L'espansione e l'adipogenesi dell'induzione di progenitori adipociti da tessuto adiposo perivascolare isolati da cellule magnetiche attivate

Gli obiettivi generali di questi protocolli di isolamento e differenziamento sono ottenere cellule progenitrici degli adipociti da tessuti adiposi perivascolari e indurre la loro differenziazione in adipociti maturi. Questo metodo consente l'analisi di popolazioni specifiche e definite di cellule progenitrici adipocitarie dal tessuto adiposo perivascolare, con un impatto minimo sulla loro morfologia, vitalità e potenziale di proliferazione e differenziazione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente un maggiore isolamento delle cellule presentanti l'antigene per grammo di tessuto adiposo, rispetto alla selezione cellulare attivata dalla fluorescenza.

Dopo aver confermato la mancanza di risposta al pizzicamento delle dita, praticare un'incisione verticale della linea mediana lungo lo sterno fino all'area perineale del ratto, per accedere alla cavità addominale. Esporre l'arteria mesenterica superiore, i piccoli vasi di resistenza mesenterica e l'aorta toracica e recidere tutte le connessioni con il mesentere e l'aorta. Raccogliere il tessuto adiposo gonadico e trasferire i cuscinetti adiposi isolati in un nuovo contenitore di tampone bicarbonato Krebs-Ringer, o soluzione KRBB, integrato con cumuli di 10 millimolari.

Trasferire i recipienti in una capsula di Petri contenente una soluzione di KRBB e posizionare la piastra sotto un microscopio da dissezione. Rimuovere il tessuto adiposo perivascolare dai piccoli vasi di resistenza mesenterica e dall'aorta. In una cappa di biosicurezza, trasferire circa 50 milligrammi di tessuto in una provetta da 1,7 millilitri contenente 1 millilitro di soluzione di collagenasi di tipo I e tritare il tessuto in pezzi da 1 a 3 millimetri.

È importante tritare adeguatamente il tessuto adiposo per consentire alla collagenasi di infiltrarsi completamente nel tessuto connettivo. Incubare i frammenti a 37 gradi Celsius agitando per 1 ora. Quindi filtrare in sequenza il materiale digerito attraverso singoli filtri cellulari da 100 e 40 micron in una provetta da 50 millilitri.

Raccogliere il filtrato risultante mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 1 millilitro di tampone di lisi eritrocitaria. Trasferire la sospensione cellulare in una nuova provetta Microfuge da 1,7 millilitri per un'incubazione di 5 minuti a temperatura ambiente, al riparo dalla luce. Quindi raccogliere le cellule della frazione vascolare stromale con un'altra centrifugazione e risospendere il pellet nel terreno basale della frazione vascolare stromale per il conteggio.

Per isolare le cellule progenitrici degli adipociti mediante smistamento cellulare attivato magneticamente, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in un tampone di blocco dello smistamento cellulare attivato magneticamente a una concentrazione di 1 volte 10 al 6 ° cellule per millilitro per un'incubazione di 20 minuti a 4 gradi Celsius. È essenziale che tutte le fasi dell'isolamento vengano eseguite a 4 gradi Celsius e non sul ghiaccio. Successivamente, incubare le cellule con 5 microlitri di topo coniugato FITC-anti-CD34 per 30 minuti.

Raccogliere le cellule mediante centrifugazione. Quindi incubare le cellule con 4 microlitri di microsfere anti-FITC in 96 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato magneticamente per 5 minuti al buio. Mentre le cellule sono in incubazione, posizionare una colonna multi-sort nel separatore magnetico con un tubo di scarico da 5 millilitri sotto la colonna.

Sciacquare la colonna con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato magneticamente e gettare l'effluente e il tubo di scarico. Quindi posizionare una nuova provetta sotto la colonna e caricare le cellule sulla parte superiore della colonna, raccogliendo le cellule CD34 negative non etichettate nella nuova provetta di raccolta. Quando tutte le cellule sono passate attraverso la parte superiore della colonna, lavare la colonna 3 volte con 500 microlitri di tampone di selezione cellulare degassato attivato magneticamente, continuando a raccogliere l'eluato nella provetta di raccolta.

Dopo l'ultimo lavaggio, trasferire la colonna in una nuova provetta di raccolta e utilizzare lo stantuffo della colonna per far scorrere 1 millilitro di tampone di selezione cellulare attivato magneticamente attraverso la colonna nella provetta, per raccogliere le cellule CD34 positive. Raccogliere le cellule progenitrici degli adipociti mediante centrifugazione. Quindi incubare la frazione CD34 positiva in 10 microlitri di recettore alfa del fattore di crescita derivato da piastrine di coniglio per 30 minuti.

Al termine dell'incubazione, centrifugare nuovamente le cellule e incubare il pellet in 4 microlitri di microsfere IgG anti-coniglio in 96 microlitri di tampone di selezione cellulare attivato magneticamente per l'isolamento da biglie magnetiche delle cellule alfa positive del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine, come appena dimostrato. Per coltivare le cellule progenitrici degli adipociti alfa positive del recettore del fattore di crescita derivato dalle piastrine CD34, seminare le cellule in singole piastre di coltura tissutale a 6 pozzetti in terreno basale e posizionare le piastre in un incubatore per colture cellulari a 37 gradi Celsius e anidride carbonica al 5%. Dopo 3 passaggi seriali, seminare le cellule in piastre nere di coltura tissutale a 96 pozzetti a 1 x 10 per 2 cellule per pozzetto e valutare la loro proliferazione a 8, 24, 48 e 96 ore a 5 volte 10 per 4 cellule per pozzetto, in piastre di saggio a 24 pozzetti, secondo i protocolli standard di saggio di proliferazione.

Per indurre l'adipogenesi, quando la coltura cellulare progenitrice degli adipociti raggiunge la confluenza, nutrire le cellule con terreno basale progenitore degli adipociti per 48 ore, quindi trattare le colture con la proteina morfogenica ossea 4 per altre 48 ore. Il terzo giorno, sostituire il terreno con un terreno di induzione delle cellule progenitrici degli adipociti, senza IBMX ed esametasone per 14 giorni. Il grado di adipogenesi nelle colture può quindi essere valutato da 1 a 10 al 4° cellula per pozzetto in piastre di coltura tissutale a 48 pozzetti, secondo i protocolli standard di analisi dell'adipogenesi.

Sebbene entrambi i metodi dimostrino una distribuzione e una vitalità simili della popolazione cellulare, l'isolamento dello smistamento cellulare attivato da magneti produce un numero maggiore di cellule per la coltura, rispetto allo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza. In questo esperimento rappresentativo, la proliferazione in vitro della frazione vascolare stromale selezionata con cellule attivate magneticamente e delle cellule progenitrici degli adipociti, isolate dall'aorta toracica, dai piccoli vasi di resistenza mesenterica e dal tessuto adiposo gonadico di ratti maschi, è stata valutata a 8, 24, 48 e 96 ore dopo la piastra, utilizzando un saggio quantitativo del DNA. Non sono state osservate differenze di sito nei tassi di espansione della frazione vascolare stromale in nessun momento, ad eccezione delle cellule progenitrici degli adipociti dell'aorta toracica, che hanno dimostrato una minore proliferazione entro 96 ore, rispetto alle cellule vascolari stromali dello stesso sito.

La stimolazione delle cellule progenitrici degli adipociti confluenti con la proteina morfogenica ossea 4 per 48 ore induce il differenziamento degli adipociti, evidenziato da un maggiore accumulo di lipidi nelle goccioline, come valutato sia dal saggio di assorbimento dei lipidi fluorescente, sia dalla colorazione Oil Red O. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 8 ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere temperature di 4 gradi Celsius durante le fasi di isolamento.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come isolare e differenziare le cellule progenitrici degli adipociti.