Monitoraggio del rilascio di Calcio di ER / SR con la Targeted Ca ²⁺ Sensore CatchER ⁺

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di mostrare i nostri protocolli per la coltura e la trasfezione di cellule HEK293 e C2C12 con CatchER plus e la sua applicazione per il monitoraggio dei transienti di calcio mediati dal recettore ERSR nella misura di NC2KD. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella segnalazione del calcio e nell'imaging, come la concentrazione basale di calcio e le sue rapide variazioni nell'ERSR di cellule definite e come applicare il biosensore CatchER plus per queste misurazioni. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la risposta alla fluorescenza delle singole cellule può essere registrata in tempo reale con una cinetica rapida.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla diagnosi delle malattie correlate al calcio ERSR perché CatchER plus è in grado di monitorare i transitori anomali del calcio in questi organelli che derivano da elementi di segnalazione del calcio disfunzionali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto le fasi di trasfezione cellulare e imaging a fluorescenza sono difficili da apprendere perché la coltura cellulare e la microscopia presentano più aree di errore. A dimostrare la procedura sarà Florence Reddish, post-doc del nostro laboratorio.

Per iniziare questo esperimento, seminare le cellule HEK293 sui vetrini del microscopio sterilizzato nei piatti da sei centimetri e coltivarle per uno o due giorni fino a quando non sono confluenti per circa il 70% il giorno della trasfezione. Successivamente, svuotare il DMEM dal piatto e aggiungere tre millilitri del siero ridotto. Quindi, aggiungere la miscela di reagenti per trasfezione del DNA alla piastra e incubare per quattro-sei ore a 37 gradi Celsius.

La trasfezione delle cellule HEK293 è generalmente più semplice rispetto ad altre linee cellulari, ma le cellule sono meno resistenti alle condizioni difficili. Pertanto, è fondamentale esporli ai reagenti di trasfezione solo per quattro o sei ore per evitare l'apoptosi. Dopo quattro-sei ore, lavare le celle con cinque-sei millilitri di HBSS.

Scartare l'HBSS dal piatto e sostituirlo con tre millilitri di DMEM fresco. Successivamente, incubare le cellule per 48 ore a 37 gradi Celsius per consentire l'espressione di GECI. Per le cellule mioblastiche C2C12, tripsinizzare le cellule aggiungendo uno o due millilitri di tripsina per coprire il fondo del piatto.

Quindi, metti il piatto in un'incubatrice a 37 gradi Celsius per due o sei minuti per consentire alla tripsina di allentare le cellule dal fondo del piatto. Una volta completata l'incubazione, rimuovere la tripsina e aspirare le cellule in otto millilitri di DMEM. Pipettare accuratamente le cellule con DMEM per disperderle e risospenderle uniformemente.

Quindi, seminarli sui vetrini coprioggetti sterili in piastre di coltura di sei centimetri e quindi aggiungere tre millilitri di DMEM per ottenere una confluenza finale del 60%Successivamente, trasfettare le cellule lo stesso giorno. Incubarli per 24 ore a 37 gradi Celsius. Dopo l'incubazione, lavare le cellule con cinque o sei millilitri di HBSS.

Scartare l'HBSS dal piatto e sostituirlo con tre millilitri di DMEM fresco. Quindi, incubarli a 37 gradi Celsius per 48 ore per consentire l'espressione del GECI. In questa procedura, accendere il microscopio e la sorgente luminosa, quindi aprire il semplice programma PCI.

Utilizzando un batuffolo di cotone, coprire il fondo della camera di imaging a bagno a diamante aperto a basso profilo con un sottile strato di sigillante. Quindi, estrarre dall'incubatrice un vetrino contenente le cellule trasfettate e sciacquarlo delicatamente tre volte con circa un millilitro di tampone di Ringer con 10 millimolari di glucosio e 1,8 millimolari di calcio preriscaldati a 37 gradi Celsius. Lasciare circa un millilitro di tampone di Ringer nel piatto per evitare che le cellule si secchino e utilizzare una pinza per estrarre il vetrino dal piatto.

Assorbire la soluzione in eccesso toccando il bordo del vetrino con un fazzoletto di laboratorio. Quindi, posizionarlo sul lato della camera con le celle rivolte verso il grasso. Successivamente, fissare la camera sul supporto del palco utilizzando un cacciavite.

Aggiungere circa un millilitro di tampone di Ringer alla camera per evitare che le cellule si asciughino durante il montaggio sul tavolino e il completamento della configurazione del microscopio. Passare dall'obiettivo del microscopio all'obiettivo a immersione in olio 40x. Aggiungere una goccia di olio da immersione all'obiettivo.

Successivamente, posizionare la montatura sul tavolino del microscopio. Quindi, posizionare la punta del vuoto nella camera per mantenere la soluzione livellata ed evitare che si riempia eccessivamente. Quindi, sollevare l'obiettivo utilizzando la regolazione della rotta fino a quando l'olio sull'obiettivo tocca la parte inferiore del carrello.

Utilizzando la modalità campo chiaro, regolare il guadagno su 175 e il tempo di esposizione su 0,03 secondi per mettere a fuoco le celle. Una volta che le cellule sono messe a fuoco, passa alla modalità di fluorescenza utilizzando l'eccitazione a 488 nanometri e modifica il tempo di esposizione a 0,07 secondi. Individua un campo visivo che abbia un numero sufficiente di cellule sane con una fluorescenza adeguata per l'imaging.

Quindi, scatta foto in modalità fluorescenza e campo chiaro. Cerchia una regione di interesse nelle celle o circonda l'intera cella per registrare l'intensità dall'area scelta. Ora, avvia la misurazione dell'intensità con il frame rate impostato su uno ogni cinque secondi.

Lasciate che l'intensità della linea di base si stabilizzi per 20-30 fotogrammi. Successivamente, calcolare la quantità di 4-CMC necessaria da un ceppo di 20 millimolari in base al volume finale della camera di 450 microlitri per ottenere una concentrazione finale di 200 micromolari. Quindi, trasferire con cura 60 microlitri di tampone Ringer dalla camera a una provetta da microcentrifuga.

Diluire la quantità calcolata di 4-CMC con questa soluzione e aggiungerla nuovamente alla camera per evocare la risposta prevista dalle cellule oggetto dell'immagine. Lasciare che il farmaco si leghi al recettore e la successiva diminuzione del segnale. Quindi, lavare le cellule con da tre a sei millilitri di tampone di Ringer e contemporaneamente aggiungere il marcatore di evento.

Ripetere le procedure per 100 ATP micromolari e 15 CPA micromolari utilizzando un nuovo vetrino delle cellule trasfettate per ogni test. Una volta completata la misurazione, terminare la raccolta dei dati nella finestra di misurazione dell'intensità nel semplice programma PCI. Successivamente, scattare le immagini a fluorescenza e in campo chiaro delle cellule.

Quindi, apri il file di dati per l'esperimento. Cerchia nuovamente le celle o le regioni di interesse per ricalcolare i valori di intensità, se necessario. Per determinare le cellule dei mioblasti NC2KD e C2C12, ripetere la procedura di trasfezione e aggiungere un millilitro di tampone di Ringer privo di calcio nella camera.

Permeabilizzare le cellule con saponina dallo 0,002 allo 0,005% e tampone intracellulare per 15-30 secondi per svuotare le cellule da qualsiasi CatchER plus che potrebbe essere nel citosol. Quindi, lavare le cellule con tre-sei millilitri di tampone KCL contenente EGTA e 10 micromolari di ionomicina. Lasciare che l'intensità diminuisca fino a raggiungere un plateau.

Successivamente, sciacquare le cellule con 3-6 millilitri di tampone KCL con 10 micromolari di ionomicina e lasciare che l'intensità si stabilizzi. Successivamente, aggiungi diverse soluzioni di calcio per consentire all'intensità di raggiungere un plateau tra ogni aggiunta. Per calibrare il sensore per la quantificazione della concentrazione basale di calcio, utilizzare EGTA e tampone di calcio da 100 millimolari per ottenere l'intensità di fluorescenza minima e massima.

Di seguito sono mostrati i tratti rappresentativi dell'intensità normalizzata raccolta dalle cellule permeabilizzate dei mioblasti C2C12 trasfettate con CatchER plus. Le cellule sono state permeabilizzate con saponina allo 0,005% nel tampone intracellulare per 15-30 secondi. Le soluzioni di EGTA e calcio sono state preparate in tampone KCL e N si riferisce al numero di cellule visualizzate.

Queste immagini a fluorescenza sono i rappresentanti delle cellule prima e dopo il trattamento. 0,2, 0,6, due, cinque, 10, 20, 50 e 100 millimolari di calcio sono stati aggiunti alle cellule permeabilizzate dei mioblasti C2C12 in presenza di 10 micromolari di ionomicina per ottenere una KD di 3,1 più o meno 1,4 millimolare. Questa figura mostra una misurazione rappresentativa dell'intensità di CatchER più cellule trasfettate a valori minimi e massimi dopo l'aggiunta di un EGTA millimolare e 100 millimolari di calcio con 10 micromolari di ionomicina ciascuno.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30-60 minuti per l'imaging o in tre giorni se si include la trasfezione. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di maneggiare sempre le cellule in un ambiente sterile, di preparare i reagenti prima dell'esperimento, di applicare uno strato uniforme di grasso sulla camera e di avere il vuoto attaccato prima di iniziare. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come il western blot per rispondere a domande aggiuntive come il livello di espressione di CatchER plus.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della segnalazione e dell'imaging del calcio per esplorare le dinamiche del calcio ERSR nelle cellule di mammifero. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare le cellule e visualizzarle utilizzando CatchER plus.