Análise de Microglia e Macropagos derivados de Monócitos do Sistema Nervoso Central por Citometria de Fluxo

O objetivo geral deste experimento é avaliar os vários marcadores expressos por subpopulações de macrófagos no sistema nervoso central ou SNC. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroimunologia, como macrófagos duperry enquanto tentamos fazer tonturas no SNC e quais são os fenótipos do SNC nos macrófagos. As principais vantagens desta técnica são o isolamento de um grande número de subpopulações de macrófagos altamente purificadas, bem como uma contificação de marcadores celulares de subpopulações de macrófagos.

Comece usando uma tesoura fina para cortar a pele ventral logo abaixo do processo xifóide para expor a cavidade torácica. Faça uma incisão no diafragma e corte os aspectos laterais da caixa torácica na direção caudal a rostral para expor o coração. Depois de identificar o ventrículo esquerdo e o átrio direito, insira um cateter borboleta com uma agulha de 25 gauage no ventrículo esquerdo.

Faça uma incisão no átrio direito e comece a profundir 20 mililitros de PBS através do cateter a uma taxa de dez mililitros por minuto assim que o sangue começar a fluir. Uma profusão bem-sucedida será indicada por um branqueamento dos pulmões e do fígado à medida que o sangue é deslocado. Em seguida, use uma tesoura fina para dissecar a coluna vertebral.

Excisão da musculatura da parede abdominal no lado ventral da coluna vertebral e corte da coluna vertebral na base da cauda para remover a coluna vertebral à medida que é colhida. Insira uma seringa de dez mililitros de PBS equipada com uma ponta de pipeta modificada de 200 microlitros no lado lombar da coluna vertebral. Em seguida, lave a medula espinhal no lado cervical.

Remova a pele acima do crânio e insira uma ponta da tesoura na base do crânio. Corte o crânio após a sutura sagital. Em seguida, insira uma pequena pinça no corte e remova suavemente a parte superior do crânio.

Disseque o cérebro da cabeça do camundongo e remova o bulbo olfatório e o cerebelo. Em seguida, coloque o cérebro e a medula espinhal em um tubo de um vírgula e cinco mililitros contendo um vírgula um, dois oito mililitros de coquetel de digestão. Para dissociar as células, use uma tesoura pequena para cortar finamente o cérebro e a medula espinhal em pedaços de um a dois milímetros cúbicos e coloque os pedaços a 37 graus Celsius e cinco por cento de dióxido de carbono por 30 minutos.

No final da incubação, interrompa a digestão com 20 microlitros de EDTA de cinco molares de ponto zero, seguido de trituração suave com uma pipeta de cinco mililitros. Filtre a suspensão celular resultante através de um filtro de malha de 70 mícrons em um tubo cônico de 50 mililitros usando o êmbolo de uma seringa de dez mililitros para macerar suavemente qualquer tecido cerebral ou da medula espinhal restante. Enxágue o filtro com 20 mililitros de cinco por cento de FBS e PBS.

E colete as células filtradas por centrifugação. Em seguida, aspire cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Para a separação do gradiente de densidade das células, suspendemos o pellet com quatro mililitros de meio gradiente de densidade de 30% e transferimos as células para um tubo cônico de 15 mililitros.

Aplique suavemente quatro mililitros de gradiente de densidade média de 37%, seguidos por quatro mililitros de gradiente de densidade média de 70% sob o gradiente de densidade média de 37%. Transfira o tubo para uma centrífuga de bancada para separar as células. As células da micróglia e dos macrófagos estarão na interface das camadas de gradiente de densidade de 70 e 37 por cento.

O tubo aparecerá estratificado. Depois de remover cuidadosamente a camada superior de mielina, transfira três a quatro mililitros da camada interfásica de macrófagos da micróglia para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, lave as células imunes com três centrífugas em 15 mililitros de PBS, ressuspendendo o pellet em um mililitro de PBS após a lavagem final.

Para avaliar a expressão do marcador de subpopulação de macrófagos, transfira as células para um tubo de análise de citometria de fluxo de cinco mililitros, seguido pela adição de um microlitro de reagente de coloração de células mortas fixável. Após 30 minutos no gelo, protegido da luz, lavar as amostras em dois mililitros de PBS e ressuspender o pellet em 400 microlitros de tampão fax por tubo de análise experimental. Dividir as células no número adequado de tubos de análise de citometria de fluxo de cinco mililitros.

Em seguida, bloqueie a ligação não específica do receptor FC com um micrograma de coquetel de anticorpos bloqueadores de CD 16 CD 32 por 100 microlitros de células por uma incubação de 10 a 15 minutos no gelo, protegida da luz. Em seguida, rotule as células com 100 microlitros dos anticorpos primários apropriados, para uma incubação de 30 minutos no gelo, protegida da luz. No final da incubação, lave as células em dois mililitros de PBS quatro vezes.

Em seguida, adicione 100 microlitros dos anticorpos secundários apropriados por 30 minutos no gelo, protegidos da luz, seguidos de quatro lavagens em PBS, conforme demonstrado. Após a última lavagem, ressuspenda suavemente os pellets em 100 microlitros de paraformaldeído a um por cento por 15 minutos em temperatura ambiente, protegido da luz. Em seguida, lave as células quatro vezes em PBS.

Ressuspenda os pellets finais em 200 microlitros de PBS fresco e analise as células por citometria de fluxo. A micróglia derivada do cérebro e da medula espinhal e os macrófagos derivados de monócitos são identificados com base em sua expressão de CD 11 B e CD 45. A expressão de CX3CR1 e Tmem119 pelas células microgliais médias CD 11 B positivas para CD 45 permite que essa população celular seja ainda mais distinguida dos macrófagos derivados de monócitos altos CD 45 CD 11 C positivos, que não expressam nenhum desses marcadores, mas expressam CCR2.

Após a separação do gradiente de densidade, 85 a 95 por cento das células ainda são viáveis. Na ausência de isolamento do gradiente de densidade, as subpopulações de macrófagos não são identificáveis em um gráfico de dispersão bilateral direto, devido à presença de células não macrófagos e detritos de mielina. Como o epítopo reconhecido pelo anticorpo anti-Tmem119 é intracelular, a permeabilização é necessária para a marcação desse importante marcador de células microgliais.

Observe que a permeabilização induz o encolhimento celular, no entanto, fazendo com que as subpopulações de macrófagos pareçam menores pela análise de dispersão direta versus lateral. Uma vez dominada, essa técnica pode ser concluída em cinco horas se for executada corretamente. Embora eu tenha tentado esse procedimento, é importante lembrar de configurar a gradiância da densidade com muito cuidado.

Após este procedimento, outros métodos, como rt-PCR quantitativo, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre as vias de sinalização da subpopulação de macrófagos. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da neurociência explorarem a ativação da subpopulação de macrófagos em modelo de camundongo de doença neurológica. Depois de assistir a este vídeo, você deve realizar testes ou seguir essa tradição como subpopulações de macrófagos por citometria de fluxo.

Não se esqueça de que trabalhar com paraformaldeído pode ser extremamente perigoso e que precauções como o uso de capuz devem sempre ser tomadas durante a execução deste procedimento.