati alla modulazione dell'espressione genica spinale e contribuire a comprendere i meccanismi di diverse patologie neurodegenerative spinali, tra cui la sclerosi laterale amiotrofica, lesioni traumatiche spinali o il dolore cronico. Il principale vantaggio di questa tecnica è che un'espressione del transgene altamente potente viene raggiunta nella sostanza grigia e bianca spinale in più segmenti spinali, adiacenti al segmento in cui è stato iniettato l'AAV9 subpiale.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché il passaggio di apertura della dura madre e il posizionamento dell'ago subpiale sono difficili da apprendere senza una dimostrazione visiva. La procedura sarà dimostrata da Takahiro Tadokoro, un ricercatore post-dottorato del nostro laboratorio. Iniziare anestetizzando correttamente l'animale per l'intervento chirurgico; in questo caso si utilizza isoflurano.Assicurarsi dell'assenza di una risposta alla pressione su

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In questo video, dimostriamo la consegna genica ricombinante basata su virus adeno associati nel cucciolo di topo. Questo metodo aiuta a studiare l'espressione genica nelle cellule bersaglio.

Consegna genica basata su virus associato ad adeno ricombinante: una tecnica per la consegna di transgeni e l'espressione cardiaca-specifica in un modello di roditore

Fonte: Tadokoro, T., et al. Consegna del vettore del virus adeno-associato subpial 9 (AAV9) in topi adulti. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra una tecnica di iniezione subpial per la consegna di geni al midollo spinale nei topi. La procedura prevede l'esposizione della dura madre, la perforazione della pia madre e l'iniezione di un virus adeno-associato ricombinante (rAAV) che trasporta un gene che esprime una proteina fluorescente nello spazio subpiale. Dopo l'iniezione e il recupero, il...

Consegna del gene subpiale nel midollo spinale del topo per valutare l'espressione genica

Fonte: Li, D., et al. Iniezione intratecale diretta di virus adeno-associati ricombinanti in topi adulti. J. Vis. Exp. (2019)Questo video mostra la procedura per l'iniezione intratecale di virus adeno-associati (AAV) nel liquido cerebrospinale (CSF) di un topo sveglio, coprendo la preparazione della siringa, l'allineamento spinale e l'inserimento preciso dell'ago. Questo metodo convalida la somministrazione genica mirata, supportando il suo potenziale per le terapie del SNC.

Somministrazione intratecale di virus in un modello murino per il trattamento delle malattie del sistema nervoso centrale

Fonte:Pourshafie, N., et al. Somministrazione sistemica di microRNA utilizzando il sierotipo 9 del virus adeno-associato ricombinante per il trattamento delle malattie neuromuscolari nei roditori. J. Vis. Exp. (2018).In questo video, un topo affetto da atrofia muscolare spinale e bulbare o affetto da SBMA viene sottoposto a iniezione nella vena caudale di vettori AAV (vettori adeno-associati) ricombinanti che trasportano un microRNA terapeutico codificante un plasmide. Il vettore produce...

Iniezione di vettori adeno-associati ricombinanti in un modello murino di atrofia muscolare spinale e bulbare

Qui descriviamo la consegna del microRNA usando un virus ricombinante adeno-associato sierotipo 9 in un modello murino di una malattia neuromuscolare. Una singola somministrazione periferica nei topi ha provocato la sovraespressione di miRNA sostenuta nel muscolo e motoneuroni, offrendo l'opportunità di studio miRNA funzione e potenziale terapeutico in vivo.

Consegna sistemica di MicroRNA usando ricombinanti Virus Adeno-associato sierotipo 9 per trattare malattie neuromuscolari in roditori

Metodi per una consegna del gene su larga scala del sistema nervoso centrale nel ratto sono coperti. In questo esempio, lo scopo è quello di imitare una malattia che colpisce l'intero midollo spinale. La trasduzione diffusa può essere utilizzata per fornire una proteina terapeutica al SNC da un'amministrazione periferica, una tantum.

Metodi e consigli per la somministrazione endovenosa di Virus Adeno-associato ai ratti e valutazione di trasduzione del sistema nervoso centrale

Qui presentiamo una tecnica di iniezione intratecale diretto utilizzo 1% lidocaina cloridrato in una soluzione virale per garantire una consegna efficiente virus adeno-associato ai piccoli animali e stabilire un sistema di scoring per predire l'efficienza di trasduzione in zona centrale sistema nervoso secondo il grado della debolezza transitoria indotta da lidocaina.

Diretto iniezione intratecale di ricombinanti Virus Adeno-associato in topi adulti

Qui, descriviamo una strategia efficiente e riproducibile per produrre, titolo e batch di controllo di qualità di vettori di virus adeno-associato. Permette all'utente di ottenere una preparazione di vettore con alto-titolo (≥ 1 x 1013 vettoriale genomi/mL) e un'elevata purezza, pronta per l'uso in vitro o in vivo .

Produzione, purificazione e controllo di qualità per i vettori basati su Virus Adeno-associato

Viene descritta una procedura chirurgica per eseguire iniezioni nella cisterna lombare del ratto giovane. Questo approccio è stato utilizzato per la somministrazione intratecale di vettori di terapia genica, ma si prevede che questo approccio possa essere utilizzato per una varietà di terapie, tra cui cellule e farmaci.

Somministrazione intratecale di vettori in ratti giovani tramite iniezione nella cisterna lombare

Qui descriviamo in dettaglio un protocollo ottimizzato per l'iniezione laterale della vena di coda nel topo per somministrare sistemicamente il virus adeno-associato (AAV) nei topi adulti. Inoltre, descriviamo i protocolli dei saggi comunemente usati per valutare la trasduzione di AAV.

Somministrazione costante di virus adeno-associato tramite iniezione laterale della vena di coda in topi adulti

Questo rapporto descrive in dettaglio il metodo di iniezione localizzato dei vettori AAV attraverso la pelvi renale per un trasferimento genico efficace e sicuro nel rene di topo.

Consegna efficace e sicura del gene al rene di topo tramite iniezione lenta retrograda della pelvi renale di vettori virali adeno-associati

Impara la tecnica di somministrazione subpiale di AAV9 nel midollo spinale di topi adulti per ottenere un'espressione transgenica potente. Questo metodo facilita gli studi sui disturbi neurodegenerativi spinali.

Subito Adeno associato Virus 9 (AAV9) Consegna vettoriale nei topi adulti

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