Sistema di integrazione bidirezionale retrovirale Metodo PCR e flusso di lavoro analitico dei dati quantitativi

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare i siti di integrazione del vettore retrovirale nel genoma dell'ospite e quantificare le frequenze relative delle popolazioni di cellule clonali che condividono lo stesso sito di integrazione. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella terapia genica retrovirale, come ad esempio quale parte del vettore del genoma ospite si è integrata, come una cellula geneticamente modificata si ripopolerà dopo il trapianto e come sono funzionalmente diverse. Il vantaggio principale di questa tecnica è che le sequenze del sito di retro-integrazione possono essere analizzate con maggiore accuratezza e sensibilità sequenziando simultaneamente le giunzioni del DNA ospite del vettore a monte e a valle.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla sicurezza dei vettori e delle cellule geneticamente modificate negli studi di terapia genica, può essere applicato anche ad altri studi di biologia di base per studiare il comportamento delle singole cellule in vivo. Il primo passo di questa procedura consiste nel determinare la concentrazione di DNA e il rapporto di assorbanza a 260 e 280 nanometri del DNA genomico da analizzare. Successivamente, diluire uno o due microgrammi del DNA genomico del campione fino a un volume finale di 170 microlitri di soluzione di DNA genomico utilizzando acqua priva di nucleasi.

Preparare una reazione PCR da 200 microlitri mescolando quanto segue in una provetta da microcentrifuga. 2,5 microlitri ciascuno di primer di biotina specifici per HIV-1, o un totale di 10 microlitri per quattro primer specifici per lentivirus, 20 microlitri di tampone DNA polimerasi termostabile 10X, quattro microlitri di dNTP da 10 millimolari, tre microlitri di DNA polimerasi termostabile e 163 microlitri di DNA genomico. Dividere la soluzione in parti uguali in quattro provette per PCR ed eseguire un singolo ciclo di estensione nelle seguenti condizioni.

94 gradi Celsius per 5 minuti, 56 gradi Celsius per 3 minuti, 72 gradi Celsius per 5 minuti e 4 gradi C per la conservazione. Raggruppare tutte e quattro le reazioni PCR in una provetta per microcentrifuga da due millilitri. Seguire la procedura del produttore di un kit di purificazione PCR ed eluire con 50 microlitri di tampone di eluizione.

Prepararsi per una digestione da 100 microlitri aggiungendo quanto segue a una provetta da microcentrifuga: 50 microlitri di DNA, 10 microlitri di tampone A 10X, due microlitri di enzima RSAI e 38 microlitri di acqua priva di nucleasi. Incubare a 37 gradi Celsius in un termociclatore per un'ora.

Quindi, aggiungere un microlitro di enzima CviQI alla reazione e incubare a 25 gradi Celsius per 30 minuti. Quando la digestione RSAI e CviQI è completa, procedere immediatamente con il finale smussato. Preparare una miscela da 4,5 microlitri contenente 2,5 microlitri di DNA polimerasi I, frammento grande e 2 microlitri di dNTP da 10 millimolari.

Trasferire 1 microlitro della miscela nel campione di DNA. Il volume totale sarà di 102 microlitri. Mescolare bene con un vortice e incubare a 25 gradi Celsius per un'ora.

Procedere immediatamente con il legame delle perle di streptavidina quando l'incubazione è completa. Preparare le perle di streptavidina agitando brevemente la soluzione di perle e trasferendo 50 microlitri in una nuova provetta da microcentrifuga da due millilitri. Rimuovere il surnatante utilizzando un supporto magnetico e lavare i chicchi con 200 microlitri di soluzione legante.

Risospendere le perle in 100 microlitri di soluzione legante e posizionare il tubo lontano dal supporto magnetico. Trasferire 100 microlitri di DNA del campione nei 100 microlitri di soluzione di perline risospese e mescolare accuratamente pipettando per evitare la formazione di schiuma della soluzione. Incubare la provetta a temperatura ambiente per 3 ore su una ruota rotante.

Usa il supporto magnetico per catturare le perline e scartare il surnatante. Lavare le perle due volte in 400 microlitri di soluzione di lavaggio e due volte in 400 microlitri di 1X tampone DNA ligasi T4. Risospendere le perle in 200 microlitri di tampone DNA ligasi 1X T4 e posizionarlo lontano dal supporto magnetico.

La legatura del linker deve essere eseguita immediatamente dopo il legame della perlina di streptavidina. Preparare una soluzione di reazione di legatura da 400 microlitri mescolando quanto segue in una provetta da microcentrifuga da due millilitri. 0,5 microlitri del linker del DNA, 10 microlitri del tampone DNA ligasi 10X T4, 20 microlitri del tampone DNA ligasi 5X T4, 5 microlitri della DNA ligasi T4, 164,5 microlitri di acqua priva di nucleasi e 200 microlitri delle perle risospese.

Posizionare il tubo di reazione su una ruota rotante a temperatura ambiente per 3 ore. Lavare le perle due volte con la soluzione di lavaggio e due volte con 1X tampone termostabile di DNA polimerasi. Risospendere le perle in 50 microlitri di tampone PCR 1X termostabile per DNA polimerasi e posizionarlo lontano dal supporto magnetico.

Per iniziare questa procedura, preparare una reazione PCR da 200 microlitri aggiungendo quanto segue alle perle risospese: 10 microlitri di un primer 1L, 10 microlitri di primer 1R, 20 microlitri di primer Link1, 10 microlitri di tampone DNA polimerasi termostabile 10X, quattro microlitri di dNTP da 10 millimolari, otto microlitri di DNA polimerasi termostabile e 88 microlitri di acqua priva di nucleasi. Aliquotare la miscela di reazione in quattro provette per PCR ed eseguire la PCR con le seguenti condizioni.

94 gradi Celsius per 2 minuti, 25 cicli di 94 gradi Celsius per 20 secondi, 56 gradi Celsius per 25 secondi e 72 gradi Celsius per due minuti e un'estensione finale a 72 gradi Celsius per 5 minuti. Raggruppare tutte e quattro le reazioni PCR in una provetta da microcentrifuga da 2 ml. Seguire la procedura del kit di purificazione PCR ed eluire con 50 microlitri di tampone di eluizione.

Determinare la concentrazione di DNA e il rapporto di assorbanza a 260 e 280 nanometri utilizzando uno spettrofotometro UV visibile. Il DNA può ora essere conservato a meno 20 gradi Celsius fino a quando non è pronto per la fase successiva. Poiché le procedure per l'amplificazione specifica della giunzione sinistra e della giunzione destra sono identiche, ad eccezione dei primer utilizzati nella PCR, verrà dimostrata solo l'amplificazione della giunzione sinistra.

Preparare una reazione PCR da 50 microlitri mescolando quanto segue in una provetta PCR. Cinque microlitri di DNA, cinque microlitri di 10 micromolari 2L-primer, cinque microlitri di 10 micromolari primer Link2, 5 microlitri di tampone DNA polimerasi termostabile 10X, un microlitro di 10 dNTP milimolari, due microlitri di DNA polimerasi termostabile e 27 microlitri di acqua priva di nucleasi. Eseguire la PCR con le seguenti condizioni.

94 gradi Celsius per 3 minuti, da 8 a 15 cicli di 94 gradi Celsius per 20 secondi, 56 gradi Celsius per 25 secondi e 72 gradi Celsius per due minuti e un'estensione finale a 72 gradi Celsius per 5 minuti. Utilizzare il kit di purificazione PCR per purificare il DNA ed eluire con 50 microlitri di tampone di eluizione. Determinare la concentrazione di DNA e il rapporto di assorbanza a 260 e 280 nanometri.

L'ultimo passo nella generazione di librerie di sequenze di giunzione sinistra e destra consiste nell'analizzare le variazioni di lunghezza dell'amplicone PCR eseguendo l'elettroforesi capillare. Questo risultato rappresentativo mostra lunghezze variabili di ampliconi PCR nei siti di integrazione del vettore lentivirale sia per le giunzioni ospite del vettore a monte che a valle. Il marcatore della dimensione del DNA si trova nella corsia M.

Dopo il sequenziamento degli ampliconi PCR, l'analisi della sequenza del sito di integrazione computazionale viene eseguita utilizzando uno script di programmazione interno. Il saggio del sito di integrazione bidirezionale genera diverse dimensioni di ampliconi PCR sia per le giunzioni host vettoriali a monte che a valle visualizzate mediante elettroforesi capillare. Un confronto tra le ripetizioni percentuali dei geni Alu e L1 di vettori lentivirali in cellule di topo umanizzate che ripopolano all'interno di eventi di integrazione casuali generati da silico ha rivelato che i siti di integrazione sono significativamente arricchiti nei geni.

Le frequenze di rivelazione relative degli integromi vettori sono state calcolate utilizzando solo i conteggi delle sequenze delle giunzioni dei siti di integrazione che generano ampliconi PCR inferiori a 500 bp. Circa il 77% dei vettori potrebbe essere analizzato quantitativamente con l'approccio bidirezionale. Nella strategia per la quantificazione clonale si presume che ogni singolo clone condivida lo stesso integroma vettore.

Le frequenze relative delle giunzioni sinistra e destra sono combinate per rappresentare le quantità relative delle popolazioni clonali, o QVI. Questa combinazione di colori mostra le frequenze relative di 44 cloni QVI in cellule di ripopolamento di topi umanizzati. Sulla base dell'analisi di integrazione casuale in silico 10.000, ci si aspetta una sovrastima di 1,25 volte delle frequenze clonali quando si utilizzano enzimi motivo GTAC e una sovrastima di 2,56 quando si utilizza un enzima motivo TCGA.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere divisa in parti e completata in due giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare che le fasi della PCR sono estremamente sensibili e che è necessario prendere precauzioni per evitare qualsiasi contaminazione. Questa tecnica ha aperto la strada all'esame della sicurezza dei vettori retrovirali terapeutici e all'esplorazione di modelli di ripopolamento a lungo termine di cloni di cellule staminali emopoietiche dopo il trapianto nei macachi rhesus.